Apostila de Microbiologia - prática

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FACULDADE ESTÁCIO DO AMAZONAS 
ESTÁGIO EM MICROBIOLÓGIA 
Preceptor: Prof. Felipe Silva de Souza, celular: (92) 98152-3250 – 
E-mail: felipessbiomedico@gmail.com 
 
 
NORMAS DE SEGURANÇA PARA AS AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA 
 
É indispensável o uso de jaleco no laboratório. O mesmo deve ser comprido, de 
mangas compridas e estar abotoado; 
Não comer (inclusive balas e chicletes), beber e fumar no laboratório; 
O material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe 
das bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho 
prático, como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; 
Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, 
ferimentos, aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico 
responsável pela aula prática; 
Descarte de material: 
a) Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos 
laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; 
b) Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; 
c) Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; 
d) Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. 
Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes 
 
Terminados os trabalhos práticos: 
a) Esterilizar alças e fios de platina; 
b) Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; 
c) Desligar lâmpadas e microscópios; 
d) Limpar microscópios e cobri-los com a capa; 
e) Tirar o jaleco e guardar; 
f) Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico. 
 
NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA 
Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como 
também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. 
 
Técnica de semeadura 
Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo 
mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos 
presentes no ambiente, e evitar acidentes laboratoriais. 
1. Flambagem da alça ou fio de platina: 
Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer 
operação de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do 
cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. A posição correta para a flambagem 
da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho (Figura 1). 
Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material, 
seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura, esfriar previamente a alça. Esta 
deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri; 
 
 
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Figura 1- Posição correta para a flambagem da alça 
 
2. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca 
dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). Esta 
deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo, da mão que está segurando a alça (Figura 
2). Após a retirada do material com a alça, flambar novamente a boca do tubo e colocar 
a tampa. Não pousar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso; 
 
 
Figura 2 – Removendo o tampão de algodão 
 
3. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas, são oferecidas 
embrulhadas em papel (às vezes, dentro de um cilindro metálico). Para uso, torcer o 
papel na região central da pipeta, retirar primeiramente o papel da parte superior e depois 
a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). Esta seqüência evite que a pipeta seja 
contaminada pelas mãos do operador. Uma vez utilizada, a pipeta deve ser colocada 
dentro de uma cuba contendo solução desinfetante. 
4. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar 
contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em 
estufas com a tampa voltada para baixo. 
5. Na semeadura usando placas de Petri, após flambar a alça até o rubro, e introduzi-la 
na cultura de bactéria, semear na placa de Petri (fig.3). 
 
 
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Figura 3 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias 
 
6. Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e puxar 
nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 4). Essa técnica é 
conhecida também por esgotamento. 
7. As placas serão incubadas a 35/37˚C por 24h, e depois guardadas a 4˚C (quando não 
puderem ser analisadas imediatamente após o período de incubação). 
 
 
Figura 4 – Semeadura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no 
isolamento de colônias 
 
Não esqueça!!!!!! 
Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo, ou num 
pedaço do ágar sem cultura), antes de colocar a alça em contato com a cultura, lembre-
se: ela está muito QUENTE!!! 
Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma, sempre invertida. 
 
 
 
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ATIVIDADE 1 - Apresentação do laboratório de Microbiologia e semeadura de 
bactérias em meio sólido e líquido 
 
 
OBJETIVOS 
Reconhecer os principais equipamentos e vidrarias utilizadas no laboratório de 
Microbiologia; Fazer semeaduras em meios líquido e sólido de culturas de bactérias e 
obter colônias isoladas; 
 
MATERIAL 
Alça de platina; 
Tubos de ensaio com meio líquido 
Placas de Petri com meio sólido; 
Tubos de ensaio com culturas de bactérias 
 
PROCEDIMENTO 
- Limpar a bancada; 
- Identificar os tubos e placas; 
- Flambar a alça de platina e esperar esfriar próxima ao bico de Bunsen; 
- Inserir a alça de platina no tubo contendo as bactérias; 
- Abrir a placa próximo à chama e semear as bactérias pela técnica de esgotamento com 
estrias. Após a 1ª estria, flambar a alça (esperar esfriar), virar a placa e começar a 2ª 
estria. 
Repita o procedimento para a 3ª estria. 
- Fechar a placa; 
- Flambar a alça. 
- Acondicionar as placas e tubos na estufa a 35 ºC por 24 horas com a parte de baixo 
voltada para cima. 
 
ATIVIDADE 2 e 3 – Teste de sensibilidade à antimicrobianos (TSA) 
 
Antibiogramas são bioensaios conduzidos in vitro que visam testar a sensibilidade de 
bactérias aos antimicrobianos. Estes testes são utilizados para avaliar in vitro a atividade 
de novos agentes, e auxiliar no mapeamento da emergência de bactérias resistentes. A 
suscetibilidade antimicrobiana pode ser reportada qualitativamente como sensível, 
intermediário ou resistente; ou quantitativamente em termos de MIC (minimun inhibitory 
concentration) ou MBC (minimun bactericidal concentration). 
 
1- Teste Quantitativo da sensibilidade aos antimicrobianos: Método de diluição: 
consiste em preparar sucessivas diluições dos antibióticos em meio sólido ou líquido e em 
seguida semear a bactéria em estudo. Após incubação determina-se MIC e/ou MBC. 
2- Método de difusão de Bawer e Kirk (modificado pela FDA): é um teste qualitativo, 
no qual discos de papel impregnados com o antibiótico são colocados na superfície do 
ágar uniformemente semeado com o microrganismo. A droga se difunde no ágar e produz 
inibição do agente sensível, formando um halo de inibição que deve ser medido e 
comparado com tabelas padronizadas. Para a garantia desta técnica, alguns fatores são 
essenciais: 
Meio de Cultura: normalmente é utilizado o meio Muller-Hinton, que se caracteriza por 
ser um meio enriquecedor e com ausência de substâncias antagônicas; 
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E-mail: felipessbiomedico@gmail.comCultura Bacteriana: o teste deve ser realizado com cultura pura de bactérias, devendo-
se realizar a coloração de Gram. A densidade do inóculo deve corresponder a turbidez 0,5 
na escala padrão de turbidez (Escala de Mac-Farland). 
 
