ManteigabatiOuratea-Barros-2018

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE 
 PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO 
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
 
 
 
 
 
 
 
KAREN DOS SANTOS BARROS 
 
 
 
 
 
 
 
MANTEIGA DE BATI (Ouratea parviflora): CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA 
E UTILIZAÇÃO COMO SUBSTRATO PARA PRODUÇÃO DE LIPASE POR 
Aspergillus terreus EM FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NATAL/RN 
2018 
KAREN DOS SANTOS BARROS 
 
 
 
 
 
 
 
 
MANTEIGA DE BATI (Ouratea parviflora): CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA 
E UTILIZAÇÃO COMO SUBSTRATO PARA PRODUÇÃO DE 
LIPASE POR Aspergillus terreus EM FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA 
 
 
 
 
 
 
Dissertação de mestrado apresentada ao 
Programa de Pós-Graduação em Nutrição, da 
Universidade Federal do Rio Grande do 
Norte, como requisito parcial para à obtenção 
de título de Mestre em Nutrição. 
 
Orientadora: Profª. Dra. Karla Suzanne 
Florentino da Silva Chaves Damasceno 
 
Co-Orientadora: Profª Drª. Cristiane 
Fernandes de Assis 
 
 
 
 
 
 
NATAL/RN 
2018 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Barros, Karen dos Santos. 
 Manteiga de bati (Ouratea parviflora): caracterização físico-
química e utilização como substrato para produção de lipase por 
Aspergillus terreus em fermentação semi-sólida / Karen dos 
Santos Barros. - 2018. 
 44f.: il. 
 
 Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande 
do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-
Graduação em Nutrição. Natal, RN, 2018. 
 Orientadora: Profa. Dra. Karla Suzanne Florentino da Silva 
Chaves Damasceno. 
 Coorientadora: Profa. Dra. Cristiane Fernandes de Assis. 
 
 
 1. Aspergillus terreus - Dissertação. 2. fermentação semi-
sólida - Dissertação. 3. Ouratea parviflora - Dissertação. I. 
Damasceno, Karla Suzanne Florentino da Silva Chaves. II. Assis, 
Cristiane Fernandes de. III. Título. 
 
RN/UF/BSCCS CDU 612.39 
 
 
 
 
Elaborado por Adriana Alves da Silva Alves Dias - CRB-15/474 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN 
Sistema de Bibliotecas - SISBI 
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro 
Ciências da Saúde - CCS 
 
KAREN DOS SANTOS BARROS 
 
 
 
MANTEIGA DE BATI (Ouratea parviflora): CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E 
UTILIZAÇÃO COMO SUBSTRATO PARA PRODUÇÃO DE 
LIPASE POR Aspergillus terreus EM FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA 
 
 
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição 
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção 
do título de Mestre em Nutrição. 
 
Aprovada em 29 de Novembro de 2018. 
 
Profª. Drª. Karine Cavalcanti de Sena Evangelista 
Coordenadora do Programa de Pós-graduação em Nutrição 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte 
 
 
BANCA EXAMINADORA 
 
 
Profª. Drª. Karla Suzanne Florentino da Silva Chaves Damasceno 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN 
Orietadora 
 
Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos 
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN 
Membro Interno 
 
Profª. Drª. Jailane de Souza Aquino 
Universidade Federal da Paraíba – UFPB 
Membro Externo 
AGRADECIMENTOS 
 
Nesses anos de mestrado, de muito esforço e estudo, gostaria de 
agradecer primeiramente a Deus, pelo dom da minha vida e por me permitir viver estes 
momentos, agradecer aos meus pais, Eunice e Jalmir, por todo apoio e amor, sem 
vocês eu não teria condições de chegar até aqui! Ao meu irmão Arthur por sua 
paciência, admiriação e carinho. Agradeço a toda minha família, por me desejarem 
sempre o melhor, me induzindo aos melhores caminhos para realizar os meus 
objetivos e por por compreender meus momentos de ausência durante o 
desenvolvimento deste trabalho. 
Às minhas orientadoras, Profª Drª. Karla Suzanne Florentino da Silva 
Chaves Damasceno e a Profª Drª Cristiane Fernandes de Assis, por todos 
ensinamentos, afeto, ajuda e compreensão nos momentos mais difíceis, obrigada pela 
dedicação de vocês, e por vezes deixar seus momentos de descanso para me 
orientar. 
Obrigada as minhas amigas e companheiras de mestrado Rebecca, Anna 
Beatriz, Ana Gabriella e Gabrielle Mahara por serem tão presentes e me ajudarem a 
enfrentar cada obstáculo no decorrer dessa jornada. Aos meus amigos Anne 
Karolinne, Raiana, Rebeca, Gustavo, Juliana, Naiara, Alisson, Daniel, Camila, que 
mesmo sem entender nada sobre minha pesquisa me ouviram tantas vezes e foram 
abrigo, sempre me alegrando e incentivando a cada dia. 
Agradeço em especial também aos professores Thais Souza Passos e 
Francisco Caninde de Sousa Junior, por toda ajuda e conhecimento compartilhado 
nos momentos que eu precisei. Obrigada também aos profissionais Millena, Nathalia, 
Luiz, Oldemar, Giliane, Jonathas, Adriana, Maciel, Jéssica, Walleska, Luanda e 
Rogério, além dos alunos Alaine, Cecília, Fiamma, Lucas, Alane, Alessandra e Sara, 
que me receberam e ajudaram cedendo tempo e local de trabalho para fazer minhas 
análises. 
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 
(CAPES), visto que o presente trabalho foi realizado com seu apoio - Código de 
Financiamento 001. 
E a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para o 
desenvolvimento dessa dissertação, compartilhando comigo as alegrias e os desafios 
desta etapa da minha vida, minha sincera gratidão! 
 
 
RESUMO 
 
As lipases são enzimas pertencente a uma classe de hidrolases que 
catalisam a quebra de triacilgliceróis, gerando ácidos graxos livres. As fontes vegetais 
que apresentam maior interesse como substrato para a produção de lipase são as que 
contém triacilgliceróis de cadeia longa, neste contexto tem-se a manteiga de bati 
produzida a partir da Ouratea parviflora como uma alternativa para a produção de 
lipase. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial da manteiga de bati (Ouratea 
parviflora) como substrato para produção de lipase por Aspergillus terreus em 
fermentação semi-sólida. Foram realizadas as análises de composição dos ácidos 
graxos e de minerais, caracterização físico-química da manteiga de bati e utilização 
desta como substrato indutor para produção de lipase em duas temperaturas diferentes 
(25 ºC e 35 ºC) durante 196 h de fermentação. A contagem de esporos foi realizada 
em todo o período de fermentação. O extrato bruto enzimático foi avaliado frente a 
diferentes pH, temperaturas e ação de compostos ativadores e inibidores. A manteiga 
apresentou grande concentração de ácidos graxos de cadeia longa (C14 – C24). 
Destaca-se a quantidade do manganês (12,7 mg/g), cálcio (7,7 mg/g), sódio (6,7 mg/g) 
e magnésio (5,4 mg/g), além da presença, em menor concentração, do ferro (1,1 mg/g) 
e cobre (0,04 mg/g) que exercem efeito catalítico na oxidação lipídica. Quanto as 
características físico-químicas foi evidenciado elevado índice de acidez (20,76 mg 
KOHg-1) e peróxido (16,03 mEqkg-1) e baixa umidade (1,29 %). Independente da 
temperatura de incubação, a contagem de esporos do Aspergillus terreus foi 
semelhante e crescente durante todo o período de incubação (196 h). Porém, a maior 
atividade enzimática foi de 212,6 U/g, produzida no período de 120 h a 35 °C, com 
atividade específica de 144,5 U/mg. O extrato bruto enzimático apresentou melhor 
atividade relativa na temperatura de 37 ºC e pH 9. O β-mercaptanol aumentou 
significativamente a atividade relativa da enzima. Os demais compostos diminuíram a 
atividade relativa da enzima, com destaque para o dodecil sulfato de sódio (SDS) que 
inativou a enzima. Diante dos resultados encontrados afirma-se que a manteiga de bati 
é um substrato indutor para produção de lipase por fermentação semi-sólida. 
Palavras-chave: Ácidos graxos, atividade enzimática, fungo filamentoso, manteiga 
vegetal, minerais 
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/lipasehttps://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/hydrolases
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/triglyceride
https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/free-fatty-acids
 
