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CAPÍTULO 4: DNA, CROMOSSOMOS E GENOMA PRIMEIRA DEMONSTRAÇÃO EXPERIMENTAL QUE O DNA É O MATERIAL GENÉTICO: Tal experimento demonstra que foi o DNA que carregava a informação necessária para transformar as células da cepa R em cepa S. ● DNA: ácido desoxirribonucleico, FORMADO POR 2 CADEIAS POLIPEPTÍDICAS E 4 SUBUNIDADES NUCLEOTÍDICAS. ● Ligação de hidrogênio: Ligam os pares de bases. ● Nucleotídeos: Açúcar (5 carbonos) + grupo fosfato + base nitrogenada. ● Bases nitrogenadas: ADENINA, CITOSINA, GUANINA E TIMINA (DNA). ● O DNA é uma estrutura tridimensional (dupla-hélice), uma vez que ocorre para otimizar o empilhamento dos pares de bases, as cadeias principais de açúcar-fosfato se enrolam, formando a dupla-hélice. ● Cada fita de DNA contém uma sequência de nucleotídeos que é exatamente complementar à sequência de nucleotídeos da fita associada, cada fita pode atuar como um molde para a síntese de uma nova fita complementar. ● Ligação fosfodiéster: Ligam os nucleotídeos. ● Os genes contêm as informações necessárias para produzir proteínas. ● Genoma: Conteúdo total de informações de um organismo. O DNA CROMOSSÔMICO E SUA COMPACTAÇÃO NA FIBRA DE CROMATINA: ● Cromossomo: uma única molécula de DNA linear juntamente com proteínas que estão enoveladas e compactadas. ● Cromatina: Complexo que engloba o DNA e as proteínas fortemente associadas (às proteínas que se ligam ao DNA e formam os cromossomos eucarióticos são divididas ● em duas classes: as histonas e as proteínas cromossômicas não histonas). ● Cada núcleo celular humano contém duas cópias de cada cromossomo. ● Os cromossomos carregam os genes que são as unidades funcionais que contém as instruções para a produção de determinadas proteínas. ● As sequências codificadoras são chamadas de éxons; as sequências intercalantes, não codificadoras, são denominadas íntrons. Cada molécula de DNA que forma um cromossomo linear deve conter um centrômero, dois telômeros e origens de replicação: ● Uma molécula de DNA deve ser capaz de replicar, e as cópias replicadas devem ser separadas e fielmente divididas entre as duas células-filhas a cada divisão celular. Esse processo ocorre por meio de uma série de estágios ordenados conhecidos coletivamente como ciclo celular. ● Durante a longa interfase, os genes são expressos e os cromossomos são replicados, e as duas réplicas são mantidas unidas formando um par de cromátides-irmãs. ● Durante a interfase, a célula está transcrevendo ativamente seus genes e sintetizando proteínas. Ainda durante a interfase e antes da divisão celular, o DNA está replicado e cada cromossomo foi duplicado originando duas moléculas- -irmãs de DNA, próximas e emparelhadas (chamadas cromátides-irmãs). Uma vez completada a replicação do DNA, a célula pode entrar na fase M, quando ocorre a mitose e o núcleo é dividido em dois núcleos-filhos. Durante essa etapa, os cromossomos se condensam, o envelope nuclear se fragmenta e o fuso mitótico é formado a partir de microtúbulos e outras proteínas. Os cromossomos mitóticos condensados são capturados pelo fuso mitótico, e um conjunto completo de cromossomos é então puxado para cada extremidade da célula separando os membros de cada par de cromátides-irmãs. Um envelope nuclear se forma em volta de cada conjunto de cromossomos e, na etapa final da fase M, a célula se divide para produzir duas células-filhas. ● A célula passa a maior parte do tempo do ciclo celular na interfase; a fase M é breve em comparação com a interfase, ocupando apenas cerca de 1 hora em diversas células de mamíferos. ● Um tipo de sequência nucleotídica atua como origem de replicação do DNA, o local em que a duplicação do DNA é iniciada. ● As histonas são responsáveis pelo primeiro e mais básico nível de organização cromossômica, o nucleossomo. ● Nucleases: Degrada o DNA clivando-o entre os cernes dos nucleossomos. A heterocromatina é altamente organizada e restringe a expressão gênica: ● Heterocromatina: Altamente condensada. ● Eucromatina: Menos condensada - Onde ocorre boa parte da