Aula Replicação e reparo_2019

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Replicação e 
Reparo 
Introdução 
• Elucidação das estrutura de dupla hélice 
• Questão: como ocorre a propagação da 
informação genética? 
 
• Pré-requisitos para a replicação 
• Fidelidade: preservação x evolução 
• Precisão 
• Duplicação de todo o material genético da célula 
• Uma duplicação do genoma por mitose 
Hipóteses originais para o mecanismo 
de replicação 
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O experimento de Meselson e Stahl 
Matthew Stanley 
Meselson (1930-) 
Franklin William Stahl 
(1929-) 
* 
* 
* 
Requisitos para uma replicação bem-
sucedida 
• Abertura da dupla-hélice em ponto específico 
• Origem de replicação 
• Propagação do complexo de replicação 
• Forquilha de replicação 
• Bolha de replicação 
• Alívio da forças de enovelamento durante a 
replicação (topoisomerases) 
O Replicon 
 
1. É a unidade de DNA onde um evento de replicação ocorre. 
Inclui elementos reguladores. 
 
2. Origem de Replicação (ori) + Região Terminadora (ter) 
 
3. Ativados apenas uma única vez em cada ciclo celular 
 
4. O genoma de uma célula procariótica constitui um único 
replicon 
 
5. Cada cromossomo eucariótico possui vários replicons e todos 
são ativados uma única vez no ciclo celular ainda que não 
simultaneamente 
Mario
Nota
Meselson e Stahl conduziram seus famosos experimentos sobre a replicação do DNA usando bactérias E. coli como sistema modelo
Eles começaram cultivando E. coli em um meio, ou caldo nutritivo, contendo um isótopo "pesado" de nitrogênio, ^{15}\text N 
15
 Nstart superscript, 15, end superscript, N. (Um isótopo é apenas uma versão de um elemento que difere de outras versões pelo número de nêutrons em seu núcleo.) Quando cultivadas em meio contendo ^{15}\text N 
15
 Nstart superscript, 15, end superscript, N pesado, as bactérias assimilaram o nitrogênio e o utilizaram para sintetizar novas moléculas biológicas, incluindo o DNA.
Após muitas gerações crescendo em meio de ^{15}\text N 
15
 Nstart superscript, 15, end superscript, N, as bases nitrogenadas do DNA das bactérias foram todas marcadas com ^{15}\text N 
15
 Nstart superscript, 15, end superscript, N pesado. Em seguida, as bactérias foram trocadas para meio contendo um isótopo leve de ^{14}\text N 
14
 Nstart superscript, 14, end superscript, N e o crescimento foi mantido por várias gerações. O DNA produzido após a mudança teria que ser composto por ^{14}\text N 
14
 Nstart superscript, 14, end superscript, N, já que este teria sido o único nitrogênio disponível para a síntese de DNA.
Meselson e Stahl sabiam com que frequência as células de E. coli se dividiam, portanto puderam coletar pequenas amostras de cada geração e extrair e purificar seu DNA. Eles, então, mediram a densidade do DNA (e, indiretamente, seu conteúdo de ^{15}\text N 
15
 Nstart superscript, 15, end superscript, N e ^{14}\text N 
14
 Nstart superscript, 14, end superscript, N) usando centrifugação por gradiente de densidade.
Esse método separa moléculas como o DNA em bandas ao girá-las em alta velocidade na presença de outra molécula, como Cloreto de Césio, que forma um gradiente de densidade do topo para o fundo do tubo. A centrifugação por gradiente de densidade permite que pequenas diferenças—como aquelas entre DNA marcado com ^{15}\text N 
15
 Nstart superscript, 15, end superscript, N- e ^{14}\text N 
14
 Nstart superscript, 14, end superscript, N—sejam detectadas.
O experimento feito por Meselson e Stahl demonstrou que o DNA replicou-se semiconservativamente, significando que cada fita em uma molécula de DNA serve como um modelo para a síntese de uma fita nova, complementar.
Embora Meselson e Stahl tenham feito seus experimentos em bactéria E. coli, sabemos hoje que a replicação de DNA semiconservativa é um mecanismo universal, compartilhado por todos os organismos no planeta Terra. Algumas das suas células estão replicando seu DNA semiconservativamente agora mesmo!
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Origens de replicação 
• Regiões do DNA, conservadas em algumas espécies, 
reconhecidas pelo “complexo de replicação” 
 
• Procariotos: uma origem apenas 
 
• Eucariotos: várias origens por cromossomo 
Iniciação da replicação: procariotos x 
eucariotos 
Bolhas de replicação 
• Evidência microscópica das origens de replicação em 
bactéria (estrutura ) 
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Em bactérias, somente origens de replicação 
completamente metiladas podem iniciar a replicação 
 