ABSTRACT 
 
Lipases are enzymes belonging to a class of hydrolases that catalyze the 
breakdown of triacylglycerols, generating free fatty acids. The vegetable sources that 
are of greatest interest as a substrate for lipase production are those containing long 
chain triacylglycerols. In this context, the bati butter produced from Ouratea parviflora 
is an alternative for lipase production. The objective of this work was to evaluate the 
potential of bati butter (Ouratea parviflora) as a substrate for lipase production by 
Aspergillus terreus in semi-solid fermentation. Analysis of the composition of fatty acids 
and minerals, physicochemical characterization of bati butter and its use as an inducing 
substrate for lipase production at two different temperatures (25 ºC and 35 ºC) were 
carried out during 196 h of fermentation. The spore count was performed throughout 
the fermentation period. The crude enzymatic extract was evaluated against different 
pH, temperature and action of activating compounds and inhibitors. The butter had a 
high concentration of long chain fatty acids (C14 - C24). The presence of manganese 
(12.7 mg / g), calcium (7.7 mg / g), sodium (6.7 mg / g) and magnesium (5.4 mg / g) of 
iron (1.1mg / g) and copper (0.04mg / g) that exert a catalytic effect on lipid oxidation. 
Regarding the physical-chemical characteristics, a high acidity index (20.76 mg KOHg-
1) and peroxide (16.03 mEqkg-1) and low humidity (1.29%) were found. Regardless of 
the incubation temperature, the spore count of Aspergillus terreus was similar and 
increasing throughout the incubation period (196 h). However, the highest enzymatic 
activity was 212.6 U / g, produced in the 120 h period at 35 ° C, with specific activity of 
144,5 U/mg. The crude enzymatic extract presented better relative activity at 37 ºC and 
pH 9. β-mercaptanol significantly increased the relative activity of the enzyme. The 
other compounds decreased the relative activity of the enzyme, especially the Sodium 
Docetil Sulphate (SDS) that inactivated the enzyme. In view of the results obtained it is 
stated that bati butter was an inducing substrate to produce lipase by semi-solid 
fermentation. 
Key words: Enzymatic activity, fatty acids, filamentous fungi, minerals, vegetable 
butter. 
 
LISTA DE ILUSTRAÇÕES 
 
Figura 1 – Ouratea parviflora......................................................................................17 
Figura 2 – Manteiga de bati........................................................................................18 
Figura 3 – Desenho esquemático das etapas do estudo...........................................19 
Figura 4 – Curva de crescimento Aspergillus terreus................................................ 30 
Figura 5 – Atividade enzimática em U/g em diferentes tempos e temperaturas....... 30 
Figura 6 – Efeito da temperatura na atividade enzimática da lipase..........................32 
Figura 7 – Efeito do pH na atividade da lipase.......................................................... 33 
 
LISTA DE TABELAS 
 
Tabela 1 – Composição de ácidos graxos da manteiga de bati................................ 26 
Tabela 2 – Composição de minerais da manteiga de bati........................................ 27 
Tabela 3 – Caracterização físico-química da manteiga de bati................................. 28 
Tabela 4 – Efeito dos ativadores e inibidores na atividade da lipase.........................35 
 
SUMÁRIO 
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 10 
2 OBJETIVOS ................................................................................................... 12 
2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 12 
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 12 
3 REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 13 
3.1 LIPASES: DEFINIÇÃO, PRODUÇÃO E APLICAÇÃO .................................... 13 
3.2 MANTEIGAS VEGETAIS ................................................................................ 16 
3.2.1. Manteiga de bati (Ouratea parviflora) .......................................................... 17 
4 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS ....................................................... 19 
4.1 TIPO PESQUISA ............................................................................................ 19 
4.2 DESENHO ESQUEMÁTICO DO ESTUDO .................................................... 19 
4.3 AMOSTRA ...................................................................................................... 20 
4.4 DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS NA MANTEIGA DE BATI ............. 20 
4.5 DETERMINAÇÃO DE MINERAIS NA MANTEIGA DE BATI .......................... 21 
4.6 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA MANTEIGA DE BATI ................. 21 
4.7 PRODUÇÃO DA LIPASE ................................................................................ 21 
4.7.1 Microrganismo .............................................................................................. 21 
4.7.2 Manutenção ................................................................................................... 21 
4.7.3 Preparo do meio de cultivo .......................................................................... 22 
4.7.4. Fermentação ................................................................................................. 22 
4.7.5. Avaliação do Crescimento dos microrganismos ....................................... 22 
4.7.6. Extrato bruto enzimático .............................................................................. 22 
4.7.7. Atividade enzimática .................................................................................... 23 
4.7.8. Determinação da concentração de proteínas no extrato .......................... 23 
4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM DIFERENTES CONDIÇÕES .. 23 
4.8.1. Efeito da temperatura ................................................................................... 24 
4.8.2. Efeito do pH ................................................................................................... 24 
4.8.3. Efeito de agentes inibidores e ativadores .................................................. 24 
4.9 ESTATÍSTICA ................................................................................................. 24 
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 25 
5.1 DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS DA MANTEIGA DE BATI ........... 25 
5.2 DETERMINAÇÃO DE MINERAIS NA MANTEIGA DE BATI .......................... 26 
5.3. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUIMICA DA MANTEIGA DE BATI ................. 27 
 
5.4. PRODUÇÃO DE LIPASE ................................................................................ 28 
5.4.1. Crescimento dos microrganismos e atividade enzimática ....................... 28 
5.5. ESTUDO DE DIFERENTES CONDIÇÕES PARA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
DO EXTRATO BRUTO ............................................................................................. 30 
5.5.1. Efeito da temperatura e pH .......................................................................... 30 
5.5.2. Efeito dos inibidores e ativadores ............................................................... 32 
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 36 
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 3710 
 
1 INTRODUÇÃO 
 
As lipases são enzimas pertencente a uma classe de hidrolases que 
catalisam a quebra de triacilgliceróis, produzindo ácidos graxos livres, diacilgliceróis, 
monoacilgliceróis e glicerol
1
. Estas enzimas catalisam uma variedade de reações, 
incluindo hidrólise, transesterificação, interesterificação e formação de outros ésteres
2
. 
Além disso, outros aspectos que favorecem a utilização destas enzimas são as 
condições suaves em que as reações ocorrem, exigindo entradas energéticas 
mínimas, níveis reduzidos de subprodutos gerados durante a reação e a conversão 
mais eficiente de um substrato
3
. 
As lipases emergem como uma excelente enzima para catalisar reações 
dinâmicas que encontram aplicações promissoras no processamento químico e 
orgânico, formulações de detergentes, síntese de biossurfactantes, nas indústrias 
oleoquímica, alimentícia, agroquímica, fabricação de papel, cosmetícos, e 
farmacêutica
4
. Apesar do grande interesse na aplicação de lipases em várias 
indústrias, o seu elevado custo de produção, muitas vezes limita a sua utilização como 
biocatalisadores
5
, sendo vantajoso a utilização de microrganismos com eficiente 
produção de lipase e combinações de diferentes substratos e meios de cultura para 
obtenção desta enzima
3, 6
. 
A utilização da lipase produzida por fermentação em estado semi-sólido 
(FSS) a partir de um substrato vegetal mostra-se vantajosa para a qualidade de 
alimentos, pois esta enzima pode ser empregada para o tratamento específico ou 
isolamento de um tipo ou de uma classe de lipídios, sendo o aumento da sua utilização 
justificável pelo fato de serem naturais e biodegradáveis
2
. A fermentação semi-sólida 
é um processo de cultivo de microrganismos em substratos insolúveis com pouca ou 
nenhuma adição de água77. 
Lipases são amplamente encontradas em células de tecidos vegetais, 
animais e produzidas por microrganismos
7
. Quando obtidas pelo cultivo de 
microrganismos, podem ser isoladas das mais variadas fontes, incluindo bactérias, 
fungos, leveduras e actinomicetos
8
, sendo crescente o número de pesquisas sobre o 
uso de suplementos, substratos e tipos de microrganismos, visando a determinação 
das melhores combinações para obter uma enzima de alto valor, utilizando condições 
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/lipase
https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/hydrolases
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/triglyceride
https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/free-fatty-acids
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/diglyceride
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/monoglyceride
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/glycerol
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/interesterified-fat
https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/surfactant
https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/oleochemical
11 
 