OBJETIVOS 
Determinar a sensibilidade de uma bactéria frente a antimicrobianos para a escolha da 
droga mais adequada no tratamento de uma doença. Interpretar um antibiograma. 
 
MATERIAL 
“Swab” estéril; 
Tubos de ensaio 
Pipetas de 1 mL 
Placas de Petri com ágar Mueller-Hinton 
Pinças 
Papel de filtro com antibióticos 
 
PROCEDIMENTO 
- Limpar a bancada e identificar os tubos e placas; 
- Agitar o tubo contendo cultura em meio líquido e realizar diluições para que 
concentração final seja próxima à escala 0,5 de Mac Farland (~ 108 ufc) com auxílio das 
pipetas, uma para cada diluição; 
- Introduzir nas culturas um “swab” estéril, retirar o excesso de líquido comprimindo a 
ponta do “swab” nas paredes do tubo; 
- Espalhar o conteúdo do “swab” sobre o meio de cultura sólido distribuído numa placa de 
Petri. Espalhar bem, de modo a obter um “tapete” de bactérias em toda a superfície do 
meio sólido; 
- Esperar a cultura sobre o agar secar bem ( 2 minutos); 
- Colocar os discos de papel contendo os antibióticos sobre a cultura seca (usar pinças); 
- Incubar em estufa a 35 ºC por 24 horas; 
- Medir os halos formados (em mm) e registrar os dados obtidos. 
 
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ATIVIDADE 4 – PESQUISA DE BACILO ÁLCOOL - ÁCIDO RESISTENTE – BAAR 
 
FUNDAMENTO 
 
O diagnóstico das Micobactérias patogênicas (Mycobacterium tuberculosis e 
Mycobacterium leprae), por bacterioscopia direta é feito através dos métodos de 
coloração de Ziehl-Neelsen e de Kinyoun, os quais utilizam a característica destas 
bactérias de possuírem paredes celulares com alto teor de lipídeos (cerca de 60%, 
principalmente de Ácido micólico), que quando tratadas pelo corante Fucsina 
fenicada, coram-se de vermelho e persistem ao descoramento subseqüente por 
uma solução de Álcool-ácido forte (diferenciador). É por isto que são conhecidas 
por Bacilos Álcool-Ácido Resistentes (BAAR). As outras bactérias, que não 
possuem tais paredes celulares ricas em lipídeos, têm a sua coloração pela 
Fucsina descorada pela solução de Álcool-ácido e coram-se em azul pela 
coloração de fundo do Azul de metileno (contra-corante). 
 
METODOLOGIAS DE COLORAÇÃO 
 
 MÉTODO DE COLORAÇÃO À QUENTE – MÉTODO DE ZIEHL-NEELSEN 
 
1. Preparar um esfregaço homogêneo, delgado e identificado em uma lâmina nova 
desengordurada, limpa e seca; 
2. Deixar secar à temperatura ambiente; 
3. Fixar o material do esfregaço passando 3 a 4 vezes pela chama do bico de 
Bunsen; 
4. Cobrir a totalidade da superfície do esfregaço com solução de Fucsina fenicada, 
previamente filtrada ou filtrado sobre a lâmina no momento da coloração; 
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5. Deixar agir por cerca de 5 minutos, aquecendo brandamente utilizando algodão 
umedecido em álcool ou com a chama do bico de Bunsen, passando lentamente 
por baixo da lâmina, até que se produza emissão de vapores e, quando estes são 
visíveis, cessar o aquecimento. Repetir essa operação até completar três 
emissões sucessivas. Evitar a fervura e secagem do corante (adicionar mais 
corante, se preciso, dentro deste período para evitar que a lâmina seque porque o 
esfregaço precisa estar coberto permanentemente durante o aquecimento.). Este 
aquecimento deve ser intermitente, pois é importante manter a solução aquecida 
durante o tempo previsto; 
6. Lavar em água corrente para eliminar a Fucsina. Toma-se a lâmina pelo extremo 
numerado, inclinar para frente e lavar deixando cair um jato d’água de baixa 
pressão sobre a película corada, de maneira que essa não se desprenda; 
7. Cobrir toda a superfície do esfregaço com a solução de Álcool-ácido. Tomar a 
lâmina entre o polegar e o indicador e fazer um movimento de vai-e-vem, de 
modo que o Álcool-ácido vá descorando suavemente a Fucsina. Se o esfregaço 
estiver ainda com a cor vermelha ou rosada, descora-se novamente. Considera-
se descorado o esfregaço, quando suas partes mais grossas conservarem 
somente um ligeiro tom rosado. Essa operação dura, em geral, dois minutos; 
8. Terminada a fase de descoloração e eliminado o Álcool-ácido, lavar a lâmina da 
mesma forma como se procedeu depois da coloração com a Fucsina, com 
cuidado para não desprender a película; 
9. Cobrir toda a superfície do esfregaço com solução de Azul de metileno durante 30 
segundos a 1 minuto; 
10. Lavar, da mesma forma como se indicou para a Fucsina, tanto o esfregaço como 
a parte inferior da lâmina; 
11. Colocar a lâmina com o esfregaço para cima, sobre o papel limpo, para secar à 
temperatura ambiente ou estufa a 35º C; 
12. Observar ao microscópio com objetiva de imersão (100 x). 
 
TABELA DE INTERPRETAÇÃO DO RESULTADO DA BACTERIOSCOPIA 
PARA BAAR: 
 
A leitura deve ser feita no mínimo em cem campos microscópios, o que 
corresponde, aproximadamente, a leitura de uma linha reta que vai do extremo, 
onde está a numeração, até o extremo oposto, isso corresponde aproximadamente 
a mais ou menos 5 minutos de observação. Recomenda-se: um intervalo de 10 
minutos de descanso para cada dez lâminas lidas e utilizar um desenho 
quadriculado para ir anotando o número de bacilos encontrados em cada campo 
microscópio e o resultado deve ser informado em número de cruzes segundo as 
normas do Ministério da Saúde em vigor. 
 
