TCC siRNA - Douglas Matheus Trindade Guimarães

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CURSO DE BACHARELADO EM BIOMEDICINA
DOUGLAS MATHEUS TRINDADE GUIMARÃES
DESENHO DE ALVOS IN SILICO DE siRNA PARA O HIV-1
BELÉM- PA
2021
DOUGLAS MATHEUS TRINDADE GUIMARÃES
DESENHO DE ALVOS IN SILICO DE siRNA PARA O HIV-1
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Bacharelado em Biomedicina do Centro universitário FIBRA, como requisito parcial à obtenção do título de bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dr. Samir Mansour Moraes Casseb
BELÉM- PA
2021
DOUGLAS MATHEUS TRINDADE GUIMARÃES
DESENHO DE ALVOS IN SILICO DE siRNA PARA O HIV-1
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Bacharelado em Biomedicina, do Centro universitário FIBRA, como requisito parcial à obtenção do título de bacharel em Biomedicina.
Data de aprovação:___/____/2021
_______________________________ 
Prof. Dr. Samir Mansour Moraes Casseb (FIBRA)
_______________________________
Prof. Dra. Maria Helena Rodrigues de Mendonça (FIBRA)
________________________________
Prof. Dr. Gustavo Moraes Holanda (IEC)
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradecer a minha mãe Ellem e meu padrasto Josué, por todo apoio e incentivo durante minha trajetória. Graças a vocês consegui concluir um dos meus grandes objetivos de vida. Acima de qualquer uma das dificuldades, sempre buscaram formas de manter esse sonho vivo. 
Aos meus avós, Maria Izabel e Jorge, que fizeram e ainda fazem parte da minha formação pessoal e estavam dando sempre todo apoio possível durante essa jornada. 
Aos meus tios, os quais me ajudaram de alguma forma nos momentos de dificuldades e apertos.
Ao meu orientador Prof°. Dr Samir Mansour Moraes Casseb, pelo seu tempo, paciência, dedicação e seus conhecimentos que me ajudaram a construir cada parte deste trabalho de maneira ilustre.
A todos os meus amigos de curso que caminharam lado a lado nesta jornada, em especial meu amigo Felipe Gouvêa de Souza, o meu muito obrigado!
“Às vezes você precisa se machucar para conhecer, cair para crescer, perder para ganhar, porque as maiores lições da vida são aprendidas por meio da dor. “
Pain/Nagato – Naruto Shippuden
GUIMARÃES, Douglas Matheus Trindade. Desenhos de alvos in silico de siRNA para o HIV-1. Trabalho de Conclusão de Curso (Biomedicina) – Faculdade Integrada Brasil Amazônia (FIBRA), 2021. 
RESUMO
Objetivo: Desenvolver de forma in silico possíveis alvos de RNAi para tratamento de infecções por HIV-1 e sugerir um possível tratamento com siRNA utilizando os alvos in silico desenhados para HIV-1. Material e métodos: Foi realizado um estudo experimental in sílico e como objeto de estudo foram utilizadas 20 sequências de genomas completos de HIV-1 de diferentes países. Foram realizados os desenhos dos siRNAs das regiões mais conservadas do genoma do HIV-1. Utilizou-se de protocolos avaliativos para realizar a análise das sequências escolhidas. Resultados: A análise realizada resultou em 18 sequências dentro de regiões conservadas do genoma viral. Foram escolhidos apenas 5 alvos, limitando a um alvo por gene nas regiões conservadas. Os alvos selecionados foram levados para etapa final. A seleção cinco sequências que atuem em genes diferentes foi a melhor escolha para um bom resultado terapêutico. Conclusão: Os resultados apresentados pelo processamento dos siRNAs demonstravam que sequências desenhadas possuem uma boa atuação no alvo, quando vistos através dos critérios predispostos durante a pesquisa.
Palavras chave: HIV-1; siRNA; Biologia Computacional; Terapêutica com RNAi
GUIMARÃES, Douglas Matheus Trindade. in silico siRNA target design for HIV-1. Completion of course work(Biomedicine) - Faculdade Integrada Brasil Amazônia (FIBRA), 2021.
ABSTRACT
Objective: To develop in silico possible RNAi targets for the treatment of HIV-1 infections and to suggest a possible siRNA treatment using the silicone targets designed for HIV-1. Material and methods: An experimental study carried out in silica and as object of study 20 sequences of complete HIV-1 genomes from different countries used. The designs of siRNAs from the most conserved regions of the HIV-1 genome performed. Evaluation protocols used to carry out an analysis of the chosen sequences. Results: The analysis performed resulted in 18 sequences within conserved regions of the viral genome. Only 5 targets chosen, limiting one target per gene in the conserved regions. The selected targets taken to the final stage. A selection of five sequences that act on different genes was the best choice for a good therapeutic result. Conclusion: The results obtained by processing the siRNAs showed that the designed sequences have a good performance on the target, when viewed through the criteria predisposed during a search.
Keywords: HIV-1; RNA, siRNA; Computational Biology; RNAi Therapeutics
SIGLAS E ABREVIATURAS
AGO 2 - Argonauta 2
AIDS – SINDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA
ARV – Antirretrovirais
cDNA – DNA COMPLEMENTAR
dsRNA – RNA de fita dupla
HIV – VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA
INI – Inibidor de integrase 
ITRN – Inibidores de transcriptase reversa análogos de nucleosídeos
ITRNN – Inibidor de transcriptase reversa não-análogo de nucleosídeo
IP/r – Inibidor de protease reforçado com ritonavir
miRNA – MicroRNA
MS – MINISTÉRIO DA SAÚDE
NCBI – Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia
RNAi – RNA por interferência
shRNA – RNA em gancho curto
siRNA – Pequeno RNA por interferência
SUS – Sistema Único de Saúde
TARV – Terapia antirretroviral
SUMÁRIO
RESUMO......................................................................................................................6
ABSTRACT..................................................................................................................7
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS......................................................................8
1 INTRODUÇÃO………………………………………………………………………….....9
1.1 MORFOLOGIA E CARACTERÍSTICAS GERAIS DO HIV………………………....9
1.2 EPIDEMIOLOGIA…………………………………………………………………….....9
1.3 TRATAMENTO PARA O HIV………………………………………………….…......11
1.4 siRNA…………………………………………………………………………..…….….12
1.4.1 Mecanismos de ação do siRNA………………………………………………..…..13
2 OBJETIVOS……………………………………………….………………………....…..14
2.1 OBJETIVO GERAL………………………………………………………………….…14
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS……………………..……..…..………………..….…...14