operacionais que facilitam a redução dos custos de produção em escala industrial
3, 9
. 
Entre os microrganismos utilizados para a produção de enzimas destacam-
se os fungos filamentosos como os melhores produtores de lipase, visto que produzem 
lipases extracelulares, facilitando a recuperação de meios de fermentação
10
, sendo 
que as espécies mais relatadas pertencem aos gêneros Aspergillus sp
11,12, 13
e 
Penicillium sp
14, 15
. 
No gênero Aspergillus, a espécie Aspergillus terreus tem sido relacionada 
a uma ótima produção de lipase, por ser termoestável, com atividade em uma ampla 
faixa de pH (3 a 10)
16
, sendo capaz ainda de produzir biossurfactantes
17 
e realizar 
reações de esterificação, apresentando, portanto, um potencial biocatalisador 
industrial. Porém, a produção de lipase por este microrganismo depende do tipo de 
lipídio utilizado como substrato, pH e fonte de nitrogênio
16
. 
As fontes vegetais de maior interesse como substrato para produção destas 
enzimas são óleos e gorduras contendo triacilgliceróis constituídos de ácidos graxos 
de cadeia longa
18
, sendo destacados estudos com azeite de oliva, óleo de oliva
19
, 
azeite de dendê
20
, óleo de soja
21
. Pensando na composição química rica em ácidos 
graxos de cadeia longa
22, 23
, tem-se a manteiga de bati como substrato para produção 
de lipase utilizando-se o fungo Aspergillus terreus. 
A manteiga de bati é obtida da Ouratea parviflora, uma planta presente em 
todo território nacional, destacando-se na região Nordeste e Sudeste
22
. 
Neste sentido, busca-se investigar se a manteiga de bati (Ouratea 
parviflora) será um bom substrato para produção de lipases utilizando o fungo 
Aspergillus terreus, esperando-se confirmar que este substrato de origem regional, 
produza lipase a partir do fungo Aspergillus terreus, colaborando com o conhecimento 
na área e despertar o interesse biotecnológico, para uso da enzima produzida, 
principalmente, na indústria de alimentos. 
12 
 
2 OBJETIVOS 
2.1 OBJETIVO GERAL 
 
Avaliar o potencial da manteiga de bati (Ouratea parviflora) como substrato 
para produção de lipase por Aspergillus terreus em fermentação semi-sólida. 
 
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
 Analisar perfil de ácidos graxos da manteiga de bati. 
 Analisar a composição de minerais da manteiga de bati. 
 Realizar a caracterização química e físico-química da manteiga de bati. 
 Avaliar a produção de lipase utilizando a manteiga de bati como substrato. 
 Determinar o efeito da temperatura, do pH e inibidores/ativadores sob a 
atividade da enzima. 
13 
 
3 REVISÃO DE LITERATURA 
3.1 LIPASES: DEFINIÇÃO, PRODUÇÃO E APLICAÇÃO 
 
As lipases são definidas como carboxilesterases que hidrolisam 
acilgliceróis de cadeia longa, ou seja, com cadeia acila constituída por mais de 10 
átomos de carbono
24
. Geralmente não requerem cofatores para a sua atividade 
catalítica, são altamente ativas na presença de substratos de cadeia longa
25 e, em 
meios com baixa concentração de água, catalisam reações de esterificação e 
transesterificação
26
. 
Outra característica marcante das lipases é a sua ativação na presença de 
interfaces hidrofóbicas (micelas de substratos, solventes orgânicos imiscíveis). Na 
ausência de interfaces, o sítio ativo das lipases é frequentemente coberto por uma 
“tampa”. Essas mudanças conformacionais se expõem em superfícies hidrofóbicas, 
conferindo funcionalidade à enzima
27
. 
São amplamente encontradas na natureza e produzidas por várias plantas, 
tecidos animais e microrganismos
28
. No entanto, as lipases de fonte microbianas são 
as mais utilizadas devido à sua grande versatilidade às condições ambientais, 
simplicidade na manipulação genética e condições de cultivo
2
, sendo bastante atrativa 
para a aplicação industrial
29
. 
A produção de lipases pode ser realizada por fermentação submersa (FS) 
ou por fermentação em estado semi-sólido (FSS), sendo a última um processo mais 
vantajoso em relação à fermentação submersa, por fornecer, em geral, altos 
rendimentos e facilidade na recuperação dos produtos, principalmente quando 
realizada utilizando fungos filamentosos
2
. 
O estudo e exploração de lipase microbiana específica são essenciais para 
alcançar alto rendimento, atividade e estabilidade, ajudando a elevar o seu campo de 
aplicação, estender sua vida útil, prolongar seus ciclos de uso e gerar competitividade 
no mercado de enzimas
3
. Apesar da importância desta exploração, os seus elevados 
custos de produção, muitas vezes limitam o seu estudo e utilização
30
. 
Para diminuir os custos com a produção desta enzima podem ser usados 
como substrato diversos óleos vegetais
5 e seus resíduos da indústria de refino, sendo 
uma boa fonte para a produção deenzimas lipolíticas com propriedades promissoras 
14 
 
e gerando um biocatalisador de baixo custo
12
. 
A produção de lipase por FSS com diferentes substratos sólidos 
combinados com uma grande variedade de fungos tem sido reportada na literatura, 
como no trabalho de Oliveira et al.
12 em que foram otimizados a produção de lipases 
a partir de A. ibericus, utilizando resíduos agroindustriais da torta de óleo de gergelim 
e palmiste e detendo uma boa produção da enzima, referente a 460 ± 38 U/g de lipase 
após 6 dias de fermentação. No estudo de Jain e Naik
32 a produção de lipase foi por 
Aspergillus oryzae e Aspergillus japonicus a partir de torta de mamona, que em 
fermentação semi-sólida resultou em uma atividade enzimática de 24,8 U/g e 18,9 U/g, 
respectivamente. 
Outro trabalho que também realizou fermentação semi-sólida para 
produção de lipase foi o de Damasano et al.
33 utilizando como substrato resíduo 
agroindustrial suplementado com subprodutos do processo de refino de óleo de milho 
ou azeite de oliva, em que a atividade lipásica obtida por Aspergillus niger variou de 
7,7 a 58,6 U/g de substrato seco. 
Além dos fungos supracitados destaca-se o A. terreus, fungo filamentoso 
saprófita da família Aspergillaceae
34
, pois tem sido relacionado a uma ótima produção 
de lipase, sendo esta altamente termoestável, realizando atividade em uma ampla 
faixa de pH (3 a 10)
16
, obtendo resultados com um custo benefício efetivo, bem como 
economia de tempo e elevados rendimentos da enzima, tanto em termos de produção 
como de purificação
34, 16, 35
. É capaz, ainda, de produzir biossurfactantes
35 e realizar 
reações de esterificação, apresentando, portanto, uma potencial forma de aplicação 
industrial
34
. 
No estudo realizado por Gulati et al.
34 a produção de lipase por Aspergillus 
terreus em substrato contendo nutrientes e óleo de milho, teve um custo benefício 
efetivo, bem como economia de tempo, já que o processo todo do estudo levou menos 
de 60 h, além de rendimentos de lipase elevados, tanto em termos de produção como 
de purificação na metodologia adotada. Yadav et al.
16 e Kaushik et al.
34 encontraram 
rendimentos de lipase utilizando Aspergillus terreus (250 U/mg e 19,95 U/ml), e como 
substrato gordura de porco e óleo de milho, respectivamente. 
Esse crescente interesse na produção de lipase está associado com as 
suas aplicações como aditivos nos alimentos (modificação de sabor)
36
, química fina 
15 
 