Manual de Bacteriologia da Tuberculose – Ministério da Saúde / FNS / CENEPI / 
CNPS / Centro de Referência Prof. Hélio Fraga – 2ª Edição Revisada e Ampliada – 
1994. 
 
 
 
 
Número Total de Campos 
Observados 
Número de bacilo álcool-
ácido resistente 
Resultado 
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observados por campo 
100 Não foram encontrados Negativo 
100 Menos de 1 BAAR por 
campo 
Positivo (+) 
50 De 1 a 10 BAAR por 
campo 
Positivo (++) 
20 Mais de 10 BAAR por 
campo 
Positivo (+++) 
 
Observação: 
Nos casos de diagnóstico, ao encontrar de 1 a 4 bacilos em 100 campos 
observados, deve-se ampliar a leitura para mais 100 campos. Se a quantidade de 
bacilos encontrados depois de observar os 200 campos se mantiver entre 1 a 4 
bacilos, informar o resultado como “NEGATIVO“ e solicitar nova amostra. Se nos 
materiais subseqüentes deste paciente persistir a negatividade, proceder a cultura. 
 
1. CAUSAS DE ERROS NO EXAME MICROSCÓPIO DIRETO DE ESCARRO: 
 
1.1. Amostra insuficiente em quantidade e qualidade; 
1.2. Identificação inadequada no pote/frasco. Não deve colocar a identificação na tampa, 
e sim no corpo do pote/frasco; 
1.3. Área de trabalho inadequada ou mal iluminada; 
1.4. Troca das lâminas por falta de procedimento no trabalho; 
1.5. Processamento de uma série muito grande de amostras simultaneamente; 
1.6. Esquecer de misturar os escarros se as eliminações são poucas e se estão 
separadas dentro do pote/frasco; 
1.7. Esfregaços muito espessos ou muito delgados; 
1.8. Uso de lâminas arranhadas ou que tenham sido utilizadas anteriormente – podem 
simular bacilos pela deposição de corantes nas ranhuras; 
1.9. Fucsina seca e cristalizada no fundo do frasco. Deve-se usar Fucsina recentemente 
filtrada e colocada em frasco bem lavado; 
1.10. Descuido no aquecimento da Fucsina (método de Ziehl-Neelsen), permitindo que 
seque e cristalize no esfregaço; 
1.11. Descoramento insuficiente das lâminas pode deixar corados em vermelho outros 
bacilos, que assim confundem com o BAAR; 
1.12. Tempo de descoramento muito prolongado pode levar ao descoramento do BAAR; 
1.13. Não revisar a numeraçãodas lâminas ou não identificar se apagar o número durante 
a coloração; 
1.14. Não limpar a lente de imersão depois de cada exame positivo; 
1.15. Existência de bacilos no óleo de imersão devido ao mau costume de tocar o 
esfregaço com o conta-gotas do frasco; 
1.16. Anotação errada do resultado na folha de trabalho diário; 
1.17. Transcrição errada da planilha de trabalho diário para o impresso a ser fornecido ao 
setor de laudo. 
 
 
 
 
ATIVIDADE 5 – Coloração de Gram 
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FIXAÇÃO E COLORAÇÃO DE MICRORGANISMOS 
A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios 
preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame 
microscópico direto de um microrganismo é comumente suplementado com exame 
microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a 
visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o microrganismo 
deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem 
na chama. Os corantes são sais compostos de um íon positivo e um íon negativo. Um 
desse íons, o que dá a cor, é chamado de radical cromóforo. Então, os corantes 
conhecidos como básicos tem a cor do seu íon positivo, enquanto que os ácidos tem a cor 
do seu íon negativo. A célula bacteriana é negativamente carregada, portanto atrai 
corantes básicos. Os corantes básicos mais comuns são: cristal violeta, azul de metileno 
e safranina. 
Existem inúmeros métodos para coloração. A introdução de colorações, no estudo dos 
microrganismos, veio a contribuir substancialmente com a Microbiologia, por quatro 
razões principais: 
Permitem uma visualização melhor das células, já que nas preparações sem corantes 
são reveladas apenas o contorno e a conformação dos arranjos; 
Permitem a caracterização de alguns componentes intracelulares; 
Podem levar à diferenciação entre os grupos de microrganismos e 
Podem, eventualmente, identificar alguns grupos. 
 
Quanto aos tipos de coloração temos: 
1) Coloração simples - cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das 
células mais visíveis. 
2) Coloração diferencial - nessa coloração o corante reage diferentemente com diferentes 
tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool - ácido resistente são exemplos de 
colorações diferenciais. 
3) Coloração especial - são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas 
dos microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas. 
 
No processo de coloração podem ser usadas substâncias que intensificam a cor por 
aumentarem a afinidade do corante com seu espécime biológico. Essas substâncias são 
chamadas mordentes, e é o caso do iodo na coloração de Gram. Uma outra função do 
mordente é tornar uma estrutura mais espessa e mais fácil de visualizar após a coloração. 
Esta coloração é o ponto de partida na identificação bacteriana, mas não deve nunca ser 
utilizada como um diagnóstico definitivo. É importante ressaltar que a coloração de Gram 
somente será um recurso rápido e útil, quando corretamente realizada e interpretada. 
 
OBJETIVOS 
Demonstrar a importância da coloração de Gram e sua técnica. 
Distinguir entre bactérias Gram (+) e Gram (-) bem como suas formas e arranjos. 
 