3 ARTIGO…………………………..…………………………………………………….....15
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………….…………………………..…......26
ANEXO A...............................................................................................................................28
1 INTRODUÇÃO
1.1 MORFOLOGIA E CARACTERÍSTICAS GERAIS DO HIV
O vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2) é um retrovírus que apresenta estruturalmente o envelope e o capsídeo viral, esses vírus são conhecidos por ocasionar a AIDS (Síndrome da imunodeficiência humana). Os retrovírus são constituídos de uma única fita de RNA polaridade positiva e possuem as enzimas como protease, integrase e transcriptase reversa, este último é responsável por transformar RNA viral em DNA complementar (cDNA). O cDNA é introduzido pela enzima integrase ao DNA da célula hospedeira de modo a iniciar o ciclo de replicação viral. O HIV pertence à família dos lentivírus, que é uma família capaz de promover infecções persistentes e de progressão lenta, por isso produzem degeneração progressiva do sistema imune (SANTOS et al, 2015; BRASIL, 2003).
Sobre o HIV-1, sabe-se que ele possui cerca de 9,75kpb e uma grande heterogeneidade genética. Seu genoma é constituído por três genes estruturais, os genes gag, pol e env, possui também dois genes com papel regulatório, os genes tat e rev, além disto ainda existem 4 genes acessórios, que são os genes nef, vif, vpr e vpu. Cada um desses genes possui um papel único durante a replicação viral, podendo ser de transcrição (gene tat), exportação do RNAm do núcleo para o citoplasma (gene rev), ou tem o papel de desenvolver a infectividade dos vírions e a liberaçãodos mesmo para fora da célula infectada (vif e vpu) (HULO C, 2011; SANTOS et al., 2015; SILVEIRA, 2007).
1.2 EPIDEMIOLOGIA
Segundo dados do Ministério da Saúde (MS) mais de 920 mil pessoas são portadoras do HIV no Brasil. Em 2019 foram diagnosticados cerca de 41.919 casos de HIV e 37.308 casos de AIDS. Em escala global existem cerca de 38 milhões de pessoas no mundo portadoras do HIV e 1,7 milhões de novas infecções pelo vírus (UNAIDS, 2020).
Segundo dados da OMS, estima-se que os casos de HIV na América Latina aumentaram cerca de 21% desde 2010, com cerca de 120.000 novas pessoas. Já no Caribe houve um decréscimo de 29%, o que representa 13 mil ao ano. Na América Latina, ocorreu uma redução do número de mortes relacionadas à AIDS de 41 mil em 2010 para 37 mil em 2019. Na região do Caribe também ocorreu uma redução nesse número de mortes de 11 mil para 6900, neste mesmo período. Estima-se que 23% das pessoas com HIV na América Latina e no Caribe desconhecem sua infecção e cerca de um terço tem diagnóstico tardio, com imunodeficiência avançada (OPAS, 2020).
O Brasil apresenta números bastantes elevados estatisticamente para infecções por HIV. Dados apresentados pelo SINAN mostram que de 2007 até junho de 2020, foram notificados no 342.459 casos de infecção por HIV, sendo 152.029 (44,4%) na região sudeste, 68.385 (20,0%) na região Sul, 65.106 (19,0%) na região nordeste, 30.943 (9,0%) na região norte e 25.966 (7,6%) na região centro-Oeste (Figura 1). Já durante o ano de 2019, foram notificados 41.919 casos de infecção pelo HIV, sendo 4.948 (11,8%) casos na região Norte, 10.752 (25,6%) no Nordeste, 14.4778 (35,3%) no Sudeste, 7.639 (18,2%) no Sul e 3.802 (9,1%) no Centro-oeste (BRASIL, 2020).
Figura 1. Distribuição das infecções por HIV por região.	
Fonte: Ministério da Saúde, 2020.
Podemos observar os números de infectados por HIV em território nacional, a partir de casos de infecção notificados no SINAN de 2007 a junho de 2020, com um total de 342.375, cerca de 237.551 (69,4%) de casos de infecção por HIV em homens e 104.824 (30,6%) casos em mulheres (Figura 2). As informações do SINAN mostram que desde 1980 até junho de 2020, já foram identificados cerca de 1.011.617 casos AIDS no Brasil (BRASIL, 2020).
Figura 2. Distribuição por sexo de infectados por HIV no Brasil de 2007 a 2020.
Fonte: Brasil, 2020.
1.3 TRATAMENTO PARA O HIV
O tratamento para portadores do HIV no Brasil foi garantido em 1996, graças à Lei n° 9.313/96, que garante a distribuição de medicamentos antirretrovirais (ARV) através do Sistema Único de Saúde (SUS). Esta política pública tem como objetivo dar o acesso à terapia antirretroviral (Tarv) (CARVALHO et al., 2019). 
O Tarv deve ser iniciado assim que confirmada a infecção pelo HIV, uma vez que a presença de sintomas já demonstra fragilidade imunológica e incapacidade de controle viral. A terapia deve incluir três ARV, sendo dois inibidores da transcriptase reversas análogos de nucleosídeos (ITRN) associados a um inibidor de transcriptase reversa não-análogo de nucleosídeo (ITRNN), um inibidor de protease reforçado com ritonavir (IP/r) ou até um inibidor de integrase (INI) (CARVALHO, 2019; BRASIL, 2018). No Brasil é muito utilizado no início do tratamento o conjunto de lamivudina + tenofovir + dolutegravir. O uso desses fármacos possuem uma boa tolerância e eficácia, e existem poucos relatos de resistência primária aos inibidores de integrase e também poucas interações medicamentosas. No entanto o uso desses medicamentos de ser feito com muita cautela, pois pode apresentar muitos efeitos adversos quando utilizados com alguns medicamentos e o uso de alguns pode representar riscos para mulheres em idade fértil que pretendam engravidar, fazendo-se necessária a troca dos ARV, a fim de evitar complicações medicamentosas (CARVALHO et al., 2019).
O uso do Tarv pode gerar grandes benefícios para o portador do HIV, no entanto o tratamento possui uma falha, denominada de falha virológica. Esta falha é caracterizada pela detecção da carga viral após seis meses do início ou da modificação do tratamento, ou o retorno da carga viral em indivíduos que já haviam atingido a supressão viral sob tratamento. Esta falha pode prejudicar a recuperação imunológica, e essa supressão mesmo ocorrendo em níveis baixos, pode resultar na acumulação de cepas com mutações de resistência aos antirretrovirais em uso e até os da mesma classe, podendo levar a redução parcial ou total de possíveis formas de tratamento para a infecção (CARVALHO et al., 2019; BRASIL, 2018).
1.4 siRNA
Os primeiros estudos que relataram as atividades da RNAi ocorreram na década de 1980, onde foi evidenciado um papel do RNA sendo além de um simples mensageiro para síntese de proteínas mostrando uma capacidade catalítica, assim como as enzimas, acabando por ser considerado uma ribozima (FIRE et al., 1998; MENCK et al., 2010). 