. 
(síntese de ésteres)
37
, detergentes (hidrólise de gorduras), tratamento de águas 
residuais (decomposição e remoção de substância oleosas)
38
, cosméticos (remoção 
de lipídios), produtos farmacêuticos (digestão de óleos e gorduras em alimentos)
39
, 
e ensaios biomédicos (triglicérides no sangue)
40
. Além disso, as lipases de óleos 
vegetais têm uma aplicação importante no campo da bioenergia, especialmente na 
produção de biodiesel
41
. Na indústria de alimentos, as lipases são usadas para 
sintetizar os emulsionantes tais como mono e diglicéridos
42 e para a produção de 
lipídios com níveis elevados de ácidos graxos poli-insaturados
43
. Elas também são 
utilizadas para o desenvolvimento de sabores e maturação do queijo
44 e salsicha de 
carne
6
. 
São utilizadas para a obtenção de ácidos graxos livres a partir da hidrólise 
seletiva de óleos e gorduras presentes em diversos alimentos. Os ácidos graxos livres 
podem ou não sofrer modificações químicas, e dependendo do tamanho da cadeia 
carbônica e da instauração, conferem um peculiar sabor e aroma para os alimentos 
representando um importante papel nas propriedades físico-químicas, sensoriais e 
nutricionais de diversos produtos
45
. 
Na indústria de queijos elas são empregadas na alteração e intensificação 
do sabor e em processos de aceleração da maturação. Também na indústria de 
laticínios, as lipases são utilizadas para obtenção de manteigas de baixo teor calórico, 
entre outras
46
. 
A literatura destaca que a hidrólise do óleo de fígado de bacalhau a partir 
de lipases pode produzir ácidos graxo ômega 3, podendo ser destinados a dietas de 
grupos clínicos especiais
47
. As lipases podem ainda ser utilizadas no melhoramento 
da textura de pães
48
, na hidrólise de gorduras e alteração do sabor do leite
49
 
Se destacam também no processamento do ácido gama linolênico, 
astaxantina (corante alimentício), metilcetonas (moléculas características de flavor em 
queijos azuis), modificação de óleos vegetais na posição 2 do triacilglicerol, a fim de 
obter gorduras similares à gordura do leite humano para alimentação infantil
2
. 
Com as lipases, óleos baratos podem ser transformados em produtos de 
maior valor agregado tais como triacilgliceróis de baixa caloria e óleos com alto nívelde 
ácido oléico
50
, como apresentado no estudo de Shin et al.
51
, realizando 
16 
 
interesterificação de triacilgliceróis da manteiga com óleo de palma, reduzindo o teor 
de gordura saturada, sem produzir gordura trans. 
Sendo assim, diante dos diversos estudos com produção de lipase a partir 
de microrganismos, observa-se que os substratos vindos de fontes vegetais de maior 
interesse são óleos e gorduras contendo triacilgliceróis constituídos de ácidos graxos 
de cadeia longa, como é o caso de algumas manteigas vegetais
18
. 
 
3.2 MANTEIGAS VEGETAIS 
 
As manteigas vegetais mais estudadas no Brasil são a de cacau, 
amendoim, soja, entre outras. A manteiga de cacau é a gordura natural extraída das 
sementes do cacaueiro Theobroma, sendo o componente mais abundante do grão de 
cacau seco, com sua cor levemente amarelada e conhecida mundialmente por ser 
ingrediente principal dos chocolates
52
. Outra manteiga vegetal bem conhecida é a 
manteiga de amendoim Arachis hypogaea L., que é um produto alimentar preparado 
a partir da moagem do amendoim torrado seco, que resulta num creme fino e fluído
53
. 
A manteiga de soja é produto obtido dos grãos de soja Glycine max, sendo um novo 
produto que não está comercialmente disponível em muitas partes do mundo e que 
pode ser usado como uma cobertura e recheio para uma grande variedade de receitas 
e formulações de alimentos salgados e doces
54
. 
Estas manteigas vegetais são produtos ricos em lipídios, e sua qualidade é 
determinada por parâmetros que descrevem suas características físicas e químicas, 
úteis para atestar a identidade dos produtos, para assegurar um padrão mínimo de 
qualidade e para avaliar o estado de conservação e estabilidade
55
. 
Entre estes parâmetros destacam-se os índices de iodo, peróxidos, acidez, 
refração, que juntamente com o perfil de ácidos graxos, servem para identificação e 
avaliação da maioria dos óleos e gorduras, funcionando também como critérios para 
verificar a aplicabilidade destes nas indústrias
56
. 
Dentre as aplicabilidades industriais tem-se a produção de lipases, 
favorecida pelas propriedades químicas dos constituintes das gorduras vegetais, sendo 
as fontes de maior interesse como substrato para produção desta enzima os óleos e 
gorduras contendo triacilgliceróis constituídos de ácidos graxos de cadeia longa
18
, 
17 
 
característicos da manteiga de bati
22, 23
. 
 
3.2.1. Manteiga de bati (Ouratea parviflora) 
 
A Ouratea sp. é uma espécie pertencente à família Ochnaceae que 
compreende cerca de 28 gêneros e 400 espécies de ampla distribuição nas regiões 
tropicais e subtropicais de todo o mundo. No Brasil, existem aproximadamente 9 
gêneros totalizando 105 espécies
57
. 
O gênero Ouratea ocorre em todo o território nacional, destacando-se no 
Rio de Janeiro, Minas Gerais, Paraíba, Rio Grande do Norte, Bahia e Pernambuco. 
As espécies de Ouratea sp espalhadas pelo país recebem designações específicas 
como Angelim (Ouratea vaccinoides), Caju Bravo (Ourateafloribunda e Ouratea 
salicifolia) e Coração de Bugre ou bati (Ouratea parviflora)
58
(Figura1). 
 
Figura 1. Ouratea parviflora.Fonte: Unidade Amostral 285 do Inventário Florístico Florestal de Santa Catarina. Disponível 
em: http://www.ufrgs.br/fitoecologia/florars/open_sp.php?img=3413 
 
São utilizadas pela população como tônicas e adstringentes, anti- 
inflamatórias, em doenças da pele e no tratamento de doenças gástricas
26
. O extrato 
hexânico dos frutos do bati apresentou ainda atividades antibacteriana e antifúngica
59
. 
Além disso o óleo de Ouratea serve para dor de reumatismo e nossos antepassados 
utilizavam para fritura de alimentos e como combustível em lamparinas
60
. 
As espécies de Ouratea são caracterizadas pelas flores geralmente 
vistosas, frequentemente de coloração amarela, com desenvolvimento de frutos entre 
http://www.ufrgs.br/fitoecologia/florars/open_sp.php?img=3413
18 
 
. 
os meses de fevereiro e março. Das sementes da Ouratea parviflora pode-se obter a 
“manteiga de bati” (Figura 2), aromática e de característica adocicada, utilizada em 
conservas e temperos, rico em ácidos graxos essenciais
31 Pinto
23
, em 2017, 
identificou no óleo de Ouratea spp. como principais constituintes os ácidos linoléico 
(40,88%) e oléico (28,29%). 
A manteiga de bati, torna-se de interesse visto a busca constante por novas 
fontes vegetais de gorduras, atribuído principalmente ao fato desses materiais serem 
obtidos de fontes naturais e empregados como importantes matérias-primas para as 
indústrias químicas, farmacêuticas e alimentícias, inclusive como substrato para 
produção de enzimas, como a lipase
31
. 
 