MATERIAL 
Alça de platina; 
Lâmina de vidro; 
Placa de Petri com cultura de microrganismo em meio sólido; 
Tubo de ensaio com cultura de microrganismo em meio líquído; 
 
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Cristal violeta a 1%; 
Lugol; 
Solução diferenciadora; 
Fucsina básica; 
 
PROCEDIMENTO: 
 
A. PREPARO DO ESFREGAÇO 
 
Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio líquido 
- Flambar a alça corretamente 
- Esfriá-la nas paredes do tubo 
- Introduzi-la no meio líquido de maneira que este forme um filme sobre a alça. 
- Colocar o material coletado sobre uma lâmina limpa e seca. 
- Espalhar o material sobre a lâmina, procurando obter um esfregaço fino. 
- Secar à tempetatura ambiente. 
- Fixar o esfregaço na chama do bico de Bunsen, passando a lâmina algumas vêzes pela 
chama. 
OBS. Esperar que o esfregaço esteja completamente seco para fixá-lo. 
- Realizar a coloração. 
Preparação do esfregaço para coloração de cultivos em meio sólido 
- Colocar com a própria alça, já flambada, uma gota de água de torneira no centro da 
lâmina de vidro. 
- Flambar novamente a alça 
- Esfriá-la na tampa da placa de Petri, ou no meio sólido numa região sem colônia. 
- Coletar uma pequena quantidade do crescimento bacteriano. 
- Homogeneizar este material com a gota de água, cuidando para obter uma suspensão 
pouco densa e sem grumos. 
- Secar a lâmina por exposição ao ar. 
- Fixar o esfregaço. 
 
B. COLORAÇÃO 
- Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. 
- Lavar rapidamente em água corrente; 
- Cobrir todo o esfregaço com lugol por 1 minuto; 
- Lavar rapidamente em água corrente; 
- Lavar uma ou duas vezes, rapidamente, com a solução diferenciadora: álcool ou 
acetona (10 a 15 segundos); 
- Lavar rapidamente em água corrente; 
- Cobrir todo o esfregaço com fucsina básica por 30 segundos; 
- Lavar novamente em água corrente; 
- Secar a lâmina, tomando o cuidado de não remover o esfregaço 
- Observar ao microscópio com objetiva de imersão. 
 
 
 
 
 
 
 
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ATIVIDADE 6 – Microscopia (morfologia das bactérias) 
 
 
 
 
 
ATIVIDADE 7 – Urocultura 
 
As infecções do trato urinário (ITU) estão entre as doenças infecciosas mais comuns na 
prática clínica, particularmente em crianças, adultos jovens e mulheres sexualmente 
ativas, sendo apenas menos freqüente que as do trato respiratório. A urocultura 
caracteriza-se basicamente pela investigação microbiológica da urina. Os microrganismos 
mais frequentemente envolvidos nas ITU incluem bactérias da família Entero- 
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bacteriaceae. O agente causal de ITU mais frequente é a Escherichia coli, a qual está 
associada a aproximadamente 80% de todas as ITUs ambulatoriais e também é 
responsável por uma grande porcentagem de infecções urinárias em pacientes 
hospitalizados. Outros membros desta família que também são geralmente encontrados 
como agentes causais de ITU incluem Klebsiella, Proteus e Enterobacter. Enterococcus 
faecalis e Pseudomonas aeruginosa. Staphylococcus saprophyticus é uma causa 
conhecida de ITU em mulheres, com contagens de colônias geralmente inferiores a 105 
UFC/mL de urina. 
A técnica da urocultura consiste basicamente no isolamento, identificação e quantificação 
de bactérias na urina (bacteriúria) que poderá indicar uma ITU. 
 
OBJETIVO 
Isolar bactérias, quando presentes, de amostras de urina; 
Fazer contagem das unidades formadoras de colônia (UFCs) das bactérias isoladas; 
 
MATERIAIS 
Placa de Petri com ágar EMB e ágar sangue 5% 
Lâminas de vidro 
Coloração para Gram 
Alça de platina 
 
PROCEDIMENTO 
- Transferir uma gota da urina para uma lâmina de vidro e esperar secar temperatura 
ambiente. 
Prosseguir à coloração de Gram. 
- Limpar a bancada para inoculação das amostras. 
- Retirar uma alçada da amostra e depositar a amostra em um canto da placa e realizar 
estrias. 
Repita o procedimento em outra placa com ágar. 
- Feche a placa e leve à estufa a 35 °C por 24 horas. 
- Observar o crescimento bacteriano. Caso tenha crescimento, realizar o procedimento 2. 
 
ATIVIDADE 8 -9 – Análise microbiológica da água 
 
A água potável não deve conter microrganismos patogênicose deve estar livre de 
bactérias indicadoras de contaminação fecal. Os indicadores de contaminação fecal, 
tradicionalmente aceitos, pertencem a um grupo de bactérias denominadas coliformes. O 
principal representante desse grupo de bactérias chama-se Escherichia coli. A Portaria nº 
518/2004 do Ministério da Saúde estabelece que sejam determinados, na água, para 
aferição de sua potabilidade, a presença de coliformes totais e termotolerantes de 
preferência Escherichia coli e a contagem de bactérias heterotróficas. A mesma portaria 
recomenda que a contagem padrão de bactérias não deve exceder a 500 Unidades 
Formadoras de Colônias por 1 mililitro de amostra (500/UFC/ml). 
O exame bacteriológico da água é feito através de dois processos: Contagem de 
bactérias heterotróficas viáveis na água e determinação ou estimativa do número de 
bactérias coliformes. A técnica do número mais provável (NMP) consiste no exame de 
uma série de tubos onde foram inoculados volumes diferentes de amostra. O valor obtido 
resulta da consulta da tabela que foram estimuladas com base em fórmulas de 
probabilidade. 
 
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OBJETIVOS 
- Aprender os princípios básicos da análise microbiológica de água. 
- Interpretar possíveis contaminações na água analisada. 
 
Parte 1 - Teste presuntivo 
 
MATERIAIS 
Tubos de Durhan 
Pipetas de 10 mL, 1 mL e 0,5 mL 
Tubos de ensaio com Caldo LST de concentração simples e dupla 
 
PROCEDIMENTO 
- Limpar a câmara de fluxo e identificar os tubos distribuindo-os de 5 em 5 (diluição 1:1, 
1:10, 1:100). 
- Nos primeiros 5 tubos (contendo 10 mL de caldo LST de concentração dupla) inocular 
com pipeta esterilizada, 10 ml da amostra de água e homogeneizar. (1:1) 
- Nos próximos 5 tubos, (contendo 9 mL de caldo LST de concentração simples) inocular 
1 ml da amostra de água e homogeneizar. (1:10) 
- Nos 5 últimos tubos (contendo 9,9 mL de caldo LST de concentração simples) inocular 
0,1 ml da amostra de água e homogeneizar. (1:100) 
- Incubar a 35 ºC durante 24 horas. Se no final de 24 horas, houver a formação de gás 
dentro do tubo de Durhan, significa que o teste presuntivo foi positivo. Neste caso, fazer o 
teste confirmativo. Se não houver a formação de gás durante o período de incubação, o 
exame termina nesta fase e o resultado do teste é considerado negativo. 
 
