AULA 2 REPLICAÇÃO UFSM

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Replicação do DNA
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A citosina no DNA desamina espontaneamente originando uracila 
Esta reação é potencialmente mutagênica porque a citosina pareia com a guanina, mas a uracila com a adenina 
Na hora da replicação ou transcrição, ocorreria um erro!
Para evitar o erro, existe um sistema de reparo, que substitui a uracila por uma citosina (uracil DNA-glicosidase)
O grupo metila que distingue a timina da uracila é um sinal de reconhecimento; sem este sinal seria impossível distinguir a uracila corretamente presente da uracila resultante da desaminação da citosina.
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A modificação mais comum é a metilação 
Também o RNA tem muitas bases modificadas
As bases modificadas pareiam da mesma forma que as bases originais
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Organismo . 
Número de pares de bases (kb)
Contorno (m)
Virus: Polioma, V40 Bacteriófago  Bacteriófagos T2, T4, T6
. 5,1 48,6 166
. 1,7 17 55
Bactérias: Mycoplasma hominis Eschericchia coli
. 760 4.000
. 260 1.360
Eucariotos (em número haplóide de cromossomos): Levedura Drosófila Humanos Peixe pulmonado
.. . 13.500 165.000 2.900.000 102.000.000
. . 4.600 56.000 990.000 34.700.000
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A hidrólise básica depende de uma desprotonização do grupo 2'-OH da ribose, com formação de um composto cíclico intermediário 
A falta da hidroxila 2' na deoxirribose torna o DNA muito mais resistente à hidrólise em meio aquoso
Este é o provável motivo pelo qual o DNA e não o RNA evoluiu como arquivo genético celular
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Replicação do DNA
O mecanismo de replicação está baseado no pareamento das bases da dupla hélice do DNA.
A estrutura do DNA contém a informação necessária para perpetuar sua sequência de bases
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A replicação do DNA é semi-conservativa
Experimento realizado por Meselson & Stahl em 1958
Cultivo em meio
14NH4Cl
Cultivo em meio
15NH4Cl
Purificação do DNA seguida de centrifugação em gradiente de CsCl
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A replicação semi-conserva-tiva foi provada em experimentos nos quais o DNA de Eschericchia coli foi inicial-mente marcado com 15N, mais pesado; nas gerações sucessoras, cultivadas sem 15N, formaram-se DNAs híbri-dos, que não se formariam se a replicação não fosse semi-conservativa
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Diferenciação auto-radiográfica da replicação unidirecional e bidirecional do DNA 
Após marcação fraca com [3H]timidina, uma suspensão de E. coli recebe um pulso de grande quantidade de [3H]timidina. Alguns segundos após isola-se o DNA para fazer autorradiografia. Espera-se padrões diferentes para cada tipo de replicação
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A replicação é bidirecional
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A replicação do cromossomo circular
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Replicon: Unidade do DNA onde está ocorrendo um evento de replicação
Replicon: 
Origem + Término
Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular
O genoma de uma célula procariótica constitue um único replicon
Cada cromossomo eucariótico constitue vários replicons e todos são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não simultaneamente
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A replicação semi-conservativa se dá a partir de forquilhas de replicação
Auto-radiografias obtidas com [3H]timidina revelam a estrutura  (olho de replicação)
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A replicação é vista como um “olho” flanqueado por DNA não replicado
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O genoma bacteriano circular constitue um único replicon
 A velocidade da forquillha de replicação bacteriana é 50000pb/min
 Um única origem de replicação em E.coli (OriC, 245 pb)
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Origem de Replicação em bactérias: Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação
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O genoma eucariótico constitue vários replicons
 A velocidade da forquillha de replicação eucariótica é 2000pb/min
 Os replicons eucarióticos tem 40-100 kb e são iniciados em tempos diferentes
 Fase S demora ~ 6hrs em uma célula somática
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Forquilha de replicação: Região do DNA onde ocorre a transição do DNA parental fita dupla para as novas fitas filhas duplas
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Fita contínua (líder)
Fita descontínua
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Todas as DNA polimerases operam na direção 5'  3' a partir de um molde antiparalelo
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Polimerases de DNA: As enzimas que sintetizam DNA
 A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos a extremidade 3´OH da cadeia em crescimento. O precursor da síntese é o desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato
 Sentido da síntese sempre é 5’  3’
 A replicação é um processo extremamente fiel. As DNA-polimerases tem atividade revisora
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Desoxiribonucleosídeo 5´trifosfato (precursor)
Fita sendo polimerizada
Fita molde
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As DNA-polimerases sempre requerem um iniciador previamente pareado ao molde que será copiado
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Pareamento de bases
correto
incorreto
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Atividade revisora 3’  5’ garante a fidelidade da replicação
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Modelo da estrutura das DNA-polimerases
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Propriedades das DNA-polimerases Bacterianas
			 Pol I	PolII		PolIII
Polimerização 5’  3’	 + +		 +
Exonuclease 3’  5’ +		 + +
Exonuclease 5’  3’ + - -
Número de subunidades 1 4 10
Tamanho em kDa 103 90	 ~900
Velocidade de 
Polimerização(nt/seg) 16-20 40 250-1000
Processividade	 3-200 1500		 500000
(nt adicionados antes
da dissociação do molde)
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DNA-polimerase III é uma holoenzima de mais de 10 cadeias de estrutura dimérica
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A subunidade Beta da DNA-polimerase III envolve o duplex das fitas-filhas
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Proteínas presentes na origem de Replicação de E.coli
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Todas as DNA polimerases precisam de um grupo 3'-OH para estender a cadeia de DNA
Como, então, se inicia a síntese de DNA?