Figura 2. Manteiga de bati. 
 
Fonte: arquivo pessoal 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
19 
 
4 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS 
4.1 TIPO PESQUISA 
 
A presente pesquisa é do tipo aplicada, quantitativa e exploratória. 
 
4.2 DESENHO ESQUEMÁTICO DO ESTUDO 
 
A Figura 3 apresenta um desenhor esquemático das etapas que serão 
realizadas durante o estudo. 
 
Figura 3. Desenho esquemático das etapas do estudo. 
 
 
M
a
n
te
ig
a
 d
e
 b
a
ti
Caracterização 
Determinação de 
ácidos graxos
Determinação de 
minerais
Análises físico-
químicas
Produção da lipase
Ativação do 
microrganismo
Preparo do meio de 
cultivo
Fermentação
Avaliação do 
crescimento do 
microrganismo
Extrato bruto 
enzimático
Efeito da temperatura
Efeito do pH
Efeito de agentes 
inibidores e aticadores
Atividade enzimática
Atividade específica
20 
 
4.3 AMOSTRA 
 
A manteiga de bati (Ouratea sp.) utilizada como substrato neste estudo foi 
doada pela empresa Plantus Indústria e Comércio de Óleos, Extratos e Saneantes 
Ltda, localizada em Nísia Floresta/RN. 
A amostragem realizada no presente estudo foi por conveniência, sendo 
analisado dois lotes no período de outubro/2017 a julho/2018. 
As amostras foram recebidas em recipientes plásticos, sendo transportadas 
sob refrigeração, proteção da luz e levadas ao Laboratório de Bromatologia do 
Departamento de Farmácia, na Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), 
mantidas sob refrigeração a 4 ºC, até a realização das análises. Antes de cada análise, 
a manteiga de bati foi fundida em banho-maria a 40°C (QUIMIS, Mod. Q334M-28). 
 
4.4 DETERMINAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS NA MANTEIGA DE BATI 
 
Para análise do perfil de ácidos graxos utilizou-se 50,0 mg da manteiga, 
que foi previamente esterificada pelo método descrito por Hartman e Lago
61
, usando-
se solução de cloreto de amônia e ácido sulfúrico em metanol como agente 
esterificante para obtenção dos metil ésteres. 
Para determinação do perfil de ácidos graxos foi usado um cromatógrafo 
gasoso (Thermo Scientific – CG/FID – FOCUS, Milão - Itália) com detector de 
ionização de chama (FID) e coluna capilar (SUPELCO sp2560) 100 m x 0,25 mm x 
0,2 µm. O gás nitrogênio foi utilizado para promover o arraste (2,5 mL/min). A 
programação da elevação da temperatura da coluna foi de 40 °C por 3 minutos, em 
seguida foi aquecida a 180 °C por 5 minutos, com taxa de 10 °C/minuto e, por fim a 
temperatura atingiu 240 °C, mantida por 25 minutos com taxa de 20 °C/minuto. As 
temperaturas do injetor e detector foram de 230 °C e 270 °C, respectivamente. O 
volume da amostra injetada foi de 1,0 µL com razão Split de 10:1 e os picos resultantes 
foram comparados com o padrão de ácidos graxos SupelcoTM componente FAME 
MIX. 
A análise foi realizada no Laboratório de Nutrição Animal na Escola 
Agrícola de Jundiaí/UFRN. 
 
21 
 
4.5 DETERMINAÇÃO DE MINERAIS NA MANTEIGA DE BATI 
 
A determinação dos minerais na manteiga foi realizado no instituto de 
química, no laboratório do Núcleo de Processamento Primário e Reuso de Água 
Produzida e Resíduos - NUPRAR/UFRN, sendo utilizada a técnica de espectrometria 
de emissão óptica com plasma (ICP/OES), por meio de espectrômetro (ICP-OES-
iCAP 6000 Series), o qual detecta a radiação eletromagnética emitida por íons 
excitados ou átomos neutros na região UV- visível, sendo determinados os macro 
elementos (fósforo, potássio, cálcio e magnésio) e microelementos (ferro, zinco, 
cobre, manganês e sódio). 
Para esta análise foi realizada uma digestão nitro-perclórica, diluindo as 
cinzas das amostras, em 100,0 mL de ácido nítrico a 10 %, a fim de eliminar o material 
orgânico. Os resultados foram expressos em microgramas por g do produto (µg. g-¹). 
 
4.6 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DA MANTEIGA DE BATI 
 
A manteiga de bati foi submetida a caracterização físico-química segundo 
a AOCS
62
. Determinou-se o Índice de acidez (IA), Índice de peróxido (IP) e o 
percentual de Umidade por secagem a 105 °C. Estas análises foram realizadas no 
Laboratório de Análise de Alimentos do Departamento de Nutrição/UFRN. Todas as 
análises físico-químicas foram realizadas em triplicata. 
 
4.7 PRODUÇÃO DA LIPASE 
4.7.1. Microrganismo 
 
O microrganismo utilizado foi o Aspergillus terreus (NRRL-255), obtido do 
banco de microrganismos “Agriculture Research Service Culture Collection” (Peoria, 
Illionois-EUA). 
 
4.7.2. Manutenção 
 
O microrganismo utilizado ficou armazenado sob refrigeração (4°C) em 
placas de petri em meio ágar dextrose batata (PDA). Antes da incubação no meio de 
cultivo o microrganismo foi ativado em um novo PDA a 25°C durante 168 h, sendo o 
recolhimento dos esporos feito com Tween 80 1,0 % (V/V). 
22 
 
4.7.3. Preparo do meio de cultivo 
 
O meio de cultivo do microrganismo para a produção de lipase continha 
manteiga de bati 25 % (p/p), NaNo3 0,3 % (p/p), MgSO4 0,05 % (p/p), KCl 0,05 % (p/p), 
FeSO4 0,001 % (p/p), KH2PO4 0,1 % (p/p) e ágar-ágar 3 % (p/p). O meio foi esterilizado 
em autoclave por 15 minutos a temperatura de 121 °C, sendo adicionado às placas 
de petri com ajuda de uma proveta estéril e posteriormente levado para estufa (Quimis, 
Q317M, Diadema – São Paulo) a 25 °C. 
 
4.7.4. Fermentação 
 
A fermentação foi realizada em placa de petri contendo o meio de cultivo 
com a manteiga e a cultura do Aspergillus terreus com uma concentração final de 10
7 
esporos/g de substrato. Os experimentos foram incubados em estufa a 25 e 35 °C. As 
coletas das amostras para a determinação da atividade enzimática foram realizadas 
após 72, 120 e 168 h de fermentação. Cada ensaio foi repetido três vezes e a leitura 
da atividade realizada em sextuplicata. 
 
4.7.5. Avaliação do Crescimento dos microrganismos 
 
O A. terreus foi cultivado durante 168 h em estufa a 25 e 35 °C. O 
crescimento foi avaliado por meio da contagem de esporos em câmara de Neubauer
63 
a cada 24 h
11
. 
 
