Tecnologia de DNA Recombinante

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<p>Tecnologia de DNA</p><p>Recombinante</p><p>Prof. Rodrigo Barbosa de Oliveira Brito</p><p>rodrigobrito@uni9.pro.br</p><p>Tecnologia do DNA recombinante</p><p>Tecnologia do DNA Recombinante é um conjunto de técnicas que</p><p>permite aos cientistas identificar, isolar e multiplicar genes de</p><p>quaisquer organismo.</p><p>• Junção (não natural) de DNA proveniente de duas fontes diferentes.</p><p>História</p><p>• Estrutura do DNA – Watson & Crick (1953).</p><p>• Descoberta de enzimas bacterianas, purificada e utilizadas in vitro</p><p>para corta o DNA de forma específica. (enzimas de restrição) 1972.</p><p>• Tecnologia do DNA recombinante (insulina recombinante), prémio</p><p>Nobel de Fisiologia e Medicina em 1978.</p><p>Ferramentas de clonagem</p><p>Extrair o DNA humano para obtenção do gene de</p><p>interesse</p><p>Enzimas de restrição</p><p>A técnica do DNA recombinante, utiliza-se das enzimas de restrição ou</p><p>endonucleases, moléculas originárias de bactérias que atuam como</p><p>tesouras moleculares permitindo a manipulação de genes.</p><p>• Nas bactérias, estas enzimas de restrição</p><p>são parte de seus maquinários de proteção</p><p>contra infecção por vírus.</p><p>• São enzimas que atuam como tesoura</p><p>química cortando DNA em sequências</p><p>específicas.</p><p>Enzimas de restrição circundam a molécula de DNA no ponto a</p><p>ser digerido, cortando-a em locais específicos.</p><p>ENZIMAS: fundamental para a</p><p>tecnologia do DNA recombinante.</p><p>•Endonucleases de restrição: apresentam papel fundamental,</p><p>clivando o DNA em sequências específicas, gerando um conjunto de</p><p>fragmentos menores.</p><p>•DNA ligase: os fragmentos separados para serem clonados podem</p><p>ser unidos a um vetor de clonagem apropriado usando a DNA ligase.</p><p>Utilizando as enzimas de restrição bacterianas, tornou-se possível</p><p>cortar o DNA.</p><p>Após os corte, os seguimentos de DNA podem ser unidos pela ação da</p><p>enzima DNAligase.</p><p>Nomenclatura das enzimas de</p><p>restrição</p><p>Nome da enzima é a abreviação do nome da espécie bacteriana do</p><p>qual foi isolada.</p><p>• 1º letra: Maiúscula e representa o gênero</p><p>• Duas outras letras: representam a espécie</p><p>• Outras letres indicam a linhagem ou cepa bacteriana</p><p>• Algarismo romanos indicam a ordem da descoberta</p><p>cepa</p><p>Nomenclatura das enzimas de</p><p>restrição</p><p>Corte das cadeias de DNA</p><p>As enzimas de restrição cortam o DNA através da quebra da ligação</p><p>fosfodiéster dos nucleotídeo da mesma cadeia.</p><p>• Enzimas que produzem fragmentos com extremidades simétricas ou</p><p>rombas. Onde o DNA é cortado em posições opostas um à outra.</p><p>Corte das cadeias de DNA</p><p>• Enzimas que cortam as extremidade de DNA de forma coesivas, onde</p><p>os cortes se encontram deslocados um em relação ao outro.</p><p>Corte das cadeias de DNA</p><p>• As extremidades coesivas são complementares, possuem a</p><p>capacidade de reasassociarem especificamente entre si.</p><p>• A capacidade de ligases unirem fragmentos com extremidades</p><p>rombas ou coesivas, é vital ao métodos do DNA recombinante.</p><p>Tipos de enzima de restrição</p><p>• Tipo 1: reconhece específicas sequências de DNA, porém cortam em</p><p>locais que podem estar a 1000 pb de distância do sítio de</p><p>reconhecimento da enzima.</p><p>• Ex:</p><p>EcoAI: GAGNNNNGTCA</p><p>EcoKI: AACNNNNNNGTGC</p><p>SySPI: AACNNNNNNGTRC</p><p>Tipos de enzima de restrição</p><p>• Tipo II: que reconhece e corta diretamente dentro do sítio de</p><p>reconhecimento.</p><p>As enzimas do tipo II, proporcionam as ferramentas necessárias para aplicar</p><p>na manipulação do DNA, possibilitando a produção de fragmentos com</p><p>tamanhos consistentes para a clonagem.</p><p>• Ex</p><p>• EcoRI G/AATTC</p><p>• BaII TGG/CCA</p><p>• Pstl CTGCA/G</p><p>Tipos de enzima de restrição</p><p>• Tipo III: promove corte no DNA de 24-26 pb.</p><p>• EX:</p><p>• EcoP151 CAGCAG</p><p>• EcoPI AGACC</p><p>• HinfIII CGAAT</p><p>• Cortes que produzem extremos rombas</p><p>• Cortes que produzem extremos coesivos.</p><p>Enzimas de restrição, recorta a região do</p><p>gene de interesse e do vetor (plasmídeo).