 
 
 
Parte 2 - Teste confirmativo para coliformes totais 
 
PROCEDIMENTO 
- Tomar o número de tubos do teste presuntivo que deram positivos (formação de gás) 
nas diluições 3 1:1; 1:10 e 1:100; 
- Tomar igual número de tubos contendo o meio de Caldo Verde Brilhante e identificar os 
tubos 
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- Com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo uma 
porção de amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio Verde Brilhante. 
Este procedimento chama-se repicagem; 
- Incubar durante 24 horas a 35 ºC; 
- Se no final do período de 24 horas houver a formação de gás dentro do tubo de Durhan 
o teste é considerado positivo. Caso não haja formação de gás, o teste é considerado 
negativo. 
 
Parte 3 - Cultivo das amostras positivas em meio sólido 
 
 
MATERIAL 
Alça de platina 
Placas de Petri 
Ágar EMB e ágar SS 
 
PROCEDIMENTO 
- Tomar o número de tubos do teste presuntivo que deram positivos (formação de gás) 
nas 3 diluições 1:1; 1:10 e 1:100; 
- Tomar a placa de Petri com o ágar EMB e SS já solidificados. 
- Com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo uma 
porção de amostra e inocular na placa correspondente. 
- Incubar durante 24 horas a 35 ºC 
 
ATIVIDADE 10 – Isolamento dos fungos filamentosos 
 
Consiste em retirar fragmentos da colônia-matriz e inocular em uma nova placa de Petri 
contendo meio de cultura. Essa técnica permite a visualização de características 
individiuais do fungo como a coloração, tempo de crescimento, formato da colônia, textura 
e extrutura, etc. 
 
PROCEDIMENTO 
- Selecionar, quais dos fungos crescidos em placa serão isolados; 
- Abrir cuidadosamente a placa e retirar um fragmento da colônia selecionada; 
- Inocular o fragmento em uma nova placa. Repetir o procedimento mais 2 vezes 
inoculando em dois pontos diferentes; 
- Examinar as placas de Petri com crescimento fúngico e anotar as características 
observadas (por exemplo: cor da colônia fúngica, aparência cotonosa, aveludada, 
crescimento intenso, moderado ou pequeno). 
 
ATIVIDADE 11 – Coprocultura 
 
O exame de fezes engloba as análises macroscópicas, microscópicas e bioquímicas para 
pesquisar possível presença de sangramento gastrointestinal, distúrbios hepáticos e dos 
ductos biliares e problemas de má-absorção, bem como a presença de parasitas e 
bactérias patogênicas. 
A coprocultura, em linhas gerais, consiste em semear uma alçada de fezes em meios 
específicos a fim de possibilitar o crescimento de bactérias causadoras de distúrbios 
gastroinstestinais. Após o crescimento, realiza-se o isolamento e as provas bioquímicas 
para se determinar qual(is) bactéria(s) é(são) responsável(eis) pelo distúrbio. 
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OBJETIVO 
Entender os conceitos básicos da técnica de coprocultura 
Usar a coloração de Gram para auxílio na identificação bacteriana 
 
MATERIAL 
Alça de platina 
Placa com ágar EMB 
Placa com ágar SS 
Solução salina estéril 
 
PROCEDIMENTO 
 
- Semear uma alçada de fezes em um meio diferencial (EMB) e outra em meio seletivo 
(SS). 
Caso necessário, solubilizar a amostra em solução salina estéril. 
- Incubar as placas de EMB e SS a 35 ºC por 24 horas. 
 
ATIVIDADE 12 – Análise microbiológica de alimentos 
 
As doenças transmitidas por alimentos (DTA) constituem um dos problemas de saúde 
pública mais freqüentes do mundo contemporâneo. São causadas por agentes 
etiológicos, principalmente microrganismos, os quais penetram no organismo humano 
através da ingestão de água e alimentos contaminados. 
A análise microbiológica para se verificar quais e quantos microrganismos estão 
presentes é fundamental para se conhecer as condições de higiene em que o alimento foi 
preparado, os riscos que o alimento pode oferecer á saúde do consumidor e se o alimento 
terá ou não a vida útil pretendida. 
 
OBJETIVOS 
Entender os conceitos básicos da análise microbiológica de alimentos Verificar a 
presença de coliformes fecais pela técnica do número mais provável (NMP) 
 
Parte 1 - Teste presuntivo 
 
MATERIAL 
Caldo Lauril Sulfato Triptose 
Tubos de Durhan 
Tubos de ensaio 
Pipeta de 10 mL, 1000 μL e 100 μL 
 
PROCEDIMENTO 
- Pipetar, assepticamente, 10 mL (amostra líquida) e/ou pesar 10 g (amostra sólida) e 
transferir para um frasco contendo 90 mL de solução salina estéril e homogeneizar. 
- Transferir a diluição 101 assim obtida para um frasco estéril e proceder à diluição 
seriada decimal (1 mL da diluição 10-1 adicionados à 9 mL de diluente, e assim por 
diante). 
- De cada diluição do alimento, transferir 1 mL para 3 tubos contendo 9 mL de meio LST. 
Homogeneizar por agitação cuidadosa. 
- Incubar a 35 ºC durante 24 horas. 
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- Decorrido o tempo de incubação, separar os tubos positivos, ou seja, turvos e com gás 
no interior do tubo de Durham, e dispensar os demais. Prosseguir para pesquisa de 
coliformes totais e para pesquisa de coliformes termotolerantes e E.coli. 
 