4.7.6. Extrato bruto enzimático 
 
O processo de obtenção do extrato bruto enzimático foi realizado 
adicionando 50 mL de Tris-HCl 0,05 M pH 8 na placa de petri com ajuda de uma 
proveta, sendo 10 mL por vez, homogeneizado e transferido para um Erlenmeyer de 
250 mL com ajuda de um funil. O Erlenmeyer foi levado para shaker (Quimis®– 
Q816M20) a 37 °C e 19 g por 30 min. O conteúdo do Erlenmeyer foi filtrado e levado 
para centrífuga (Centribio® - 80-2B) a 5240 g. O sobrenadante foi retiradoe 
armazenado em tubo falcon de 50mL, sendo a atividade do extrato bruto enzimático 
23 
 
analisada imediatamente. 
 
4.7.7. Atividade enzimática 
 
A atividade da lipase do extrato bruto foi determinada pipetando em 
sextuplicata 10,0 µL do extrato enzimático, somado a 90,0 µL do substrato, sendo 
para o branco pipetado 10,0 µL de Tris-HCl 0,05M pH 8 e 90,0 µL do substrato, 
obtendo um volume final de 100,0 µL. A microplaca foi incubada a 37 °C em estufa 
por 30 minutos e a análise da atividade foi realizada em leitor de microplaca (ASYS, 
Mod.UVM-340) a 410 nm
64. 
Uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de 
enzima que consome 1 µmol de ácido graxo por minuto. O cálculo da atividade 
enzimática foi realizado a partir da equação da reta encontrada na curva padrão com 
p-nitrofenol, sendo utilizado concentrações que variavam de 42 a 1400 nm/mL. 
 
4.7.8. Determinação da concentração de proteínas no extrato 
 
A concentração de proteínas do extrato bruto foi determinada pelo método 
de Bradford
65
, utilizando como solução para curva padrão a albumina sérica bovina 
(Sigma) em concentrações que variavam de 0,08 a 0,4 mg/mL. Para o ensaio do 
extrato bruto enzimático da lipase foi utilizado 1,0 mL da amostra adicionando 
posteriormente 3,0 mL do reagente de Bradford em um tubo de ensaio, sendo 
incubado a temperatura ambiente por 15 minutos. A análise foi realizada em triplicata 
e a leitura da absorbância foi a 595 nm em espectrofotômetro (Biospectro, Mod. 
SP220). 
4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA EM DIFERENTES CONDIÇÕES 
 
O extrato bruto produzido foi testado quanto a diferentes valores de 
temperaturas, pH e sob a ação de diversos agentes inibidores e ativadores, segundo 
Sharma et al.
66 com modificações, sendo realizado em microplaca (ASYS, Mod.UVM-
340) e a leitura da atividade a 410 nm. 
 
 
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1687157X17300355#!
24 
 
4.8.1. Efeito da temperatura 
 
Para avaliar o efeito da temperatura na atividade enzimática, a análise foi 
realizada em tubos de ensaio, adicionando 100 µL do extrato bruto enzimático a 900 
µL do substrato, variando-se a temperatura de 35 a 75 °C, sendo incubada por um 
período de 30 minutos e a atividade enzimática determinada conforme o item 4.7.7. A 
atividade relativa foi calculada utilizando a temperatura de 37ºC como controle. 
 
4.8.2. Efeito do pH 
 
O efeito do pH na atividade da enzima foi determinado por incubação a 37 
°C da mistura reacional variando de 4,0 a 11,0. Os tampões utilizados foram o fosfato-
citrato (pH 4,0 a 7,0), tampão Tris HCl (pH 8,0) e tampão glicina-NaOH (pH 9,0 a 11,0). 
A atividade enzimática foi determinada conforme o item 4.7.7. A atividade relativa foi 
calculada utilizando o pH 8,0 como controle. 
 
4.8.3. Efeito de agentes inibidores e ativadores 
 
O extrato enzimático foi incubado durante 30 minutos com (1,0 mM) de 
NH4Cl, (NH4)2SO4, CaCl2, CuSO4, FeCl2, FeSO4, MgSO4, K2SO4, KI, ZnSO4, Na2SO4, 
NaCl, glicerol, beta mercaptanol, Dodecil sulfato de sódio (SDS), ácido etilenodiamino 
tetra-acético (EDTA), triton-x 100, além de uréia (2,0 mM). A atividade enzimática foi 
determinada conforme o item 4.7.7. A atividade relativa foi calculada utilizando o 
tampão Tris-HCl 0,05M pH 8 como controle. 
 
4.9 ESTATÍSTICA 
 
Todas as análises foram realizadas em triplicata e os dados foram 
submetidos ao teste de Shapiro-Wilk para testar a normalidade. Os dados oriundos da 
atividade enzimáticas em temperaturas e períodos de incubação diferentes foram 
submetidos a análise de variância (ANOVA) com posterior teste Tukey (p<0,05). Os 
dados da avaliação da atividade enzimática do extrato bruto em diferentes condições 
foram submetidos à ANOVA e posterior teste de Dunnet (p<0,05) para avaliar as 
diferenças das atividades relativas em relação ao controle. O nível de significância 
adotado para todos os testes foi estabelecido em 5 % (p<0,05), e todas as análises 
estatísticas foram realizadas no programa XLSTAT (France, Paris). 
25 
 
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 
5.1 DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS DA MANTEIGA DE BATI 
 
Na determinação química do perfil de ácidos gráxos foram identificados e 
quantifificados catorze ácidos graxos na manteiga de bati (Tabela 1). 
 
Tabela 1. Composição de ácidos graxos da manteiga de bati. 
Ácidos graxos Percentual total (%) 
Ácido cáprico (C10:0) 0,84 
Ácido láurico (C12:0) 2,00 
Ácido tridecanóico (C13:0) 0,07 
Ácido mirístico (C14:0) 14,51 
Ácido pentadecanóico (C15:0) 0,16 
Ácido palmítico (C16:0) 33,50 
Ácido heptadecanóico (C17:0) 0,27 
Ácido esteárico (C18:0) 0,19 
Ácido elaídico (C18:1) 4,37 
Ácido oleico (C18:1, 9c) 28,64 
Ácido linoléico (C18:2, 6c) 14,56 
Ácido linolelaídico (C18:2, 6t) 0,10 
Ácido eicosanóico (C20:1) 0,42 
Ácido eicosadienóico (C20:2) 0,11 
Saturados 51,54 
Insaturados 48,20 
Monoinsaturados 33,43 
Poliinsaturados 14,77 
26 
 
Observa-se que a concentração de saturados (51,54%) e insaturados 
(48,20%) na amostra foi próxima e que os ácidos graxos predominantes foram 
palmítico (33,50%), oléico (28,64%), linoléico (14,56%) e mirístico (14,51%). Esses 
dados corroboram com Galvão et al.
67 que analisaram a manteiga da Ouratea. É 
importante destacar a presença de ácidos graxos de cadeia longa (C14 – C24)
68
, 
característica que favorece a utilização da manteiga de bati como substrato para 
produção de lipase por fungo
69
, tendo em vista que esse é um fator que melhora o 
rendimento na produção desta enzima
70
. 
 
5.2 DETERMINAÇÃO DE MINERAIS NA MANTEIGA DE BATI 
 
Na Tabela 2 visualiza-se a composição mineral da manteiga de bati, tendo 
como destaque o manganês, cálcio, sódio, magnésio. 
 
Tabela 2. Composição de minerais da manteiga de bati. 
Minerais mg/g 
Manganês 12,726 
Cálcio 7,723 
Sódio 6,700 
Magnésio 5,447 
Fósforo total 2,377 
Potássio 1,810 
Ferro 1,139 
Zinco total 1,037 
Níquel total 0,158 
Cromo total 0,050 
Cobre 0,044 
Cobalto total ND* 
*ND: não detectado 
 
Ressaltando ainda a presença do cobre e ferro que exercem efeito 
catalítico na oxidação lipídica
71
. A análise da composição mineral da manteiga é 
importante para avaliar a concentração de micronutrientes e verificar se os mesmos 
27 
 
podem influenciar nos parâmetros físicos e físico-químicos da manteiga. A presença 
destes minerais, também, influencia a produção de enzimas pelos microrganismos, 
visto que podem atuar como catalizadores ou inibidores como evidenciado por 
Rahman et al.
68
. 
 