A interferência por RNA (RNAi) foi descrita popularmente pela primeira vez em plantas (petúnias) no início da década de 1990 quando determinadas plantas transgênicas estavam super-expressando genes para produção de pigmentos, entretanto estas plantas apresentam flores brancas devido a inibição da síntese do pigmento por silenciamento do transgene e do gene endógeno (FRANÇA et al., 2010). Também é descrito que a via do RNAi atua como parte da defesa imune inata dos eucariotos contra a invasão por ácidos nucleicos exógenos (BENNASSER et al., 2007). 
Existem 3 tipos de classificação que envolvem os dsRNAs (RNA de fita dupla), são elas: miRNAs (MicroRNAs), siRNAs (RNAs de interferência curtos) e shRNAs (RNAs em gancho curto). Os miRNAs são pequenos dsRNAs endógenos, que possuem cerca de 22 nucleotídeos, e sua função principal é realizar silenciamentos pós-transcricionais, inibindo a tradução do mRNA-alvo em proteína. Os shRNAs que são RNAs de dupla fita, estes são constituídos para exibirem uma estrutura análoga aos miRNAs. Podem ser produzidos de forma exógena e introduzidos na célula ou transcritos dentro da célula utilizando vetores que codificam o shRNA juntamente a um promotor da RNA polimerase III. Os siRNA são moléculas sintéticas de dupla fita de RNA com cerca de 19 a 30 pb, que atuam através de pareamento a sequências complementares ao RNAm alvo, provocando sua degradação, ou seja, o silenciamento de um gene em específico. Através disso é possível compreender mais sobre a atuação do siRNA na célula, baseado no silenciamento do gene que codifica determinada proteína. Para realizar o silenciamento de uma expressão gênica pós-transcricional, o RNAi atua sobre o RNAm. O RNAi pode ser incorporado no complexo intracitoplasmático, o dsRNA liga-se a sequência de nucleotídeos complementares no RNAm alvo, promovendo o silenciamento por inibição da tradução ou degradação do RNAm. (FRANÇA et al., 2010; ZHANG et al., 2007). 
1.4.1 Mecanismos de ação do siRNA
O processo de entrada intracitoplasmática do dsRNA resulta no reconhecimento celular desse material pela enzima Dicer, responsável por clivar essa dupla fita em pequenos fragmentos de RNAi (siRNA) com cerca de 21 a 23 nucleotídeos. Os siRNAs são incorporados por proteínas celulares a RISC (Complexo de silenciamento induzido por RNA), onde está presente a proteína Argonauta 2 (Ago 2) responsável pela seleção das fitas de siRNA. Após sua inclusão do siRNA à RISC, ocorre a separação dessas fitas, distribuídas em fita sense, que é expulsa do complexo e a fita antisense que permanece ligada, se tornando a uma guia para se ligar a uma sequência de RNAm. Após o pareamento das fitas complementares o RNAm é clivado pela Ago 2, responsável por degenerar o RNAm, resultando na regulação da expressão do mesmo, a figura 3 representa o processo de funcionamento do RNAi (MANO et al., 2012).
Figura 3. Esquema básico de funcionamento do RNAi
Fonte: Mano, 2012.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver de forma in silico possíveis alvos de RNAi para tratamento de infecções por HIV-1.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
- Encontrar regiões conservadas a partirde um banco de HIV-1
- Identificar possíveis pontos alvos para RNAi em sequências de HIV-1
- Comparar diferentes métodos de desenho de RNAi no genoma de HIV-1
- Sugerir um possível tratamento com siRNA utilizando os alvos in silico desenhados para HIV-1
3 ARTIGO
DESENHO DE ALVOS IN SILICO DE SIRNA PARA O HIV-1
Douglas Matheus Trindade Guimarães¹ 
Samir Mansour Moraes Casseb¹ 
1 Centro Universitário FIBRA. Pará, Brasil.
Correspondência: dmat362@gmail.com
RESUMO:
O estudo a seguir tem como foco realizar a busca de alvos in silico de forma rápida e de baixo custo, a fim de utilizar essas ferramentas para testes de possíveis alvos de siRNA para o HIV-1. Foi realizado um estudo experimental in sílico e como objeto de estudo foram utilizadas 20 sequências de genomas completos de HIV-1 de diferentes países. Foram realizados os desenhos dos siRNAs das regiões mais conservadas do genoma do HIV-1. Utilizou-se de protocolos avaliativos para realizar a análise das sequências escolhidas. A análise realizada resultou em 18 sequências dentro de regiões conservadas do genoma viral. Foram escolhidos apenas 5 alvos, limitando a um alvo por gene nas regiões conservadas. Os alvos selecionados foram levados para etapa final. A seleção cinco sequências que atuem em genes diferentes foi a melhor escolha para um bom resultado terapêutico. Os resultados apresentados pelo processamento dos siRNAs demonstravam que sequências desenhadas possuem uma boa atuação no alvo, quando vistos através dos critérios predispostos durante a pesquisa.
Palavras chave: HIV-1; siRNA; Biologia Computacional; Terapêutica com RNAi
ABSTRACT:
HIV is a virus responsible for causing the human immunodeficiency syndrome. According to WHO, there are about 38 million people in the world with HIV and 1.7 million new infections with the virus. RNAi was first described in the 1990s in plants. siRNAs are synthetic double-stranded RNA molecules that act by pairing complementary sequences to the target mRNA, causing or silencing a specific gene. The following study focuses on quickly and inexpensively targeting siRNAs in order to use these tools to test possible siRNA targets for HIV-1. An experimental study was carried out in silica and as object of study 20 sequences of complete HIV-1 genomes from different countries were used. The designs of siRNAs from the most conserved regions of the HIV-1 genome were performed. Evaluation protocols were used to carry out an analysis of the chosen sequences. The analysis performed resulted in 18 sequences within conserved regions of the viral genome. Only 5 targets were chosen, limiting one target per gene in the conserved regions. The selected targets were taken to the final stage. A selection of five sequences that act on different genes was the best choice for a good therapeutic result. The results by processing siRNAs processing demonstrated that the designed sequences have a good performance on the target, when viewed through the criteria predisposed during a search.
Keywords: HIV-1; RNA, siRNA; Computational Biology; RNAi Therapeutics
INTRODUÇÃO
O vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 e HIV-2) é um retrovírus que apresenta estruturalmente o envelope e o capsídeo viral, esses vírus são conhecidos por ocasionar a AIDS (Síndrome da imunodeficiência humana). Os retrovírus são constituídos de uma única fita de RNA polaridade positiva e possuem as enzimas como protease, integrase e transcriptase reversa, este último é responsável por transformar RNA viral em DNA complementar (cDNA). O cDNA é introduzido pela enzima integrase ao DNA da célula hospedeira de modo a iniciar o ciclo de replicação viral. O HIV pertence à família dos lentivírus, sendo uma família capaz de promover infecções persistentes e de progressão lenta, por isso produzem degeneração progressiva do sistema imune (1; 2).
O HIV-1 possui cerca de 9,75kpb e uma grande heterogeneidade genética. Seu genoma é constituído por três genes estruturais, os genes gag, pol e env, possui também dois genes com papel regulatório, os genes tat e rev, além disto ainda existem 4 genes acessórios, os genes nef, vif, vpr e vpu. Cada um desses genes possui um papel único durante a replicação viral, podendo ser de transcrição (gene tat), exportação do RNAm do núcleo para o citoplasma (gene rev), ou tem o papel de desenvolver a infectividade dos vírions e a liberação dos mesmo para fora da célula infectada (vif e vpu) (2; 3; 4).
Segundo dados do Ministério da Saúde (MS) mais de 920 mil pessoas são portadoras do HIV no Brasil. Em 2019 foram diagnosticados cerca de 41.919 casos de HIV e 37.308 casos de AIDS. Em escala global existem cerca de 38 milhões de pessoas no mundo portadoras do HIV e 1,7 milhões de novas infecções pelo vírus (5).
Baseado nos protocolos predispostos pelo MS, para detecção da infecção recente pelo vírus, usa-se um teste de 4a geração e em seguida um TM como teste complementar. Já nas infecções na fase crônica é possível usar inicialmente os testes de 3a ou 4a geração, seguidos por um teste complementar, seja ele WB, IBR ou TM(6).
O tratamento para portadores do HIV no Brasil foi garantido em 1996, graças à Lei n° 9.313/96, que garante a distribuição de medicamentos antirretrovirais através do Sistema Único de Saúde (SUS). Esta política pública visa dar o acesso à terapia antirretroviral (Tarv) (7). 
O Tarv deve ser iniciado assim que confirmada a infecção pelo HIV, dado que a presença de sintomas já demonstra fragilidade imunológica e incapacidade de controle viral. A terapia deve incluir três ARV, sendo dois inibidores de transcriptase reversas análogos de nucleosídeos (ITRN) associados a um inibidor de transcriptase reversa não-análogo de nucleosídeo (ITRNN), um inibidor de protease reforçado com ritonavir (IP/r) ou até um inibidor de integrase (INI) (6; 7). 
Inicialmente os primeiros estudos que relataram as atividades da RNAi ocorreram na década de 1980, onde foi evidenciado um papel do RNA sendo além de um simples mensageiro para síntese de proteínas mostrando uma capacidade catalítica, assim como as enzimas, acabando por ser considerado uma ribozima (8; 9) A interferência por RNA (RNAi) foi descrita popularmente pela primeira vez em plantas (petúnias) no início da década de 1990 quando determinadas plantas transgênicas estavam super-expressando genes para produção de pigmentos, entretanto estas plantas apresentam flores brancas devido à inibição da síntese do pigmento por silenciamento do transgene e do gene endógeno (10). Também é descrito que a via do RNAi atua como parte da defesa imune inata dos eucariotos contra a invasão por ácidos nucléicos exógenos (11). 
Existem 3 tipos de classificação que envolvem os dsRNAs (RNA de fita dupla), são elas: miRNAs (MicroRNAs), siRNAs (RNAs de interferência curtos) e shRNAs (RNAs em gancho curto). Os miRNAs são pequenos dsRNAs endógenos, que possuem cerca de 22 nucleotídeos, e sua função principal é realizar silenciamentos pós-transcricionais, inibindo a tradução do mRNA-alvo em proteína. Os shRNAs que são RNAs de dupla fita, estes são constituídos para exibirem uma estrutura análoga aos miRNAs. Podem ser produzidos de forma exógena e introduzidos na célula ou transcritos dentro da célula utilizando vetores que codificam o shRNA juntamente a um promotor da RNA polimerase III. Os siRNA são moléculas sintéticas de dupla fita de RNA com cerca de 19 a 30 pb, que atuam através de pareamento a sequências complementares ao RNAm alvo, provocando sua degradação, ou seja, o silenciamento de um gene em específico. Através disso é possível compreender mais sobre a atuação do siRNA na célula, baseado no silenciamento do gene que codifica determinada proteína. Para realizar o silenciamento de uma expressão gênica pós-transcricional, o RNAi atua sobre o RNAm. O RNAi pode ser incorporado no complexo intracitoplasmático, o dsRNA liga-se a sequência de nucleotídeos complementares no RNAm alvo, promovendo o silenciamento por inibição da tradução ou degradação do RNAm. (10; 12). 
FOCO DO ESTUDO9
Este trabalho tem como foco realizar uma busca in silico de possíveis alvos para siRNAs no genoma do HIV-1. Além de validar computacionalmente os alvos de acordo com sua eficiência em relação ao genoma viral. Desta maneira sugerindo possíveis alvos para tratamento utilizando a tecnologia de siRNA para HIV-1.
MÉTODOS
Foi realizado um estudo experimental in sílico e como objeto de estudo foram utilizadas 20 sequências de genomas completos de HIV-1 de diferentes países do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI). Foram selecionados 10 países sendo utilizadas 2 sequências dos seguintes países: Cuba, Coreia do Sul, Estados Unidos, Paquistão, Nigéria, Alemanha, Reino Unido, Peru, Rússia e Brasil. Os genomas de cada região foram inseridos na planilha eletrônica do programa Microsoft Excel 2019. Essas sequências também foram importadas para a plataforma UGENE versão 38.1 (13), nele foi utilizado o pacote de programa ClustalW (14) para alinhar as sequências, obter a consensus e analisar os genomas Fig. 1.
Figura 1. Análise realizada através da plataforma UGENE. 
Após a obtenção desta sequência, foram realizados os desenhos dos siRNA das áreas conservadas através do uso do programa siDirect (http://sidirect2.rnai.jp/). Através do uso deste programa foram extraídos 50 siRNAs no total, pertencendo aos genes: pol, gag, vif, vpr, vpu, tat, rev e env. Após isto foi realizada uma comparação entre os siRNAs adquiridos e as 20 sequências alinhadas no programa UGENE. A comparação foi realizada para verificar a divergência ou ausência de bases naquela região a qual pertencia cada siRNA.
	