Parte 2 - Teste confirmativo para coliformes totais 
 
MATERIAL 
Tubos de Durhan 
Alça de platina 
Tubos de ensaio com Caldo Verde BrilhantePROCEDIMENTO 
- Tomar o número de tubos do teste presuntivo que deram positivos (formação de gás) 
nas diluições 1:1; 1:10 e 1:100; 
- Tomar igual número de tubos contendo o meio de Caldo Verde Brilhante e identificar os 
tubos 
- Com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo uma 
porção de amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio Verde Brilhante. 
Este procedimento chama-se repicagem; 
- Incubar durante 24 horas a 35 ºC; 
- Se no final do período de 24 horas houver a formação de gás dentro do tubo de Durhan 
o teste é considerado positivo. Caso não haja formação de gás, o teste é considerado 
negativo. 
 
Parte 3 - Cultivo das amostras positivas em meio sólido 
 
MATERIAL 
Alça de platina 
Placas de Petri 
Ágar EMB e ágar SS 
PROCEDIMENTO 
- Tomar o número de tubos do teste presuntivo que deram positivos (formação de gás) 
nas 3 diluições 1:1; 1:10 e 1:100; 
- Tomar a placa de Petri com o ágar EMB e SS já solidificados. 
- Com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo uma 
porção de amostra e inocular na placa correspondente. 
- Incubar durante 24 horas a 35 ºC 
 
ATIVIDADE 13 – Microcultivo 
 
Os fungos podem ser classificados em fungos filamentosos e leveduras. Em geral, eles 
estão presentes de forma marcante em nosso meio, realizando processos desejáveis ou 
prejudiciais. A identificação dos fungos envolve a análise das características morfológicas 
da colônia, bem como das suas estruturas microscópicas. No microcultivo o fungo é 
semeado em PDA entre uma lâmina e uma lamínula que após o crescimento é examinada 
diretamente no microscópio para a análise do tipo de micélio e estruturas de reprodução. 
OBJETIVOS 
 
Entender a técnica para obtenção de lâminas de fungos filamentosos Reconhecer as 
principais estruturas de fungos filamentosos 
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MATERIAL 
Placa de Petri 
Lâminas de vidro 
Lamínulas 
Algodão 
Placa com ágar (SB ou BDA) 
 
PROCEDIMENTO 
 
- Colocar sobre uma lâmina esterilizada, contida em uma placa de Petri estéril, um cubo 
de ágar Saboraud ou ágar batata. A lâmina deve estar sobre um suporte, que pode ser 
formado por outra lâmina, ou um pequeno bastão de vidro recurvado, ou ainda, dois 
palitos de fósforo. Semear o fungo, a partir de repique recente, nos 4 lados do cubo de 
ágar. Recobrir com uma lamínula esterilizada. Fazer uma câmara úmida, adicionando 1 a 
2 ml de água destilada estéril no fundo da placa ou embeber um pequeno chumaço de 
algodão estéril, para evitar a dessecação do meio de cultura, durante o crescimento do 
fungo. 
-Tampar a placa e deixar à temperatura ambiente por 7 a 10 dias, até que se observe 
desenvolvimento de hifas com ou sem pigmentação. 
- Após esse período, inativar a esporulação, adicionando 1 ml de formol ao algodão e 
vedando a placa com fita adesiva durante 24h-48h. O vapor de formol, além de inativar o 
fungo, irá auxiliar na fixação das estruturas microscópicas. 
- Retirar a lamínula com auxílio de uma pinça, cuidadosamente, uma vez que nela 
deverão estar aderidas as hifas e esporos do fungo. Pingar uma gota de corante azul de 
lactofenol-algodão (“Cotton Blue”) e montar sobre uma lâmina. Desprezar o cubo de ágar 
e, em seu lugar, pingar outra gota de corante azul e recobrir com lamínula, para visualizar 
esporos e hifas também aderidos à lâmina. 
- Observar em microscópio ótico com objetiva de 40 X, o tipo e cor da hifa, forma 
disposição e formação de esporos. 
 
 
 
ATIVIDADE 14 – Cultura de secreção de orofaringe 
 
O objetivo de solicitação deste exame é isolar bactérias patogênicas de secreção da 
orofaringe, especialmente Streptococcus beta hemolíticos do grupo A, uma vez que se faz 
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necessária a terapia imediata em pacientes infectados pelos patógenos deste grupo. A 
urgência não é justificada apenas pela doença básica (faringite, amigdalite), mas também 
para evitar as complicações posteriores, potencialmente graves como febre reumática, 
glomerulonefrite e endocardite reumática. Também é avaliada a composição da 
microbiota da orofaringe. 
 
OBJETIVOS 
Entender a técnica para obtenção de lâminas de secreção da orofaringe Aprender a 
semear material biológico em meio de cultura específicos 
 
MATERIAL 
2 Swabs 
Abaixador de madeira para língua 
Placa de Petri com ágar 
Lâmina de vidro 
Coloração de GRAM 
 
PROCEDIMENTO 
COLETA 
A contaminação com saliva, que contém uma flora bacteriana variada, pode dificultar o 
isolamento do verdadeiro agente infeccioso. As amostras devem ser cultivadas para 
recuperação do Streptococcus pyogenes. 
- Solicitar ao paciente que abra bem a boca. 
- Usando abaixador de língua e swab estéril, fazer esfregaços sobre as amígdalas e 
faringe posterior, evitando tocar na língua e na mucosa bucal. 
- Procurar o material nas áreas com hiperemia próximas aos pontos de supuração ou 
remover o pus ou a placa, colhendo o material abaixo da mucosa. 
- Coletar a amostra exatamente na área inflamada, evitando outros sítios na cavidade 
oral. 
- Colher dois swabs (um para o GRAM e outro para cultura). 
- Com um dos swabs, realizar um esfregaço em lâmina de vidro e esperar secar em 
temperatura ambiente. 
CULTURA 
- Sobre a superfície do agar, realizar estrias com o swab onde a amostra foi coletada. 
 
ATIVIDADE 15 – Teste de antagonismo 
 
O ensaio de antagonismo ou teste de antagonismo, é uma metodologia empregada para a 
verificação da capacidade de um organismo (fungo ou bactéria) de reduzir ou interromper 
o crescimento de outro (fungo ou bactéria). É geralmente utilizado na microbiologia 
ambiental para guiar a descoberta de microrganismos produtores de substâncias 
antimicrobianas. 
 