</p><p>A enzima de restrição realiza</p><p>cortes coesivos no DNA de</p><p>interesse e no DNA plasmidial e</p><p>a enzima DNAligase liga os</p><p>fragmentos de DNA no</p><p>plasmídeo.</p><p>Ligase</p><p>• As DNA ligase são amplamente empregadas em métodos de</p><p>manipulação genética, para a ligação de fragmentos de DNA em</p><p>dupla-fita.</p><p>• Por exemplo: aqueles gerados pela digestão com endonucleases de</p><p>restrição.</p><p>• Estás catalizama formação de ligações fosfodiéster entre o</p><p>grupamento 5’fosfato livre em uma extremidade de uma molécula e o</p><p>grupamento 3’ hidroxila livre de outra ou da mesma molécula de</p><p>DNA.</p><p>Plasmídeo (vetor de clonagem)</p><p>• São elementos extracromossômicos circulares que se replicam de</p><p>forma autônoma na célula bacteriana.</p><p>• Sequência de DNA que permite a replicação do vector na célula</p><p>hospedeira;</p><p>• Possui vários locais de ligação para enzimas de restrição, os quais</p><p>cortam sequências de DNA.</p><p>• Contem gene que codifica uma substância que possa distinguir uma</p><p>célula transformada de uma não transformada.</p><p>• Carregam genes para resistência a antibióticos.</p><p>O plasmídeo deve ser cortado pela mesma enzima de restrição que</p><p>corta o gene de interesse.</p><p>O plasmídeo cortado é misturado com</p><p>os fragmentos de DNA (contendo o</p><p>gene) e a enzima DNAligase que “cola”</p><p>os fragmentos de DNA ao plasmídeo.</p><p>Utilização do vetor. (Plasmídeos)</p><p>Os plasmídeos são pequenas moléculas de DNA de cadeia dupla, que</p><p>contêm os elementos necessários à sua replicação e um gene que</p><p>confere resistência a um antibiótico, permitindo que a célula</p><p>hospedeira cresça em meio seletivo.</p><p>Célula Hospedeira</p><p>Escherichia coli</p><p>• Cresce rapidamente a</p><p>37°c;</p><p>• Clico de 20 min</p><p>• Pouco exigente quanto a</p><p>nutrição.</p><p>As células são preparadas com solução aquosa para se tornarem</p><p>competentes e então são submetidas a alta voltagem (choque elétrico) que</p><p>provoca uma desestabilização da membrana externa e a formação de poros,</p><p>possibilitando a entrada do DNA para o interior da célula.</p><p>Inserção do DNA dentro da</p><p>células bacteriana</p><p>Inserir o plasmídeo na bactéria hospedeira</p><p>Após a inserção do plasmídeo na bactéria hospedeira, os</p><p>microrganismos são colocados em um meio nutritivo seletivo, apenas</p><p>aquelas que possuem o DNA recombinante crescem, formando</p><p>colônias.</p><p>Método para seleção dos organismos</p><p>Os plasmídeos possuem um gene (lacZ) que codifica a produção da</p><p>enzima B-galactosidase. A inserção do DNA estranho no sítio de</p><p>clonagem do plasmídeo causa a interrupção do gene, levando à perda</p><p>da função da Beta-galactosidase.</p><p>Como resultados:</p><p>• Colônias brancas (beta-galoctosidase inativa) positivas (com inserto)</p><p>• Colônias azuis (beta-galoctosidase ativa) negativas (sem inserto)</p><p>Resumo!!</p><p>Atividades:</p><p>1) Qual o tipo de enzima de restrição mais aplicado para a clonagem?</p><p>2) Qual a vantagem de promover o corte de forma coesiva?</p><p>3) Qual a origem das endonucleases?</p><p>4) Qual a importância do vetor para o processo de clonagem?</p><p>5) Diferencie vetor de hospedeiro.</p><p>6) Qual enzima promove a ligação do vetor com o fragmento de DNA?</p><p>7) Qual a ligação que contribui para as fitas coesivas se associarem entre si</p><p>de forma natural?</p><p>8) Como se faz a seleção da bactéria que possui o inserto?</p><p>9) Como o plasmídeo é introduzido dentro da célula hospedeira?</p><p>Um estudante de biomedicina resolveu realizar o seu TCC de forma</p><p>experimental, promovendo a clonagem da telomerase humana pelas</p><p>bactérias Escherichia coli. Foi utilizado enzimas de restrição para</p><p>promover o corte do DNA.</p><p>GCTTCTCCGAAGACTGGATGACTGCCATGGAGGAGTCACAGTCGGATATCAG</p><p>CCTCGAGCTCCGAATTCCTCTGAGCCAGGAGACATTTTCAGGCTTATGGAAAC</p><p>TACTTCCTCCAGAAGATATCCTGCCATCGAATTCACCTCACTGCATGGACGATC</p><p>TGTTGCTGCCCCAGGATGTTGAGGAGTTTTTTGAAGGCCCAAGTGAAG</p><p>Qual enzima de restrição foi utilizado?</p><p>Quantos fragmentos de DNA foram formados pelos cortes das enzimas</p><p>de restrição?</p>