transcrição. ● Nucléolo: O nucléolo é o local da célula destinado à formação da subunidade ribossômica, bem como o sítio onde muitas outras reações especializadas ocorrem: ele consiste em uma rede de RNAs e proteínas concentradas em torno dos genes de RNA ribossômico. ● A compactação dos cromossomos na mitose é um processo extremamente organizado e dinâmico, que serve a pelo menos dois propósitos. Primeiro, quando a condensação é completada (na metáfase), as cromátides-irmãs estão desemaranhadas umas das outras e dispostas lado a lado. Assim, as cromátides-irmãs podem ser facilmente separadas quando a maquinaria mitótica puxa uma para cada lado. Segundo, a compactação dos cromossomos protege as moléculas de DNA, relativamente frágeis, de quebras no momento da separação entre as células-filhas. ● A condensação dos cromossomos da interfase em cromossomos mitóticos começa no início da fase M e está intimamente relacionada à progressão do ciclo celular. Durante a fase M, a expressão gênica é suspensa, e ocorrem modificações específicas nas histonas que auxiliam na reorganização da cromatina, à medida que esta é compactada. Duas classes de proteínas em forma de anel, chamadas coesinas e condensinas, auxiliam nesse enovelamento. ● Então, a coesina e a condensina ajudam a produzir as duas cromátides. Replicação, reparo e recombinação do DNA: ● Antes da divisão celular, ocorre a replicação do DNA. MECANISMOS DE REPLICAÇÃO DO DNA: ● O uso de um DNA-molde é o processo pelo qual a sequência de nucleotídeos de uma fita é copiada em uma sequência complementar de DNA (Figura 5-2). Esse processo exige a separação da hélice de DNA em duas fitas-molde e implica no reconhecimento, de cada nucleotídeo nas fitas-molde de DNA, por um nucleotídeo complementar livre (não polimerizado). Essa separação expõe os grupos doador e aceptor das ligações de hidrogênio em cada base do DNA, permitindo o pareamento com o nucleotídeo livre a ser incorporado e alinhando-o para a polimerização catalisada pela enzima na nova cadeia de DNA. A primeira enzima que polimeriza nucleotídeos é a DNA-polimerase. ● Durante a replicação do DNA na célula, cada uma das duas fitas originais atua como um molde para a formação de uma fita inteiramente nova. Como cada uma das duas células- -filhas resultantes da divisão celular herda uma nova dupla-hélice de DNA formada por uma fita original e uma fita nova, diz-se que a replicação da dupla-hélice de DNA é produzida de forma “semiconservativa”. ● Uma região de replicação ativa é chamada de forquilha de replicação. Na forquilha de replicação, um complexo multienzimático que contém o DNA-polimerase sintetiza o DNA das duas fitas novas. ● A fita-filha de DNA sintetizada continuamente é denominada fita-líder, ou fita contínua. Sua síntese precede levemente a síntese da fita-filha sintetizada de modo descontínuo, conhecida como fita retardada, ou fita descontínua. Uma enzima especial de polimerização de nucleotídeos sintetiza pequenas moléculas de iniciadores de RNA na fita retardada: ● Na fita-líder, apenas um iniciador é necessário para o início da replicação: uma vez que a forquilha de replicação esteja estabelecida, a DNA-polimerase é continuamente apresentada à extremidade da cadeia com o pareamento ao qual irá adicionar novos nucleotídeos. ● Um mecanismo especial produz uma fita iniciadora complementar necessária à DNA-polimerase. Esse mecanismo depende de uma enzima chamada de DNA-primase, que utiliza ribonucleosídeos trifosfatos para sintetizar pequenos iniciadores de RNA na fita retardada. ● A enzima chamada de DNA-ligase liga a extremidade 3 do novo fragmento de DNA à extremidade 5 do fragmento anterior, completando o processo. Resumindo: A DNA-primase sintetiza indicadores de RNA na fita iniciadora (3’5’), enquanto isso, a DNA-polimerase se junta ao iniciador de RNA, na direção oposta (5’3’), o que inicia um novo fragmento de Okazaki e termina o fragmento de DNA. O fragmento antigo de iniciador de RNAé retirado e substituído por DNA. A DNA-ligase “liga” os novos fragmentos, formando uma única fita (3’5’). Proteínas especiais auxiliam na abertura da dupla-hélice de DNA à frente da forquilha de replicação: ● Para que a síntese de DNA ocorra, a dupla-hélice de DNA deve ser aberta (“desnaturada”) à frente da forquilha de replicação, de modo que o desoxirribonucleosídeo trifosfato possa formar par com a fita-molde. ● Duas proteínas de replicação adicionais – as DNA-helicases e as proteínas ligadoras de DNA de fita simples – são necessárias para promover a abertura da dupla-hélice e fornecer os moldes de DNA de fita simples para que a polimerase possa atuar. ● As DNA-helicases: proteínas que hidrolisam ATP. ● As duas fitas possuem polaridades opostas, e, em princípio, as helicases poderiam desenrolar a dupla-hélice de DNA movendo-se na direção 5-3 sobre uma fita, e na direção 3-5 sobre a outra. ● Na frente da forquilha de replicação, a DNA-helicase abre a dupla-hélice de DNA. Duas moléculas de DNA-polimerase trabalham na forquilha, uma na fita-líder, e outra na fita retardada. ● Uma DNA-topoisomerase pode ser entendida como uma nuclease reversível que se liga covalentemente a um fosfato da cadeia principal do DNA, clivando uma ligação fosfodiéster na fita de DNA. Essa reação é reversível, e a ligação fosfodiéster é regenerada quando a proteína é liberada. ● As posições onde a hélice inicialmente é aberta são chamadas de origens de replicação. ● Durante as fases G1, S e G2, a célula cresce continuamente. Na fase M o crescimento para, ocorre a divisão nuclear e a célula se divide em duas. A replicação do DNA é limitada à parte do ciclo celular conhecida como fase S. G1 é o intervalo entre as fases M e S; G2 é o intervalo entre as fases S e M. ● A adição ordenada e rápida dos novos tetrâmeros H3-H4 e dímeros H2A-H2B atrás da forquilha de replicação requer chaperonas de histonas (também chamadas de fatores de associação da cromatina). Esses complexos com várias subunidades ligam-se às histonas altamente básicas e as liberam apenas no contexto apropriado. As chaperonas de histonas, com suas cargas, são conduzidas ao DNA recém-replicado pela interação específica com a cinta deslizante eucariótica, chamada PCNA.. As cintas são deixadas atrás da forquilha em movimento e permanecem no DNA por um período suficiente para que as chaperonas de histonas completem sua função. A telomerase replica as extremidades dos cromossomos: ● As sequências de DNA telomérico são reconhecidas por proteínas ligadoras de DNA que reconhecem uma sequência específica de DNA e atraem uma enzima, chamada de telomerase, que repõe essas sequências cada vez que a célula se divide. A telomerase reconhece a extremidade de uma sequência telomérica de DNA existente e a estende na direção 5-3, utilizando um molde de RNA que compõe a própria enzima para sintetizar novas cópias da repetição. ● Uma transcriptase reversa é uma forma especial de polimerase que utiliza um molde de RNA para produzir uma fita de DNA. ● Portanto, vimos anteriormente que defeitos em um gene humano cujo produto normalmente atua no reparo de pares de bases mal pareados, resultantes de erros na replicação do DNA, podem causar uma predisposição hereditária a cânceres de cólon e alguns outros órgãos, devido a uma taxa aumentada de mutações. Em outra doença humana, o xeroderma pigmentoso (XP), os indivíduos afetados apresentam uma sensibilidade extrema à radiação ultravioleta, pois são incapazes de reparar determinados fotoprodutos no DNA. Esse defeito no reparo resulta em um aumento na taxa de mutação, o que provoca graves lesões na pele e uma suscetibilidade aumentada ao câncer de pele. Finalmente, mutações nos genes Brca1 e Brca2 comprometem um tipo de reparo de DNA conhecido como recombinação homóloga e são a causa do câncer hereditário de mama e ovário. ● DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA: Quando a célula requer uma proteína específica, a sequência de nucleotídeos da região apropriada de uma molécula de DNA extremamente longa em um cromossomo é inicialmente copiada sob a forma de RNA (através de um processo denominado transcrição). São essas cópias de RNA