	A projeção dessas sequências para a busca por alvos foi associada ao estudo com siRNAs apresentado por Fakhr et al (15). A utilização desta metodologia avaliativa compreende uma gama de critérios utilizados neste estudo. Foram adotados os 18 critérios predispostos pelo autor. Esses critérios apresentam-se divididos em dois graus de pontuação. Os primeiros 14 critérios recebiam um ponto por cada um que fosse cumprido, estes critérios são: 1 - Não estar em sites SNP; 2 -Não estar nas primeiras 75 bases do códon de início; 3 - Não estar no intron; 4 - Conteúdo de GC de 36-52%; 5 - Conteúdo de GC no segundo ao sétimo nucleotídeos da fita antisense = 19% e no oitavo ao décimo oitavos nucleotídeos da fita antisense = 52%; 6 - A frequência de GC e AT se repete menos de 3 e 4, respectivamente; 7 - Saliências TT na extremidade 3′; 8 - Pareamento de base fraco na extremidade 5 'da fita antisense (presença de A / U); 9 - Emparelhamento de base forte na extremidade 5 'da fita de sentido (presença de G / C); 10 - Presença de A nucleotídeo na sexta posição da fita antisense; 11 - Presença de A nucleotídeo na terceira e na décima nona posição da fita sense; 12 - Ausência de G / C na décima nona posição da fita sense; 13 - Ausência de nucleotídeo G na décima terceira posição da fita sense; 14 - Presença do nucleotídeo U na décima posição da fita sense. 
	Os últimos 4 critérios que também são descritos, são partes do processo de projeção muito minuciosas, logo somam-se 2 pontos por cada critério atendido. Os critérios são: 15 - Muito bom blast da fita com sentido e anti-sentido (se apenas uma fita é boa, dê um ponto); 16 - Emparelhamento de base assimétrico no duplex (Mais A / U em 5 ′ da fita com sentido anti-sentido e mais G / C em 5 ′ da fita com sentido; 17 - Presença de vale de energia do nono ao décimo quarto nucleotídeo da fita sensorial; 18 - Ausência de estruturas secundárias internas e grampos de cabelo, que podem ser estudados pelo programa oligoanalyzer (Molecular Biology Insights, Inc., Cascade, CO, EUA) ou Generunner (Hastings software, Inc., Hastings, NY, EUA). Portanto, quaisquer siRNAs que atendam aos parâmetros definidos receberão uma ou duas pontuações e, se não atender aos critérios, não receberá nenhuma pontuação. 
	Foi realizado o processo de Blast na plataforma NCBI para uma melhor observação dos siRNAs projetados. Para isto foi utilizado o Blastn, pois é o mais adequado para consultar sequências menores (15). Essa parte do processo avalia a homologia entre os siRNAs projetados e o gene humano. Esta parte do processo descreve que determinado percentual de compatibilidade ou match forem atingidos, as sequências devem ser selecionadas ou excluídas.
RESULTADOS
A análise realizada na plataforma UGENE das 50 sequências resultou em 18 sequências em regiões conservadas do genoma viral (Tabela 01). Na seguinte etapa de seleção foram escolhidos apenas 5 alvos, limitando a um alvo por gene nas regiões conservadas. Os alvos selecionados foram levados para etapa final, esta que teve com intuito de realizar a verificação do match dos siRNAs com o genoma humano.
Tabela 1. siRNAs desenhados e selecionados 
	Região
	siRNA
	Gene
	1803-1825
	aGCtaCacTaGAAGAaATGaTGA
	pol
	1876-1898
	GAGCAATGaGcCaagtaacaaat
	pol
	1938-1960
	gccaaagaAaactTtAAgTGtTT
	pol
	2383-2405
	gGGAATTGGaGGtTTTATcAAAG
	pol
	2399-2421
	ATcAAAGTAAgACAgTATGAtcA
	pol
	4613-4635
	tCCcTAcAAtCCCCAAAGtCAaG
	vif
	4614-4636
	CCcTAcAAtCCCCAAAGtCAaGG
	vif
	4807-4829
	CAGAcaTACAaACtAAAgaATAC
	vif
	4813-4835
	TACAaACtAAAgaATACAAAAAC
	vif
	4827-4849
	TACAAAAACAaaTTacAAAAATt
	vif
	4930-4952
	GGCAGTaGTaATACAaGAAAtAg
	vif
	4944-4966
	AaGAAAtAgtGAcATAAAaGTAG
	vif
	5173-5195
	ggGAtGCTAaatTagtaaTAAcA
	vpr
	5176-5198
	AtGCTAaatTagtaaTAAcAaCA
	vpr
	5316-5338
	AtcTgtAtTAtTTTgATGTTTTT
	vpr
	5569-5591
	AgCTgTtAGAgGAgCTTAAgaat
	tat
	7975-7997
	gTgGAAAGaTaCCTaaagGATCA
	rev
	8084-8106
	atgagATtTGGgataACAtGACc
	rev
Tab. 1 - A seguinte tabela apresenta a região, sequência e o gene a qual cada um dos 18 siRNAs pertence. Estas passaram por um processo de alinhamento no programa UGENE.
Os 18 siRNAs selecionados passaram pelo filtro de 18 critérios determinados por Fakhr et al 2016, como descrito anteriormente. Na Tabela 2 é possível visualizar o sistema de pontuação utilizando os parâmetros já descritos.
	siRNA sequence
	Program
	mRNA Region
	1
	2
	3
	4
	5
	6
	7
	8
	9
	10
	11
	12
	13
	14
	15
	16
	17
	18
	Final
Punctuation
	tCCcTAcAAtCCCCAAAGtCAaG
	siDirect
	4613-4635 (vif)
	1
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	1
	1
	