5.3. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUIMICA DA MANTEIGA DE BATI 
 
Os resultados da caracterização físico-química da manteiga de bati estão 
apresentados na Tabela 3. Foi evidenciado um elevado índice de acidez (20,76 mg 
KOH g-1), quando comparado com o índice de acidez de gordura de palma (0,4 mg 
KOH g-1) identificado por Vieira et al.72, gordura vegetal que pode ser consumida, 
inferindo-se assim que a manteiga de bati analisada no presente estudo não pode ser 
recomentado para consumo humano. 
Destaca-se ainda, que possivelmente esse alto índice de acidez pode estar 
ligado a característica da amostra, indicando que a a manteiga de bati, no momento da 
análise, detinha presença de ácidos graxos livres (AGL), devido a ocorrência da 
rancidez hidrolítica, que aumenta a presença destes AGL pela quebra dos 
triglicerídeos, podendo ser influenciada por altas temperaturas durante o 
processamento ou armazenamento da gordura
73
. 
 
Tabela 3. Caracterização físico-química da manteiga de bati. 
Determinações Média DP 
Índice de Acidez (mg KOHg-1) 20,76 5,26 
Índice de Peróxido (mEqkg-1) 16,03 3,26 
Umidade (%) 1,29 0,45 
 
O elevado índice de peróxido encontrado na manteiga de bati evidencia 
que a mesma apresenta um elevado estado de oxidação provavelmente influenciado 
pela presença dos íons metálicos encontrados em sua composição, exercendo efeito 
catalítico nesta reação, além depresença de oxigênio e luz73. No intuito de reduzir 
significativamente o teor de minerais e consequente desaceleração das reações de 
oxidação, pode ser realizado o refino, que segundo Kreps et al.
74
, no processamento 
de óleos e gorduras vegetais, quando estes passam por uma etapa de refino, 
28 
 
proporciona redução de minerais, favorecendo a manutenção da qualidade da 
gordura. 
A baixa umidade encontrada na manteiga de bati é um fator positivo quando 
se correlaciona com a busca por um substrato para produção de lipase
75
, já que o 
aumento da umidade do substrato está diretamente relacionado com a diminuição da 
porosidade do mesmo, limitando a difusão de oxigênio na camada de substrato, 
reduzindo o crescimento do fungo filamentoso e também a produção de lipase
76
. 
 
5.4. PRODUÇÃO DE LIPASE 
5.4.1. Crescimento dos microrganismos e atividade enzimática 
 
Após a avaliação da caracterização química e físico-química da manteiga 
de bati foi observado que a mesma apresenta viabilidade para ser utilizada como 
substrato para produção de lipase por Aspergillus terreus utilizando o processo de 
fermentação semi-sólida. 
A fermentação semi-sólida é um processo de cultivo de microrganismos 
em substratos insolúveis com pouca ou nenhuma adição de água77, 78. A umidade é 
um importante fator que afeta o crescimento do fungo e produção de lipase 
particularmente em processo de fermentação semi-sólida79. Observa-se na Figura 4 
que, independente da temperatura de incubação, a contagem de esporos do 
Aspergillus terreus foi similar, demostrando crescimento semelhante e crescente 
durante todo o período de incubação (196 h). 
Relacionando esses dados com a atividade enzimática (Figura 5), percebe-
se que a medida que ocorre o aumento na contagem de esporos, tanto a 25 ºC como 
a 35 ºC, a atividade da enzima aumenta significativamente (p<0,05), mostrando que a 
produção da enzima está associada ao crescimento do microrganismo35. A maior 
atividade enzimática foi observada com 120 h de incubação na temperatura de 35ºC 
(212,6 U/g), com atividade específica de 144,5 U/mg. Apesar do crescimento do A. 
terreus ter sido semelhante nas duas temperaturas (25 e 35°C), a temperatura de 
35°C foi capaz de induzir significativamente a produção da enzima podendo assim ser 
considerada a temperatura ótima de saturação do sítio catalítico da lipase produzida80. 
A temperatura ideal para a produção de lipase fúngica deve sempre garantir uma boa 
eficiência e maior produção da mesma81. 
29 
 
 
Figura 4. Curva de crescimento Aspergillus terreus. 
 
 
Figura 5. Atividade enzimática em U/g em diferentes tempos e temperaturas. 
 
abcde valores com letras iguais não diferem significativamente de acordo com ANOVA e 
posterior teste de Tukey (p<0,05). 
 
As melhores condições de cultivo identificadas no presente trabalho foram 
semelhantes as relatadas na literatura, como no estudo de Gutali et al.
34 que 
realizaram produção de lipase por Aspergillus terreus em meio contendo óleo de milho 
e caseína, obtendo a produção máxima de enzima a 37°C em 96 h de cultivo. Kaushik 
et al.
35 também produziram lipase por Aspergillus terreus, utilizando como substrato 
óleo de milho, e foi observado a produção de lipase na faixa de 25 a 45°C com atividade 
30 
 
máxima de 70,1 U/g a 37°C em 96 h. 
Em outro estudo com produção de lipase Mahmoud et al.
82
, obtiveram uma 
atividade enzimática de 15,463 U/mL produzida pelo fungo Aspergillus terreus, num 
período de fermentação de 144 h a 45 ºC tendo como substrato hidrocarbonetos. 
Sethi et al.
11
, que utilizaram a torta da mostarda para produção de lipase a 
30°C por 96h utilizando o fungo Aspergillus terreus obtiveram uma atividade 
enzimática de 525 U/g com substrato suplementado com óleo de palma. 
Kamini et al.
83 avaliaram a produção de lipase por Aspergillus niger 
utilizando torta de gergelim como substrato e obtiveram uma atividade de 363,6 U/g 
em 72 h de cultivo a 37°C. 
Utami et al.
84 utilizado a temperatura de 30 °C para produção de lipase com 
farelo de arroz como substrato, obteve uma atividade enzimática de 38,67 U/g em 120 
h de fermentação com Aspergillus niger. 
Sendo assim, observa-se que a manteiga de bati utilizada como substro no 
presente estudo tem potencial para produção de lipase, obtendo atividade enzimática 
superior ao de muitos trabalhos com fungos supracitados, podendo estar diretamente 
relacionado com composição rica em ácidos graxos de cadeia longa, que favoreceu o 
crescimento do microrganismo produtor de lipase. Os resultados positivos incentivam 
outros estudos utilizando a manteiga de bati para a produção lipase. 
 
5.5. ESTUDO DE DIFERENTES CONDIÇÕES PARA ATIVIDADE ENZIMÁTICA 
DO EXTRATO BRUTO 
5.5.1. Efeito da temperatura e pH 
 
Para avaliar o efeito da temperatura na atividade enzimática, a enzima foi 
incubada em pH 8,0 numa faixa de temperatura de 35 a 75ºC. A temperatura 
considerada como controle foi a de 37 °C, por ter sido a temperatura utilizada em todo 
o estudo para a quantificação da atividade enzimática. 
Observa-se que a melhor atividade relativa foi encontrada nesta 
temperatura e que, quando comparado com este controle, as demais temperaturas 
influenciaram significativamente (p< 0,0001) a atividade relativa da enzima. Ocorreu 
diminuição da atividade relativa em função do aumento da temperatura, sendo afetada 
de forma significativa, nas temperaturas de 45 a 75°C segundo o teste de Dunnet 
31 
 
(p<0,0001), como apresentado na Figura 6. 
 
Figura 6. Efeito da temperatura na atividade enzimática da lipase. 
 