de segmentos de DNA que são utilizadas diretamente como moldes para promover a síntese da proteína (em um processo denominado tradução). ● A transcrição e a tradução são os meios pelos quais as células leem, ou expressam, as instruções genéticas de seus genes. ● A primeira etapa executada pela célula para ler a informação necessária a partir de suas instruções genéticas é a cópia de um segmento específico da sequência de nucleotídeos do DNA – um gene – sob a forma de uma sequência de nucleotídeos de RNA. A informação na forma de RNA, embora copiada em uma forma química distinta, ainda é escrita essencialmente na mesma linguagem do DNA – a linguagem de uma sequência de nucleotídeos. Por isso, o nome dado para a produção de moléculas de RNA a partir do DNA é transcrição. ● A transcrição inicia com a abertura e a desespiralização de uma pequena porção da dupla-hélice do DNA. ● A transcrição difere da replicação de DNA em vários aspectos importantes. Diferentemente de uma fita de DNA recém-formada, a fita de RNA não permanece ligada à fita de DNA-molde por ligações de hidrogênio. ● As enzimas que realizam a transcrição são denominadas RNA-polimerases. Elas catalisam a formação de ligações fosfodiéster que conectam os nucleotídeos entre si formando uma cadeia linear. ● A transcrição do DNA produz uma molécula de RNA de fita simples que é complementar a uma das fitas da dupla-hélice de DNA. ● O DNA é transcrito pela enzima RNA-polimerase. A RNA-polimerase (azul-claro) move-se passo a passo ao longo do DNA, desenrolando a hélice do DNA no seu sítio ativo indicado pelo Mg2+(vermelho), que é necessário para a catálise. Conforme avança, a polimerase adiciona nucleotídeos, um a um, à cadeia de RNA no sítio de polimerização, usando uma fita de DNA exposta como molde. Consequentemente, o RNA transcrito é uma cópia complementar de fita simples de uma das duas fitas do DNA. Uma região curta de hélice DNA/RNA (cerca de nove pares de nucleotídeos em comprimento) é formada apenas transitoriamente, e uma “janela” dessa hélice DNA/RNA move-se ao longo do DNA com a polimerase, e a dupla hélice do DNA é reestruturada após sua passagem. Os nucleotídeos a serem incorporados estão na forma de ribonucleosídeos trifosfato (ATP, UTP, CTP e GTP), e a energia estocada em suas ligações fosfato-fosfato fornece a força necessária para a reação de polimerização. ● RNA mensageiro (mRNA): Codificam proteínas; ● RNAs nucleares (snRNA, small nuclear RNA): promovem o splicing (excisão de íntrons) do pré-mRNA para formar o mRNA ● RNA ribossômico (rRNA) formam a porção central dos ribossomos. ● RNA transportador (tRNA) formam os adaptadores que selecionam aminoácidos e os colocam no local adequado nos ribossomos para serem incorporados em proteínas. ● A iniciação da transcrição nos eucariotos requer várias proteínas. Em contraste com as bactérias, que contêm um único tipo de RNA-polimerase, os núcleos eucarióticos têm três: RNA-polimerase I, II E III. ● As RNA-polimerases I e III transcrevem os genes que codificam RNA de transferência, RNA ribossômico e vários pequenos RNAs. A RNA-polimerase II transcreve a grande maioria dos genes, inclusive todos aqueles que codificam proteínas; 1. Enquanto a RNA-polimerase bacteriana requer apenas um único fator de iniciação da transcrição para começar a transcrição, as RNA-polimerases eucarióticas exigem muitos desses fatores, chamados coletivamente de fatores gerais de transcrição. 2. A iniciação da transcrição eucariótica deve ocorrer no DNA que está empacotado nos nucleossomos e em estruturas de cromatina de ordem superior, estruturas essas que estão ausentes dos cromossomos bacterianos. O splicing do RNA é realizado pelo spliceossomo Diferentemente das outras etapas de produção de mRNA já discutidas, as etapas-chave do splicing do RNA são realizadas por moléculas de RNA e não por proteínas.As moléculas especializadas de RNA reconhecem as sequências nucleotídicas que especificam onde o splicing deve ocorrer e também catalisam a química do splicing. Essas moléculas de RNA são relativamente pequenas (possuem