OBJETIVO 
Verificar a capacidade de fungos filamentosos quanto à inibição do crescimento de 
outro organismo. 
 
MATERIAL 
Placa com ágar (SB ou BDA) 
Bisturi ou alça de platina 
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Placa de Petri com fungo (crescimento de 7 dias) 
 
PROCEDIMENTO 
Teste de antagonismo frente a fungo (fungo1 x fungo2) 
- Realizar uma pequena incisão no formato de disco na superfície da placa onde o fungo 
já cresceu. 
- Retirar o fragmento de aproximadamente 0,5 cm e semear na placa contendo agar (SB 
ou BDA) cerca de 2 cm da borda. 
- Flambar a alça ou o bisturi 
- Realizar o mesmo procedimento com o outro fungo. 
- Semear o segundo disco próximo à outra borda da placa obedecendo à distância de 2 
cm. 
- Fechar a placa e levar a estufa a 30 ºC por um período de 7 a 14 dias. Teste de 
antagonismo frente à bactéria (fungo x bactéria) 
- Semear porções da bactéria selecionada em linha reta nos dois lados da placa; 
- Realizar uma pequena incisão no formato de disco na superfície da placa onde o fungo 
já cresceu. 
- Retirar o fragmento de aproximadamente 0,5 cm e semear no centro da placa contendo 
agar (SB ou BDA); 
- Flambar a alça ou o bisturi 
- Fechar a placa e levar a estufa a 30 ºC por um período de 7 a 14 dias. 
 
 
 
Teste de antagonismo = fungo 1 x fungo 2 - Teste de antagonismo = fungo x bactéria 
 
ATIVIDADE 16 – Hemocultura 
 
As hemoculturas são utilizados para detectar a presença de bactérias ou leveduras no 
sangue, para identificar o microrganismo(s) presente, e para orientar o tratamento. São 
geralmente prescritas duas ou mais hemoculturas e colhidas amostras consecutivas. 
Muitas vezes, é prescrito um hemograma, juntamente com, ou antes da hemocultura para 
determinar se o indivíduo tem um aumento do número de células brancas do sangue, o 
que indica um potencial de infecção. 
A maioria dos episódios sépticos tem origem hospitalare com certa frequência envolvem 
microrganismos que apresentam grande resistência aos antimicrobianos, estando 
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associados a taxas de mortalidade com tendência a serem superiores às dos episódios 
que ocorrem na comunidade. 
 
OBJETIVOS 
Entender a técnica para obtenção de sangue para hemocultura 
 
MATERIAL 
Frascos contendo meio de cultura TSB 
Seringa estéril 
Algodão ou gaze estéril 
Luva estéril 
Etanol a 70 % 
Garrote 
 
PROCEDIMENTO 
COLETA 
- Lavar as mãos e secá-las. 
- Garrotear o braço do paciente e selecionar uma veia adequada. Esta área não deverá 
mais ser tocada com os dedos. Fazer a anti-sepsia com álcool 70% de forma circular e de 
dentro para fora. 
- Coletar a quantidade de sangue (10 mL adulto/ 0,5-3,0 mL criança) e o número de 
amostras recomendados de acordo com as orientações descritas ou se discriminadas no 
pedido médico. 
- Identificar cada frasco com todas as informações padronizadas e enviar ao laboratório 
juntamente com a solicitação médica devidamente preenchida. 
- Transferir o volume coletado para o frasco com meio de cultura. 
- Colocar em estufa a 35 ºC por 3 dias. Visualizar e homogeneizar diariamente. 
CULTURA 
- Após 24 horas, semear uma gota retirada do frasco de hemocultura em placa com ágar. 
 
ATIVIDADE 17 – Coleta e cultura de material biológico para análise micológica 
 
Os fungos de interesse médico, agentes de micoses, apresentam-se sob dois tipos 
morfológicos: leveduras, prevalentemente unicelulares e bolores ou fungos filamentosos, 
que são multicelulares. Há ainda importantes agentes de micoses endêmicas que, na 
dependência principalmente da temperatura, mas sob influência também do teor de CO2 
e condições nutricionais, podem se apresentar sob ambas as formas sendo chamados 
fungos dimórficos. Os fungos filamentosos possuem como elemento constituinte básico a 
hifa, que pode ser septada ou não septada (cenocítica), hialina (hifomicetos) ou demácea 
(feohifomicetos). 
A partir da hifa formam-se esporos, para propagação das espécies. Na grande maioria 
dos fungos, os esporos podem ser chamados de conídios, pois nascem diretamente 
delas ou sobre estruturas ligadas a elas. Esses conceitos fundamentais representam a 
base para a identificação de um fungo, pois a classificação de filamentosos é feita, em 
geral, pela associação de características morfológicas macroscópicas (cor, aspecto, 
textura da colônia, produção de pigmento difusível no meio, etc.), microscópicas (forma e 
cor da hifa, presença ou não de septos, tipo e arranjo de esporos, etc.) e de velocidade de 
crescimento (lenta, moderada ou rápida). 
 
 
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OBJETIVOS 
Entender o processo de obtenção de amostras biológicas de pele e pelos para análise 
micológica. Aprender a técnica de cultivo de fungos a partir de pele e pelos. 
 
MATERIAL 
Placa de Petri 
Lâminas de vidro 
Placa com ágar Sabouraud (com antibiótico) 
Bisturi 
Pinça estéril 
 
PROCEDIMENTO 
SE POSSÍVEL, DESCONTAMINAR A PELE COM ÁLCOOL 70% ANTES DA COLETA. 
Pelos: 
- Raspar com lâmina de bisturi as escamas cutâneas da borda das lesões. Pode-se 
utilizar também uma lâmina de microscopia para aparar as raspagens. 
- Colocar o material entre duas lâminas limpas, de preferência esterilizadas, vedando-se 
as bordas das lâminas com fita adesiva para evitar perda do material. 
- Os pelos tonsurados, devem ser retirados com pinça estéril e acondicionados entre 
lâminas, em potes ou envelope de papel de preferência esterilizados. 
Unhas: 
- Fazer limpeza prévia das unhas escovando com água e sabão. 
- Cortar com tesoura e desprezar a parte descolada da unha e, com lâmina de bisturi, 
raspar as áreas mais profundas e pulverulentas. Colocar esse material entre lâminas e 
vedá-las com fita adesiva. 
Para exame direto, colocar uma gota de KOH a 20% em uma lâmina de microscopia e 
sobre essa uma porção da amostra a ser examinada. Cobrir a preparação com uma 
lamínula e, para intensificar a clarificação, aquecer ligeiramente, sobre a chama de um 
bico de Bunsen, sem deixar ferver a mistura. Examinar a preparação após 20 minutos, em 
microscópio óptico comum, inicialmente, com objetiva de 10x, seguida de 40x. 
Cultura 
- Após a coleta, o material deve ser colocado diretamente sobre a superfície do ágar com 
o auxílio de uma pinça ou alça de platina. 
- Levar as placas para a estufa a 30 ºC no período de 7 a 15 dias. 
 