***Valores diferentes significantivamente do controle (37 °C), segundo ANOVA e posterior teste 
de Dunnett (p<0,0001). 
 
Hamdy & Abo-Tahon
85 utilizaram Aspergillus terreus para produção de 
lipase a partir de meio suplementado com azeite e identificaram atividade enzimática 
máxima a 30°C após 96 h. Sethi et al.
11
, que também avaliaram a influência da 
temperatura na atividade da enzima produzida pelo Aspergillus terreus, verificaram 
que a maior atividade da enzima foi na temperatura de 50ºC e temperaturas superiores 
levaram a desnaturação da enzima promovendo a diminuição da atividade. 
Utami et al.
84
, verificaram que a atividade enzimática da lipase produzida 
por Aspergillus niger, tendo como substrato farelo de arroz suplementado com óleo de 
oliva, foi melhor a 30°C, diminuindo consideravelmente a atividade relativa quando a 
temperatura era aumentada, testando-se o intervalo de 30 a 90°C. 
Diferente desses resultados o estudo de Gururaj et al.
86 que verificaram o 
efeito da temperatura na atividade da lipase produzida por Acinetobacter sp induzida 
pela presença de óleo de palma em temperaturas que variavam de 40 a 70 °C, 
mostraram uma boa atividade da enzima a 50°C, obtendo uma diminuição desta 
atividade no intervalo de 60 a 70°C. 
Para a avaliação da influência do pH sobre a atividade da enzima produzido 
pelo A. terreus tendo como substrato a manteiga de bati, diversos pH foram testados 
32 
 
(Figura 7). É importante observar que foi tomado como controle o pH8 visto que foi o 
pH utilizado em todos os ensaios de atividade enzimática do presente estudo. 
Figura 7. Efeito do pH na atividade da lipase. 
 
**Valores diferentes significantivamente do controle (pH 8), segundo ANOVA e posterior teste 
de Dunnett (p<0,001). *** Valores diferentes significantivamente do controle (pH 8), segundo 
ANOVA e posterior teste de Dunnett (p<0,0001). 
 
A enzima produzida pelo Aspergillus terreus apresentou boa atividade 
relativa nos pH de 6 a 9. Quando comparados com o controle todos os pH testados 
influenciaram significativamente (p<0,05) a atividade relativa da enzima. No pH 9 
pode-se observar que houve um incremento na atividade enzimática que ultrapassou 
os 100% da atividade do controle. No estudo de Sethi et al.
11 a caracterização 
enzimática revelou que a lipaseobtida de A. terreus foi significativamente ativa em uma 
ampla faixa de pH (6 a 9), assim como no presente estudo, porém com pH ótimo de 6,0 
e tornando-se instável em valores de pH acima de 9,0 e abaixo de 6,0. 
 
5.5.2. Efeito dos inibidores e ativadores 
 
A atividade da lipase foi avaliada na presença de compostos visando 
identificar os que ativaram e inibiram a atividade da enzima, destacando-se em negrito 
aqueles que significativamente afetaram a atividade relativa da enzima (p<0,05), 
apresentado na Tabela 4. O β-mercaptanol aumentou a atividade relativa da enzima 
de forma estatisticamente significativa (p<0,05). Pastore
87 
identificou um aumento 
33 
 
similar na atividade relativa de lipase produzida por Rhizopus sp. O β-mercaptanol é 
um composto químico comumente usado para reduzir pontes de dissulfeto, então 
sugere-se que esse composto agiu como antioxidante neutralizando o efeito oxidativo 
da ligação S-S formada entre os resíduos de cisteína podendo atuar como um 
antioxidante biológico em reações enzimáticas, obtendo uma maior atividade da 
enzima
88
. 
Discordando com estes resultados, outro estudo que produziu lipase por A. 
terreus observou um efeito notável na lipase, que reduziu a sua atividade em mais de 
77% quando tratada com p-mercaptoetanol
11
. 
Os demais compostos diminuíram a atividade da enzima, destacando o 
SDS por reduzir a atividade da enzima a zero e NH4Cl, (NH4)2SO4, Na2SO4 e NaCl 
como sendo aqueles em que apesar da redução da atividade, não apresentaram 
diferença estatisticamente significativa (p>0,05), quando comparados com o controle. 
No estudo de Gururaj et al.
86
, que produziram lipase por Acinetobacter sp, 
identificaram que íons como Zn, Mg, Ca, Fe e Mn diminuíram a atividade da enzima, 
mostrando que a lipase produzida não requer íons metálicos para sua atividade ou 
que a natureza inibitória da enzima seja devida à interação dos metais com os grupos 
de cadeias laterais da estrutura da lipase, influenciando assim a conformação e a 
estabilidade da enzima
68
. 
Ainda segundo Gururaj et al.
86 foi encontrado diminuição na atividade 
relativa quando analisada a presença de EDTA, Triton-x 100 e SDS, resultados que 
corroboram com os encontrados nesse estudo. O EDTA é um composto orgânico que 
age como agente quelante, formando complexos muito estáveis com diversos íons 
metálicos. A diminuição da atividade por este composto pode ser explicada pela 
interação de íons que podem estar presentes no sítio ativo da enzima, provocando 
redução da atividade
89
. Contraditório a este resultado, no estudo de Sethi et al.
11 O 
EDTA não alterou a atividade e estabilidade da lipase produzida por A. terreus a partir 
de óleo de mostrada, mostrando que estas análises variam de acordo com o substrato 
avaliado. 
 
 
 
34 
 
Tabela 4. Efeito dos ativadores e inibidores na atividade da lipase produzida a partir 
da manteiga de bati. 
Ativadores/inibidores Atividade relativa (%) 
NH4Cl 94,17 
(NH4)2SO4 95,00 
CaCl2 75,02* 
CuSO4 48,18* 
FeCl2 16,75* 
FeSO4 32,53* 
MgSO4 48,11* 
K2SO4 82,28* 
KI 91,56* 
ZnSO4 48,67* 
Na2SO4 94,77 
NaCl 96,43 
Triton X-100 52,06* 
β-mercaptanol 113,80* 
Ureia 80,26* 
EDTA 40,53* 
SDS 0,00* 
Glicerol 50,42* 
Controle 100 
*Atividade enzimática relativa que diferiu significativamente do controle devido ao 
efeito dos compostos testados, segundo o teste de Dunnett (p<0,05). 
 
Em relação à diminuição da atividade enzimática da lipase pelos 
detergentes Triton-x 100 (52,06 U/g) e SDS (0,00 U/g), pode ser devido a alterações 
locais de conformação no sítio ativo da molécula da enzima, resultando em inibição, 
desnaturação
90
, desdobramento reversível parcial e subsequente inativação ou 
diminuição da atividade
91
. 
Kumar et al.
88 ao analisar o efeito de compostos sob a atividade da enzima 
L-asparaginase produzida pelo fungo Cladosporium sp. observaram que a atividade 
relativa da enzima era reduzida por NH4Cl, (NH4)2SO4, CaCl2, CuSO4, FeCl2, MgSO4, 
35 
 
K2SO4, ZnSO4, concordando com o resultado encontrado para a lipase da manteiga 
de bati. 
36 
 
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS 
 
A composição química e físico-química da manteiga de bati possibilitou 
caracterizar a amostra, obtendo dados sobre esta gordura que são escassos na 
literatura. 
A fermentação semi-sólida por Aspergillus terreus utilizando a manteiga de 
bati como substrato apresentou resultados satisfatórios, indicando um bom potencial 
para produção de lipase, obtendo abtendo boa atividade enzimática e verificanto que 
a manteiga não é indicada para consumo humano. Além disso, foi possível identificar 
fatores de afinidade do extrato bruto da lipase produzida em relação a condições de 
pH, temperatura e compostos inibidores e ativadores da enzima, mostrando a sua 
atividade relativa em diferentes condições, importante para se obter uma máxima 
atividade em estudos posteriores. 
37 
 
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