menos de 200 nucleotídeos cada uma), e existem cinco delas, U1, U2, U4, U5 e U6. Conhecidas como snRNAs (pequenos RNAs nucleares, small nuclear RNAs), cada uma é complexada com pelo menos sete subunidades proteicas para formar uma snRNP (pequena ribonucleoproteína nuclear, de small nuclear ribonucleoprotein). As snRNPs formam o cerne do spliceossomo, o grande arranjo de moléculas de RNA e de proteínas que realiza o splicing do pré-mRNA na célula. Durante a reação de splicing, o reconhecimento da junção de processamento 5’, do ponto da forquilha e da junção de processamento 3’ é realizado principalmente por meio do pareamento de bases entre os snRNAs e as sequências consenso de RNA no pré-mRNA substrato. Tradução: A tradução da sequência nucleotídica de uma molécula de mRNA em proteína ocorre no citosol em um grande arranjo ribonucleoproteico denominado ribossomo. Cada aminoácido utilizado para a síntese das proteínas é inicialmente ligado a uma molécula de tRNA que reconhece, por interações de complementaridade de bases, um conjunto particular de três nucleotídeos (códons) no mRNA. Conforme um mRNA é passado através de um ribossomo, a sua sequência de nucleotídeos é lida de uma extremidade a outra, em conjuntos de três, de acordo com o código genético. Para iniciar a tradução, uma subunidade ribossômica menor se liga a uma molécula de mRNA em um códon de iniciação (AUG) que é reconhecido por uma molécula de tRNA iniciadora característica. Então, uma subunidade ribossômica maior se liga para completar o ribossomo e iniciar a síntese proteica. Durante essa fase, os aminoacil-tRNAs – cada um carregando um aminoácido específico – ligam-se sequencialmente ao códon apropriado no mRNA, por meio de complementaridade de bases entre o anticódon do tRNA e os códons do mRNA. Cada aminoácido é adicionado à extremidade C-terminal do polipeptídeo em crescimento por quatro etapas sequenciais: ligação do aminoacil-tRNA seguida da formação da ligação peptídica e de duas etapas de translocação do ribossomo. Os fatores de alongamento usam hidrólise de GTP tanto para promover essas reações quanto para melhorar a exatidão da seleção dos aminoácidos. A molécula de mRNA progride códon a códon ao longo do ribossomo, na direção de 5’ para 3’, até alcançar um de três possíveis códons de terminação. Então, um fator de liberação se liga ao ribossomo, finalizando a tradução e liberando o polipeptídeo completo. Os ribossomos eucarióticos e bacterianos são intimamente relacionados, apesar de diferenças em número e em tamanho de seus rRNAs e de seus componentes proteicos. O rRNA tem a função dominante na tradução, determinando a estrutura geral do ribossomo, formando os sítios de ligação para os tRNAs, pareando os tRNAs aos códons no mRNA e criando o sítio da enzima peptidiltransferase que liga os aminoácidos durante a tradução. Nas etapas finais da síntese de proteína, dois tipos distintos de chaperonas moleculares auxiliam o enovelamento das cadeias polipeptídicas. Essas chaperonas, conhecidas como hsp60 e hsp70, reconhecem regiões hidrofóbicas expostas nas proteínas e servem para evitar a agregação da proteína que poderia competir com o enovelamento das proteínas recentemente sintetizadas em suas conformações tridimensionais corretas. Esse processo de enovelamento da proteína deve também competir com um mecanismo de controle de qualidade altamente elaborado que degrada proteínas que contenham regiões hidrofóbicas anormalmente expostas. Nesse caso, a ubiquitina é covalentemente adicionada a uma proteína mal enovelada por uma ubiquitina-ligase, e a cadeia de poliubiquitina resultante é reconhecida pelo quepe de um proteassomo que desenrola a proteína e a insere no proteassomo para a degradação proteolítica. Um mecanismo proteolítico intimamente relacionado, baseado em sinais de degradação especiais reconhecidos por ubiquitinas- -ligase, é utilizado para determinar o tempo de vida de muitas proteínas normalmente enoveladas e também para remover da célula proteínas selecionadas em resposta a sinais específicos. A fase M compreende