Uma enzima chamada primase (insensível à rifampicina) sintetiza um PRIMER de RNA tanto na fita lider como nos fragmentos de Okasaki
Uma RNA polimerase pode sintetizar também um primer da fita líder
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Todas as DNA polimerases conhecidas são capazes de estender fitas de DNA apenas na direção 5' 3'
Como, então, se dá a síntese na direção 3' 5' da forquilha de replicação?
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A síntese do DNA é semi-descontínua e requer um iniciador (primer) de RNA
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 Fragmentos de Okasaki ocorrem na fita descontínua
 A DNA polimerase III é responsável pela síntese da maior parte do DNA
 A DNA polimerase I remove o primer de RNA e preenche as lacunas
 A DNA ligase sela as quebras
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A DNA ligase sela as quebras
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Mecanismo de ação da DNA ligase
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Proteínas presentes na forquilha de Replicação de E.coli
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Síntese das fitas contínua e descontínua é independente
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O complexo de replicação
 A proteína DNA B (helicase) é responsável pelo movimento para frente da forquilha 
 Cada core catalítico da DNA PolIII sintetiza uma das fitas-filhas
 O primossomo afasta uma das fitas molde
 Proteínas SSB mantem as fitas parentais separadas
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Os tetrâmeros da proteína DnaA ligam a cada um dos 9 pb repetidos no oriC
Provável sequência de eventos durante a iniciação da replica-ção em E. coli na região oriC
Moléculas adicionais de DnaA ligam para formar uma espécie de nucleossomo
As três regiões de 13 pb ricas em A-T são então "fundidas"
A proteína DnaB separa-se do complexo DnaB-DnaC e entra na região em fusão e a atividade helicase da DnaB mantém a conformação randômica 
A proteína SSB liga para estabilizar as fitas separadas
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Represen-tação do conjunto replissomo em cada forquilha de replicação
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PROTEÍNA
FUNÇÃO
DNA girase
Desespiraliza
o DNA
SSB
Ligação e estabilização da fita simples do DNA
DnaA
Fator de iniciação
HU
Ligação e estabilização do DNA (semelhante a histonas)
PriA
Montagem do primosso, 3'5' helicase 
PriB
Montagem do primossomo
PriC
Montagem do primossomo
DnaB
3'5' helicase (desespiraliza o DNA)
DnaC
Chaperona DnaB
DnaT
Auxilia o DnaC na liberação do DnaB
Primase (iniciase)
Síntese do primer de RNA
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 DNA-polimerases dirigidas por RNA ocorrem em vírus (transcriptase reversa) 
RNA-polimerases dirigidas por RNA ocorrem em vírus e plantas
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A enzima de E. coli é complexa (450 kd)
Ela executa várias funções:
1. Procura por sítios de iniciação (sítios promotores) no DNA
2. Desespiraliza um curto trecho da dupla hélice do DNA para liberar um molde de fita única
3. Seleciona o ribonucleosídeo fosfato correto e catalisa a formação de uma ligação fosfodiester; este processo é repetido muitas vezes à medida que a enzima se move ao longo do DNA
4. Detecta sinais de terminação
5. Interage com ativadores e repressores que modulam a velocidade da transcrição
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A biossíntese de proteínas insere-se no dogma central da biologia molecular
Sede da informação
Processo comprovado
Processo não comprovado
Ácido desoxirribo-nuclêico
Ácido ribonuclêico
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