ATIVIDADE 18 – Cultura de Esperma 
 
OBJETIVOS 
Entender os conceitos básicos da técnica de cultura de esperma 
 
MATERIAL 
Placas de Petri com Ágar Sangue 5% e Ágar chocolate 5% 
Alça de platina 
9 lâminas 
Coloração de Gram 
 
PROCEDIMENTO 
- Retirar, com auxílio da alça de platina próximo à chama, uma gotícula do material fresco; 
- Transferir o material fresco para a lâmina para dá início a coloração de Gram; 
- Retirar novamente com o auxílio da alça de platina a gotícula do material fresco; 
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- Transferir todo o material para a placa de Petri com o meio solidificado em formato de 
estrias; 
- Fechar a placa e levar à estufa a 35 ºC por 24 h 
 
ATIVIDADE 19 – Cultura de secreção de ouvido médio 
 
OBJETIVOS 
Entender os conceitos básicos da técnica de cultura de secreção do ouvido. 
Verificar o crescimento de bactérias pertencentes à microbiota do conduto auditivo. 
 
MATERIAL 
Placas de Petri com Ágar Sangue 5% e Ágar chocolate 5% 
Obs: Pelos, cabelos, escamas de unha e pele devem ser aliquotadas para exame 
microscópico 
direto e cultura, pois para exame são clarificadas com solução aquosa de KOH a 20% e, 
para cultura, não podem sofrer nenhum tratamento prévio, sendo por isso, inoculadas 
diretamente na superfície do meio de cultura. 
Swabs 
Lâminas de vidro 
Soro fisiológico 
Coloração GRAM 
 
 
 
 
PROCEDIMENTO 
- Retirar, com auxílio de um swab suavemente umidificado com soro fisiológico, o material 
de forma circular de dentro para fora incluindo secreções "frescas", evitadno encostar nas 
paredes externas do ouvido; 
-Transferir todo o material fresco para a lâmina para dá início a coloração de Gram; 
-Retirar novamente, com o auxílio de um novo swab suavemente umidificado com soro 
fisiológico, o material de forma circular de dentro para fora; 
- Transferir todo o material para a placa de Petri com o meio em formato de estrias; 
- Fechar a placa e levar à estufa a 32 ºC por 24 h 
 
ATIVIDADE 20 – Metabolismo microbiano 
 
MATERIAL 
Tubos de ensaio 
Ágar SS 
Ágar EMB 
Ágar CLED 
Ágar Sangue 5% 
Placas de Petri com colônias bacterianas crescidas 
 
PROCEDIMENTO 
- Após a solidificação dos meios nos tubos, selecionar uma bactéria para semeadura nos 
tubos contendo os meios diferentes; 
- Com a alça de platina próximo a chama, transferir uma alçada da bactéria selecionada 
para os tubos em formato de estrias; 
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- Levar os tubos à estufa a 35 ºC e analisar após 24 horas. 
Prova da catalase 
A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e 
oxigênio. 
Procedimento: 
- Colocar uma gota de H2O2 a 3% em uma lâmina de vidro; 
- Com auxílio da alça de platina semear uma porção da colônia em estudo. 
O teste é considerado positivo quando há a presença de bolhas/efervescência indicando a 
conversão de H2O2 em água e oxigênio gasoso. É considerado negativo na ausência de 
bolhas/efervescência. 
Prova da coagulase 
Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um 
coágulo, uma vez que a coagulaseé uma proteína com atividade similar à protrombina, 
capaz de converter o fibrinogênio em fibrina, que resulta na formação de um coágulo 
visível. Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: 
coagulase conjugada e a coagulase livre. 
Procedimento: 
- Com auxílio da alça, suspender colônias em estudo em caldo nutriente e colocar em 
estufa a 35 ºC até que turve. 
- Se necessário, acertar a turbidez até 0,5 da escala MacFarland 
- Em um tubo de ensaio estéril, colocar 0,5 mL de plasma e 0,5 mL do caldo nutriente com 
crescimento bacteriano recém turvado; 
- Incubar em estufa a 35 ºC por 4 horas 
- Verificar se há a presença de coágulo; 
- Se não houver presença de coágulo, incubar o tubo em temperatura ambiente e repetir 
as leituras com 18 e 24 horas de incubação. 
O teste é considerado positivo quando há a presença de qualquer grau de coágulo. 
Negativo quando há ausência de coágulo. 
Prova de fermentação da glicose a 1% 
Alguns microrganismos têm a capacidade de fermentar diversos tipos de carboidratos. 
Dependendo dessa capacidade, ocorre a mudança do pH do meio e consequentemente a 
viragem do indicador utilizado no teste. 
Procedimento: 
- Preparar caldo nutriente e distribui-los em tubos de ensaio; 
- Adicionar aos tubos com caldo nutriente o azul de bromotimol; 
- Depois de esterilizá-los em autoclave a 121 ºC por 15 minutos, adicionar em cada um 
dos tubos a solução de glicose a 1%; 
- Próximo ao bico de Bunsen, semear uma alçada da bactéria-teste e incubar em estufa 
por 24 horas a 35 º; 
A fermentação da glicose é verificada pela viragem do indicador para a cor amarela, e a 
produção de gás, pela formação de bolhas dentro do tubo de Durhan. 
 
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