	1
	1
	
	2
	2
	2
	2
	16
	ggGAtGCTAaatTagtaaTAAcA
	siDirect
	5173-5195 (vpr)
	1
	1
	1
	1
	1
	1
	
	
	1
	
	1
	1
	1
	1
	
	2
	2
	
	16
	AgCTgTtAGAgGAgCTTAAgaat
	siDirect
	5569-5591 (tat)
	1
	1
	1
	1
	
	1
	
	1
	
	
	1
	1
	1
	
	2
	2
	2
	2
	16
	gTgGAAAGaTaCCTaaagGATCA
	siDirect
	7975-7997 (rev)
	1
	1
	1
	1
	1
	1
	
	
	1
	1
	1
	
	1
	1
	
	2
	2
	2
	16
	aGCtaCacTaGAAGAaATGaTGA
	siDirect
	1803-1825 (pol)
	1
	1
	1
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	1
	
	1
	1
	2
	2
	2
	
	15
	gccaaagaAaactTtAAgTGtTT
	siDirect
	1938-1960 (pol)
	
	1
	1
	1
	
	1
	1
	
	1
	
	
	1
	1
	
	
	2
	2
	
	12
	TACAAAAACAaaTTacAAAAATt
	siDirect
	4827-4849 (vif)
	
	1
	1
	1
	
	1
	1
	
	
	
	
	1
	1
	
	
	2
	2
	
	11
	CAGAcaTACAaACtAAAgaATAC
	siDirect
	4807-4829 (vif)
	
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	1
	
	
	1
	1
	
	
	2
	2
	
	11
	GGCAGTaGTaATACAaGAAAtAg
	siDirect
	4930-4952 (vif)
	
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	1
	
	
	1
	1
	
	
	2
	2
	
	11
	AtcTgtAtTAtTTTgATGTTTTT
	siDirect
	5316-5338 (vpr)
	
	1
	1
	1
	
	1
	1
	
	
	
	
	1
	1
	
	
	2
	2
	
	11
	CCcTAcAAtCCCCAAAGtCAaGG
	siDirect
	4614-4636 (vif)
	
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	1
	
	
	
	1
	
	
	2
	2
	
	10
	GAGCAATGaGcCaagtaacaaat
	siDirect
	1876-1898 (pol)
	
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	1
	
	
	