dois eventos principais: a divisão nuclear, ou mitose, durante a qual os cromossomos copiados são distribuídos em um par de núcleos-filhos; e a divisão citoplasmática, ou citocinese, quando a própria célula se divide em duas. Ao fim da fase S, as moléculas de DNA em cada par de cromossomos duplicados se entrelaçam e são mantidas fortemente unidas por ligações proteicas especializadas. No começo da mitose, em um estágio chamado de prófase, as duas moléculas de DNA são gradativamente desembaraçadas e condensadas em pares de bastonetes rígidos e compactos chamados de cromátides-irmãs, as quais permanecem ligadas por meio da coesão de cromátides-irmãs. Quando posteriormente o envelope nuclear se desfaz na mitose, os pares de cromátides-irmãs ficam ligados ao fuso mitótico, um gigantesco arranjo bipolar de microtúbulos (discutido no Capítulo 16). As cromátides-irmãs são fixadas a polos opostos do fuso, e, por fim, alinham-se na placa equatorial do fuso em um estágio chamado de metáfase. A destruição da coesão de cromátides-irmãs, no início da anáfase, separa as cromátides-irmãs, que são puxadas para polos opostos do fuso. Em seguida, o fuso se desfaz e os cromossomos segregados são empacotados em núcleos separados na telófase. Então, a citocinese cliva a célula em duas, de forma que cada célula-filha herde um dos dois núcleos. O sistema de controle do ciclo celular depende de proteínas-cinase dependentes de ciclinas (Cdks) ciclicamente ativadas Os componentes centrais do sistema de controle do ciclo celular são membros de uma família de cinases conhecidas como cinases dependentes de ciclinas (Cdks; do inglês, cyclin-dependent kinases). As atividades dessas cinases aumentam e diminuem à medida que a célula avança no ciclo, levando a mudanças cíclicas na fosforilação de proteínas intracelulares que iniciam ou regulam os principais eventos do ciclo celular. Um aumento na atividade de Cdk na transição G2/M, por exemplo, aumenta a fosforilação de proteínas que controlam a condensação de cromossomos, o rompimento do envelope nuclear, agrupamento no eixo e outros eventos que ocorrem nas etapas iniciais da mitose. As mudanças cíclicas na atividade das Cdks são controladas por um complexo arranjo de enzimas e outras proteínas. O mais importante desses reguladores das Cdks são proteínas conhecidas como ciclinas. As Cdks, como implica o nome, são dependentes de ciclinas para sua atividade: a menos que estejam fortemente ligadas a uma ciclina, elas não têm atividade de cinase. As G1/S-ciclinas ativam Cdks no final de G1 e, com isso, ajudam a desencadear a progressão ao Início, resultando no comprometimento à entrada no ciclo celular. Seus níveis diminuem na fase S. 2. As S-ciclinas se ligam a Cdks logo após a progressão ao Início e ajudam a estimular a duplicação dos cromossomos. Os níveis das S-ciclinas permanecem elevados até a mitose, e essas ciclinas também contribuem ao controle de alguns eventos mitóticos iniciais. 3. As M-ciclinas ativam Cdks que estimulam a entrada na mitose na transição G2/M. Os níveis de M-ciclinas diminuem na metade da mitose. O aumento na divisão e a diminuição na apoptose podem contribuir para a tumorigênese. Em tecidos normais, a apoptose compensa a divisão celular para manter a homeostase (ver Animação 18.1). Durante o desenvolvimento do câncer, o aumento da divisão celular ou a inibição da apoptose pode levar ao aumento do número de células, importante para a tumorigênese. As células destinadas à apoptose estão representadas em cinza. Tanto o aumento na divisão quanto a diminuição na apoptose normalmente contribuem para o crescimento do tumor. ● p53 é um gene supressor tumoral, que codifica uma fosfoproteína nuclear que desempenha um papel importante no controledo ciclo celular, no reparo do DNA e na indução da apoptose. (mutação no gene TP53); proteína reguladora de transcrição; ● P21 inibe CDK. Suprime as atividades de G1/S-Cdk e S-Cdk após danos ao DNA. ● Ubiquitina: Sinalizar as proteínas destinadas a degradação pela proteassomas.
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