Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos

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Testes de Sensibilidade aos Antimicrobianos 
quarta-feira, 12 de abril de 2023 14:05 
Testes de sensibilidade aos antimicrobianos visam um método laboratorial com um critério definido
para definir se a bactéria é sensível ao antimicrobiano. Para definir o método é preciso levar em
consideração qual a bactéria, o sítio de infecção, e quais os antimicrobianos padronizados para esta
infecção. 
 
Existem metodologia quantitativas (micro e macro diluição em caldo, ágar diluição, Etest
e automatizadas) e qualitativas (disco difusão - Kirby-Bauer, e automatizadas) 
 
● Quantitativas – baseados na diluição do antimicrobiano e quantidade fixa da bactéria 
→ Macrodiluição: método simples, com desvantagem que precisa de grande número de tubos e grande
volume de bactérias e antibacterianos. Pega-se e o meio de cultura com concentração crescente do
antimicrobiano a ser testado e coloca-se uma quantidade fixa da bacteria. É feita uma diluição seriada
do antibacteriano e inoculação de uma quantidade fixa de bactéria em cada tubo, é feita incubação
(geralmente a 35°C) por tempo adequado, e se analisa a turvação do meio. A menor concentração onde
não se observa crescimento bacteriano indica a concentração inibitória mínima (MIC), por exemplo,
tubo com 16 microg/mL. 
→ Microdiluição: mesma técnica da macrodiluição porém mais prática pois se utiliza uma microplaca e
se observa o sedimento bacteriano no fundo e não a turvação do meio. A leitura deve ser feita a olho
nu, pois é desta forma que o teste foi padronizado, caso se utilize um espectrofotômetro por exemplo
pode haver um resultado falso. Neste caso, a concentração inibitória minima da segunda coluna é a
concentração de 32 ug 
 
→ Ágar diluição: não é muito utilizada na rotina clínica mas é boa para triagem epidemiológica e não
muito utilizada na rotina laboratorial. Ao se preparar a placa com ágar adiciona diferentes
concentrações de antimicrobiano ao meio. Inocula uma concentração conhecida da bactéria ao meio,
deposito 10 microL na placa e observa-se a qual foi a menor concentração em que não houve o
É
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crescimento bacteriano. É possível fazer várias bactérias diferentes em uma mesma placa (cada ponto
é uma bactéria diferente) 
NESTE exemplo, temos uma placa com 0,25 ug do antibiótico e outra com 0,5 ug do antibiótico. Aplica-
se a suspensão antimicrobiana nestas concentrações citadas, em cada pontinho (bactéria), sendo que
aplica-se varias bacterias diferentes em uma mesma placa. Por fim, compara-se a posição da bactéria
nas duas placas. Observa-se, que o 2 ponto de aplicação cresceu na 1 paca de 0,25 ug, mas não creceu
na placa de 0,5 ug. Logo, infere-se que esta bactéria em questão, possui concentração inibitória
(CIM) minima de 0,5 ug do antiobiotico 
→ Etest: método mais prático. Utiliza uma tira plástica com quantidades decrescentes
do antimicrobiano, e através do halo de inibição é determinado a CIM, no ponto onde o halo
se encontra. Evitar erros de falsa sensibilidade - colocar CIM menor do que deveria ser, por exemplo. 
Onde o antimicrobiano é mais concentrado, o HALO de inibição é maior. Já quando a contração do
antimicrobiano vai diminuindo, o HALO de inibição é menor até onde encontra-se a fita. Onde ele
encontra a fita, é a CIM. Por exemplo, se este halo tenha terminado em 2 ug. Ml-1, está será a CIM 
● Qualitativos 
→ Métodos automatizados: podem ser qualitativos ou quantitativos (fornece CIM). Também são
baseados em diluições do antimicrobiano, e o equipamento realiza a inoculação da bactéria, e realiza
uma análise cinética do crescimento bacteriano. Precisa de menor tempo de incubação e desta forma o
resultado sai mais rápido. 
**a rápidez do metodo é o seu limitante, pois se a incubação for menor, pode gerar falsa sensibilidade.
Bactéria cresce menos, tendo um menor halo de inoculação, apresentando-se mais sensível ao
antimicrobiano. Podendo gerar falha no tratamento, uma vez que, vai se usar um antibiótico com maior
espéctro (+caro e com maior efeitos adversos), podendo gerar resistência a bactéria. 
 
→ Disco difusão - Kirby-Bauer: discos com quantidade fixa de antimicrobiano, são colocados em uma
placa inoculada com a bactéria igualmente distribuída, forma-se halos de inibição; mede-se o
diâmetro do halo e compara com tabelas de ponto de corte para saber se a bactéria é sensível ou
resistente àquele antimicrobiano. 
 
→ Quando realizar o TSA? 
Quando tenho o método padronizado e os pontos de corte para aquela infecção específica. Sempre
quando não tenho como prever o padrão de sensibilidade da bactéria. O TSA é realizado para bactérias
que já possuem um método de TSA padronizado e há pontos de corte para os antimicrobianos utilizados
para o tratamento desta bactéria específica . Também é realizado quando não é possível prever a
sensibilidade da bactéria (fenótipo predizivel), casos onde a resistência da bactéria a determinado
antimicrobiano já é conhecida não é necessário realizar o TSA (fenótipo esperado). Resistência
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intrínseca não realiza TSA, já resistência adquirida (mutações, transferência horizontal) deve realizar
TSA. 
--> COMO SELECIONAR OS ANTIMICROBIANOS ? 
Existem consensos que determinam os pontos de corte para antimicrobianos como o CLSI, Eucast e
BrCAST. O BrCAST é um consenso brasileiro que determina os critérios nacionais de TSA, sendo
totalmente gratuito. 
 