	1
	
	
	2
	2
	
	10
	gGGAATTGGaGGtTTTATcAAAG
	siDirect
	2383-2405 (pol)
	
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	1
	
	
	
	1
	
	
	2
	2
	
	10
	TACAaACtAAAgaATACAAAAAC
	siDirect
	4813-4835 (vif)
	
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	
	
	
	1
	1
	
	
	2
	2
	
	10
	AaGAAAtAgtGAcATAAAaGTAG
	siDirect
	4944-4966 (vif)
	
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	
	
	
	1
	1
	
	
	2
	2
	
	10
	atgagATtTGGgataACAtGACc
	siDirect
	8084-8106 (rev)
	
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	
	
	
	1
	1
	
	
	2
	2
	
	10
	AtGCTAaatTagtaaTAAcAaCA
	siDirect
	5176-5198 (vpr)
	
	1
	1
	1
	
	1
	
	
	
	
	
	
	1
	
	
	2
	2
	
	9
Tabela 2. siRNAs desenhados e selecionados
Tabela de seleção dos siRNAs utilizando critérios descritos no artigo de Fakhr et al 2016.
A seleção dos siRNAS foi feita baseando-se nomaior valor da pontuação final e o alinhamento, e comparação entre os siRNAs escolhidos com as sequências de todos os países através da plataforma UGENE. Vale ressaltar que a repetição do processo de alinhamento foi realizada a fim avaliar a conservação daquela região a qual todos os siRNAs que compreendiam de uma alta pontuação estavam. Somente uma sequência de cada gene que atendeu os critérios foi selecionada para a etapa seguinte. Selecionando apenas siRNA por gene e limitando a 5 sequências, destas 18 sequências avaliadas, as que com os padrões estabelecidos pertenciam aos seguintes genes e regiões: vif (4613-4635), vpr (5173-5195), tat (5569-5591), rev (7975-7997) e pol (1803-1825).
Para o processo final foi realizado o Blastn, a fim verificar se estes siRNAS não possuíam compatibilidade com o genoma humano. Aqueles que não possuíram determinado match com o genoma humano foram escolhidos para discussão final. O match máximo determinado para esta pesquisa foi de 30% com o genoma humano. 
Os dados obtidos pelo Blastn mostraram que os siRNAS não tinham confluência com o genoma humano, visto que os valores de significância apresentados pelas 5 sequências possuíam uma alta compatibilidade com o genoma do HIV-1. Este processo demonstrou que a projeção destes siRNAS apresentavam poucos efeitos fora do alvo, entregando uma boa especificidade para com os genomas do HIV-1 e uma boa estabilidade devido ao preenchimento dos critérios avaliativos já descritos anteriormente (Fig. 2). 
Figura 2. Processo de Blastn realizado na plataforma do NCBI.
EXCLUSÃO DOS SIRNAS REMANESCENTES 
Nos resultados apresentados também foi possível observar que os cinco siRNAS que passaram pelo processo de blastn possuíam alta compatibilidade com os genomas completos de diversas variantes de HIV-1, principalmente os genomas dos EUA. Cada um dos siRNAs que passaram pelo processo de blastn pertencem a um gene (vif, vpr, tat, rev e pol) do genoma completo do vírus de alguns países, sendo assim, os 5 siRNAs atuando conjuntamente resultam em uma maior eficiência na neutralização das funções gênicas. 
Além disto, outros siRNAs que foram desenhados e não passaram por todos os critérios propostos, mas obtiveram uma boa pontuação no rank (Tabela 2) de sequência apresentavam potencial para atuação em sua região e gene. No entanto, o pente fino realizado determinava que somente uma sequência por gene deveria ser selecionada, limitando a 5 o número total de sequências. Ao serem avaliadas, as sequências que tinham boas pontuações, mas pertenciam ao mesmo gene de outras que estava ao nível semelhante ou superior no rank foram excluídas da última parte. 
GENOMA VIRAL E siRNAS
	O desenho destes siRNAS foram projetados para atuar em cada um dos genes do HIV-1 descritos anteriormente. A seleção dos alvos destas sequências ainda possui um motivo a ser discutido, haja vista que esta exclusão criteriosa não mensura o potencial terapêutico destas escolhas. 
Desde o início do projeto, os siRNAs foram escolhidos para atuar em alguma parte do processo do ciclo de replicação do vírus, alguns deles para inibir a infectividade viral, atenuar o processo de replicação do vírus. Além de conseguir reduzir a influência das taxas de mutação durante a síntese de DNA viral, abrandar efeitos patogênicos do vírus, conter a liberação eficiente de partículas de vírus de células infectadas, dentre outros.
 
