Relatório Aula Pratica 2 - AC II

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Relatório aula prática II
Análises Clínicas II
NOME: Helena Haydée Rezek de Sá Pereira Cossiello		RA: 2646913
NOME: Larissa Lisum Cavasini Fernandes				RA: 2161499
NOME: Janeslay Suellen Silva 					RA: 2507630
NOME: Simone Grazziotin Foss 					RA: 1848648 
NOME: Karina Silva 						RA: 1792087
1) Materiais e equipamentos: 
· Jaleco;
· Luvas de procedimento;
· Álcool 70%;
· Álcool éter;
· Papel toalha;
· Algodão;
· Luvas de Procedimento;
· Material biológico (bactérias já semeadas);
· Bico de Bunsen;
· Fósforo;
· Alça microbiológica calibrada 1 µL;
· Agulha de inoculação;
· Ágar Manitol (meio de cultura);
· Ágar Muller Hinton (meio de cultura);
· Solução salina;
· Estante;
· Estufa Microbiológica;
· Lâminas;
· Suporte coloração de gram;
· Corantes da coloração de gram;
· Garra de madeira;
· Macroscópio;
· Óleo de imersão;
· Pipeta Pasteur;
· Peróxido de hidrogênio 3% (para prova da catalase);
· Sangue de coelho (para prova da coagulase);
· Disco de novobiocina (para prova da novobiocina); 
· Pinça;
· Swab estéril;
· Solução de cloreto de bário e solução de ácido sulfúrico - inóculo Mac Farland - (para prova da novobiocina);
· Caneta permanente para vidro;
2) Procedimentos: 
2.A) Esfregaço bacteriano e coloração de gram:
Para iniciarmos, realizamos a desinfecção da bancada com álcool 70% de forma circular para desinfectar e no método varredura, para eliminar esporos.
Após a desinfecção, acendemos o bico de Bunsen na chama azul. Em seguida, em silêncio, esterilizamos a alça de semeadura, flambando o equipamento na chama e adicionamos a solução salina a 0,9% na lâmina. Flambando novamente a alça, esperando esfriar para não matar as colônias e, na sequência coletamos a amostra de bactérias já crescidas no meio de cultura, adicionando na lâmina e homogeneizando com a solução salina. Passamos a lâmina na chama 3 vezes para fixar o esfregaço. 
Com o esfregaço bacteriano em mãos, passamos para o processo de coloração de Gram, método que servirá para a identificação da bactéria como gram-positiva ou gram-negativa. No suporte de coloração, coramos a lâmina com Cristal Violeta, por 1 minuto. Depois lavamos em água corrente, na sequência, usamos o Lugol por mais 1 minuto. Novamente, passamos em água corrente. Usamos o descorante com álcool-acetona por 15 segundos. Lavamos a lâmina em água corrente. Por último, colocamos corante Fucsina por 30 segundos. Lavamos novamente e esperamos a lâmina secar. Caso core de rosa, sabemos que são bactérias bacilos gram-negativos.
Para concluir esse processo, pingamos uma gota de óleo de imersão e observamos a bactéria no microscópio, num aumento de 1000x. Para finalizar, limpamos a lente do macroscópio com álcool éter e algodão para desinfectar.
2.B) Prova da catalase: 
Acender o bico de Bunsen. 
Próximo ao fogo, em uma lâmina, adicionar uma gota de Peróxido de hidrogênio (H²0²), flambar a alça de semeadura, aguardar esfriar, coletar uma amostra de bactéria e homogeneizar na lâmina em leves movimentos circulares. 
Se a reagir formando bolhas, é catalase positiva.
 2.C) Prova da coagulase: 
	Com o bico de Bunsen ligado, sempre próximo a chamas, adicionar uma gota na lâmina de solução salina, flambar a alça de semeadura, agregando a colônia de bactéria, homogeneizando delicadamente em movimentos circulares.
Na sequência, adicionar uma gota de plasma (sangue de coelho) misturando novamente. Inclinar a lâmina levemente, para frente e para trás. Em segundos, podemos analisar, verificando a presença de aglutinação do fibrinogênio para coagulase positiva. Em caso de negativo, refazer a prova no tubo para ter certeza de que não é coagulase livre.
2.D) Prova do manitol
Para essa prova, utilizamos a técnica de semeadura por esgotamento.
Com a alça de semeadura flambada e fria, inoculamos uma colônia no meio de cultura MacConkey, em seguida realizar a primeira estria no ágar manitol. Girar a placa, flambar a alça e esfriá-la novamente, carregando a segunda estria no mesmo ágar. Girar e repetir o processo, carregando uma terceira estria. O intuito é carregar uma menor quantidade de amostra até o final para obter colônias isoladas, possibilitando a identificação dos microrganismos que crescem neste meio. 
Incubamos a placa inoculada por 24 horas. 
2.E) Prova da novobiocina (catalase + e coagulase -): 
· Padronizar o inóculo na escala 0.5 MacFarland;
· Semear com swab dentro 15 minutos;
· Esperar 15 min para absorção do inoculo; 
· Colocar o disco de antibiótico novobiocina;
· Incubar a 35-36°C/ 20-24h;
· Realizar a leitura do halo de inibição após 16-24h. 
Inoculamos a bactéria em 108 UFC em um tubo com solução salina, obedecendo sempre os mesmos critérios de esterilização da alça de semeadura, homogeneizando até alcançar turbidez comparada a escala 0.5 MacFarland (Solução de bário com Ácido sulfúrico).
Mergulhamos um swab estéril na solução para dar início ao processo de semeadura por antibiograma. 
No meio de cultura Agar Muller Hinton, fazemos um risco central com o swab e em seguida, realizar estrias unidas ao longo da placa, de ponta a ponta. Repetimos em direção contraria e finalizamos passando o swab por todo o contorno na placa.
Aguardar 15 minutos para as bactérias serem bem absorvidas no meio de cultura, flambar a pinça, abrir o frasco de Novobiocina, flambar, retirar apenas um disco, flambando a boca do frasco e fechá-lo. Inserir o disco delicadamente sobre o ágar. (Observação: Não mover o disco, apenas pressionar com delicadeza para aderir ao ágar. Á partir do momento em que o disco entra em contato com o ágar ele inicia a difusão do antibiótico).
Mantendo a atenção neste procedimento para não estender e ultrapassar dos 20 minutos, antes que haja o crescimento do número de bactérias e comprometa o experimento. 
2.F) Prova da oxidase (somente para bacilos Gram negativos).
Não foi realizado essa prova em laboratório.
3) Resultados: 
3.A) Desenhe a bacterioscopia: 
3.B) Resultados prova da catalase, coagulase e manitol.
Catalase +
Coagulase +
Manitol (Não coletamos o resultado)
3.C) Leitura prova novobiocina: Medir o diâmetro do halo de inibição: 
- S. saprophyticus: Resistente (halo de inibição menor ou igual a 16mm ou S. epidermidis: Sensível (halo de inibição maior ou igual a 16mm). 
Não foi possível visualizar o resultado pelo tempo de incubação no laboratório.
3D) Leitura prova da oxidase:	
Prova não realizada em laboratório por falta de material