→ Área de incerteza técnica (AIT): são certas concentrações que possuem uma variabilidade da técnica
que não permite chegar a uma conclusão final de que a bactéria será sensível a um determinado
antimicrobiano. 
→ Sensível (S): um MO é considerado sensível quando há uma alta probabilidade de sucesso terapêutico
utilizando o regime de dosagem padrão do agente. 
→ Sensível aumentando a exposição (I): Um MO é considerado sensível aumentando a exposição
quando há uma alta probabilidade de sucesso terapêutico porque a exposição foi aumentada ajustando
o regime de dosagem ou sua concentração no local de infecção. É sensível desde que aumente a
exposição da bactéria ao agente antimicrobiano. 
→ Resistente (R): um MO é considerado resistente quando há alta probabilidade de falha terapêutica
mesmo quando há aumento de exposição. 
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A exposição depende do modo como a dose, via de administração, intervalo entre as doses, distribuição,
metabolismo e excreção do antimicrobiano influenciam o MO no local de infecção. 
 
→ DISCO DIFUSÃO ← 
Baseado na difusão radial do antimicrobiano numa concentração fixa sobre placa semeada com
concentração fixa da bactéria de interesse. 
Falsa sensibilidade: atestar que a bactéria é sensível ao antibiótico o que vai levar a uma falha
terapêutica e até mesmo ao óbito do paciente. Erro gravissímo. 
Falsa resistência: O médico terá que utilizar um antim de maior espectro que geralmente é mais caro e
possui mais efeitos colaterais, ou seja há uma limitação das opções terapêuticas sem necessidade. Erro
grave. 
Etapas 
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1. Preparação e armazenamento dos meios: meio utilizado é o ágar Mueller-Hinton, com ou sem adição
de sangue de cavalo desfibrinado (meio enriquecido).. As placas podem ser compradas prontas ou
serem preparadas no laboratório. Ela deve ter entre 0,4 e 0,5 mm, essa espessura é importante pois um
meio muito fino terá uma concentração relativa de antibióticomuito grande (mais concentrado), o que
pode levar a uma falsa sensibilidade. Já uma placa muito espessa terá menor quantidade de
antimicrobiano o que pode levar a uma falsa resistência. 
 
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2. Preparação do inóculo: o inóculo bacteriano deve ser preparado numa concentração
de aproximadamente 1,5x10^8 UFC/ml (unidades formadoras de colônias); nesta concentração há um
crescimento uniforme e não crescimento de colônias isoladas. Pouca bactéria na placa pode resultar em
falsa sensibilidade e muita bactéria na placa em uma falsa resistência. Para saber se o inóculo está na
concentração correta se utiliza uma escala de turbidez conhecida como escala de McFarland (sulfato de
bário). Pode se usar turbídimetro para medir a turbidez ou pode ser visualizado a olho nu. 
 
 
3. Inoculação das placas: com um swab de algodão mergulhado no inóculo, limpar o excesso nas
paredes do tubo e é feita a semeadura da placa em 3 direções, cobrindo toda a superfície da placa, 
 
4. Aplicação dos discos: discos colocados com uma distância de pelo menos 2 cm de distância para
permitir a observação do halo sem sobreposição. Não demorar mais do que 15 minutos para usar o
inóculo, para que com a replicação bacteriana a concentração de bactérias não sofra muita alteração.
Não demorar mais de 15 minutos para colocar na estufa, para não prejudicar a curva de crescimento
bacteriano. 
5. Incubação: geralmente para bactérias comuns é feita a 35°C +/- 1 em ar ambiente por 16 a 20 horas,
as bactérias que precisam de ágar suplementado com sangue além disso geralmente precisam de uma
estufa com com CO2. Se incubar por menos tempo a bactéria não irá crescer o suficiente causando
uma falsa sensibilidade (maior halo), já se o tempo de incubação for muito grande pode haver falsa
resistência (menor halo). Caso o halo de inibição apareça antes que o tempo de incubação termine, já é
possível atestar que a bactéria é resistente, pois não tem como a bactéria se tornar sensível. A
resistência pode acontecer com menor tempo de incubação, já a sensibilidade não. 
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6. Observação das placas: inicialmente analisar se o teste foi adequado, inóculo foi bem espalhado,
distância dos discos adequada. 
 
7. Aferição e interpretação: Fazer leitura dos halos de inibição com luz incidente sob fundo escuro com
um paquímetro ou uma régua. 
 
Após o tempo determinado de incubação, realizar a leitura através da medição dos halos de inibição,
respeitando os critérios estabelecidos na padronização (colônias satélites, halos duplos, halos
emendados, crescimento insuficiente, etc.). 
- Ler as placas de ágar Mueller-Hinton não suplementadas pelo seu fundo, com luz refletida contra um
fundo escuro com placa posicionada a cerca de 30cm dos olhos. 
Segurar a placa em um ângulo de 45 graus em relação à bancada de trabalho pode facilitar a leitura,
quando as bordas dos halos forem difíceis de definir. 
- Aferir os diâmetros dos halos de inibição em milímetros com uma régua ou paquímetro calibrados. 
- Reportar o resultado de acordo com as tabelas de inferência de resultados (pontos de corte)
estabelecidas pelo BrCAST. 
Colônias que cresceram dentro do halo podem ser uma contaminação da placa por outra bactéria ou
uma subpopulação resistente, para determinar isso analisar as características da colônia, se houver
suspeita de ser uma subpopulação resistente o TSA deve ser refeito. A interpretação do tamanho do
halo, para determinar se a bactéria é sensível ou resistente é feito com as tabelas específicas como o
BrCAST. 
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→ Controle de qualidade: 20 testes, 4 dias e 5 replicatas.