Mediante a isto, visando uma maior eficiência nestes alvos, a seleção cinco sequências que atuem em genes diferentes foi a melhor escolha para um bom resultado terapêutico. Atuando em conjunto, cada uma das sequências pode realizar o processo de interferência na fase pós-transcricional do HIV-, estas cinco sequências possuem uma vantagem ainda maior na hora da entrega de uma terapia eficiente contra o vírus, quando comparadas a uma terapia utilizando uma única sequência ou alvo.
CONCLUSÃO
Os resultados apresentados pelo processamento dos siRNAs demonstravam que sequências desenhadas possuem uma boa atuação no alvo, quando vistos através dos critérios predispostos durante a pesquisa. Assim tornando-se excelentes opções para estudos in vitro para possível uso terapêutico no futuro. No entanto, ressalta-se que os alvos ainda necessitam de predição de ligação do siRNAs fora dos alvos escolhidos.
REFERÊNCIAS 
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4. SILVEIRA, Alexsander Augusto da. Caracterização da Diversidade Genética do HIV-1 em pacientes do Estado do Mato Grosso do Sul. 2007. Dissertação (Mestrado na área de concentração de imunologia) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, 2007.
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6. BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Manual técnico para o diagnóstico de infecções pelo HIV em adultos e crianças. Disponível em: <http://www.aids.gov.br/pt-br/node/57787>; 2018; Acesso em: 24/05/2021.
7. CARVALHO, Patrícia Paiva et al. Fatores associados à adesão à Terapia Antirretroviral em adultos: revisão integrativa de literatura. Ciência & Saúde Coletiva [online]. 2019, v. 24, n. 7
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interference against cellular targets of HIV infection. Mol Biotechnol. 2007;37(3):225-236. 
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 BENNASSER Y, Yeung ML, Jeang KT. RNAi therapy for HIV infection: principles and practicalities. BioDrugs. 2007;21(1):17-22. 
2 BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Aids: etiologia, clínica, diagnóstico e tratamento Unidade de Assistência. Disponível em < https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/Aids_etiologia_clinica_diagnostico_tratamento>; 2003; Acesso em: 27/04/2021.
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4 BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Manual técnico para o diagnóstico de infecções pelo HIV em adultos e crianças. Disponível em: <http://www.aids.gov.br/pt-br/node/57787>; 2018; Acesso em: 24/05/2021.
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5 FAKHR, E., Zare, F. & Teimoori-Toolabi, L. Projeto de siRNA preciso e eficiente: um ponto-chave no silenciamento de genes competentes. Cancer Gene Ther 23, 73–82 (2016).
6 FIRE A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998. 
7 FRANÇA, Natália Regine de et al. Interferência por RNA: uma nova alternativa para terapia nas doenças reumáticas. Rev. Bras. Reumatol., São Paulo, v. 50, n. 6, p. 695-702, Dec. 2010.
8 HULO C, de Castro E, Masson P, Bougueleret L, Bairoch A, Xenarios I, Le Mercier P. ViralZone: a knowledge resource to understand virus diversity. Nucleic Acids Res. 2011.
9 MANO, Danielle de Macedo. Desenvolvimento e caracterização de sistemas de liberação tópica a base de cristais líquidos com vitamina E TPGS para veiculação de siRNA na terapia gênica. 2012. Dissertação (Mestrado em Medicamentos e Cosméticos) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2012.
10 MENCK, Carlos Frederico Martins. A nova grande promessa da inovação em fármacos: RNA interferência saindo do laboratório para a clínica. Estud. av., São Paulo , v. 24, n. 70, p. 99-108, 2010.
11 OPAS - Organização Pan-Americana da Saúde. HIV/AIDS. Dados estatísticos nas américas. Disponível em: <https://www.paho.org/pt/topicos/hivaids>; 2020; Acesso em 09/11/2021.
12 SANTOS, Norma Suely de Oliveira, ROMANOS, Maria Teresa Villela, WIGG, Marcia Dutra. – Virologia humana. 3. ed. – Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2015.
13 SILVEIRA, Alexsander Augusto da. Caracterização da Diversidade Genética do HIV-1 em pacientes do Estado do Mato Grosso do Sul. 2007. Dissertação (Mestrado na área de concentração de imunologia) - Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, 2007.
14 UNAIDS. BRASIL. Estatísticas. Disponível em: <https://unaids.org.br/estatisticas/>; 2020; Acesso em: 09/03/2021.
15 ZHANG J, Wu YO, Xiao L, Li K, Chen LL, Sirois P. Therapeutic potential of RNA
interference against cellular targets of HIV infection. Mol Biotechnol. 2007;37(3):225-236.
ANEXO A
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Política e padrões de submissão de artigos
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1. Estrutura
Os artigos consistirão nas seguintes seções:
· TÍTULO
· RESUMO
· PALAVRAS-CHAVE
· INTRODUÇÃO
· CORPO PRINCIPAL
· CONCLUSÕES
· REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
O RESUMO, do tipo informativo, consistirá em um único parágrafo redigido em estilo impessoal. Contém os objetivos do estudo, os métodos utilizados e uma breve descrição dos principais resultados e conclusões. Esses conteúdos serão incluídos implicitamente no parágrafo, não destacados em títulos separados. O Resumo não terá mais de 250 palavras.
Três a dez PALAVRAS-CHAVE ou FRASES serão incluídas para facilitar a indexação do artigo. Os autores devem certificar-se de que as palavras-chave ou frases selecionadas podem ser encontradas na lista de descritores em ciências da saúde. Isso pode ser verificado consultando o DeCS .
A INTRODUÇÃO incluirá o referencial teórico do estudo, bem como uma referência clara à contribuição que se pretende transmitir (questões a serem respondidas ou hipóteses consideradas, quando pertinentes). O objetivo do estudo será declarado no final desta seção.
O CORPO PRINCIPAL terá uma estrutura flexível dependendo do tipo de comunicação e desde que sejam cumpridas as regras elementares de coerência. Pode ser dividido em subseções, se o autor assim o desejar. Subseções podem ser MÉTODOS e RESULTADOS se necessário, mas tal estrutura não será obrigatória, uma vez que muitos artigos teóricos, conceituais, de reflexão, de revisão ou didáticos não se ajustam a essa estrutura clássica, aplicável a artigos de pesquisa baseados em dados empíricos obtidos pelo pesquisador.
As CONCLUSÕES derivarão do próprio artigo (ocasionalmente serão incluídas algumas afirmações que são precisas, mas não derivam do estudo realizado) e não repetirão os resultados alcançados, mas serão desenvolvimentos genuínos que sintetizam os resultados obtidos pelo estudo. As referências bibliográficas não aparecerão nesta seção. As conclusões não serão marcadas.
AS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS seguirão os Requisitos Uniformes para Manuscritos Submetidos a Revistas Biomédicas e serão numeradas na mesma ordem em que aparecem no texto.
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