Forquilhas de replicação 
• São o ponto em que ocorre a síntese das novas 
cadeias de DNA 
• São a unidade constituinte do replicon, ou unidade 
de replicação 
• Replicons podem ser uni- ou bidirecionais 
Direção da forquilha de replição 
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Características gerais do processo de 
replicação 
1) Semiconservativo (guiado pela complementaridade das fitas) 
2) Iniciação não é aleatória (ori) 
3) Movimento da forquilha pode ser unidirecional ou bidirecional 
4) Direção de síntese 5’3’ 
5) Semidescontinuidade de síntese das fitas (contínua numa fita 
e descontínua na outra) 
6) Enzima principal é a DNA Polimerase 
As DNA Polimerases 
DNA Polimerase 
• A síntese de DNA ocorre pela adição de nucleotídeos à 
extremidade 3´OH da cadeia em crescimento. 
 
• Requer primer (RNA/DNA iniciador) e template (molde) 
 
• O precursor da síntese é o desoxirribonucleosídeo 5´-trifosfato 
(dNTP) 
 
• Sentido da síntese é sempre 5’ → 3’ 
 
• Reação: [dNMP]n + dNTP → [dNMP]n+1 + PPi 
 
• Tem atividade corretiva (proofreading) 
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primer 
template 
dNTP 
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a 
b 
g 
PPi 
DNA polimerases de E. coli 
Existem também as DNA Polimerases IV e V envolvidas no reparo 
 
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A DNA Polimerase I 
(Enzima Kornberg) 
DNA Polimerase I 
• Descoberta em 1956 
• Envolvida em replicação e reparo de DNA 
• 1 única proteína com 3 atividades (3 domínios) 
 
• Domínios: Polimerásico 5’3’ 
 Exonucleásico 3’5’ 
 Exonucleásico 5’3 ’ 
 
• Atividade Exo 3’5’ corrige erros (proofreading) 
• Atividade Exo 5’3’ remove 10 nucleotídeos após um corte 
(nick). Envolvida com o reparo do DNA 
DNA Pol III: uma holoenzima 
(várias subunidades) 
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Seletividade cinética (i) 
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Seletividade cinética (ii) 
Catálise assistida por metais 
Replicação: etapas 
Mario
Nota
Helicase abre o DNA no garfo de replicação
Proteínas ligadoras de fita simples recobrem o DNA ao redor do garfo de replicação para evitar que o DNA se enrole.
Topoisomerase trabalha na região à frente do garfo de replicação para evitar enrolamento excessivo.
Primase sintetiza primers de RNA complementares à fita de DNA.
DNA polymerase III aumenta os primers adicionando nucleotídeos na extremidade 3', para fazer a maior parte do novo DNA.
Primers de RNA são removidos e substituídos com DNA pela DNA polimerase I
As lacunas entre fragmentos de DNA são fechadas pela DNA ligase.
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Eventos iniciais da replicação (i) 
• Desenovelamento da fita 
• Modificação endergônica catalisada enzimaticamente 
por helicases 
 
• Estabilização dos trechos de fita simples (ssDNA) 
• Proteínas ligantes de fita simples (SSB) 
Iniciação da replicação em Escherichia coli 
O complexo pré-
replicativo de 
eucariotos 
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Eventos iniciais da replicação (ii) 
• A DNA polimerase exige uma extremidade 3’-OH 
livre pareada 
 
• Existem várias formas de prover essa extremidade 
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Primase 
• Um oligorribonucleotídeo (RNA) iniciador (primer) é 
sintetizado de novo usando a fita complementar como molde 
• Ação da enzima primase 
Remoção do 
primer 
A processividade da DNA polimerase 
• Como conciliar a necessidade de aderir à 
necessidade de deslizar? 
• Resposta: uso de uma presilha (“clamp”) 
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Complexo “Clamp-loader” 
• Fato: a replicação do DNA junto a uma forquilha de 
replicação ocorre em ambas as fitas do DNA ao 
mesmo tempo. 
 
• Pergunta: como conciliar essa informação com o 
antiparalelismo da dupla hélice? 
15 
Resposta: fragmentos de Okazaki 
Reiji Okazaki (1930-75) 
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• Fato: pelo menos em procariotos, ambas as 
subunidades catalíticas do complexo da forquilhade 
replicação estão constantemente associadas, tanto a 
responsável pela replicação da “fita líder” quanto a 
responsável pela replicação da “fita retardada”. 
 
• Pergunta: como isso é possível? 
Resposta: deslizar a fita, não a forquilha 
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Replicação do DNA 
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Alívio estérico durante a replicação 
• Ao desenovelar a dupla fita, a forquilha de replicação 
exerce tensões que, com o tempo, criam pontos de 
torção que precisam ser aliviados. 
 
• A solução: Topoisomerases (DNA Girase) 
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Atividade Exo 3’→5’ 
• Possibilitada pela alteração geométrica causada 
pelas bases despareadas 
• Ocorre em um sítio distinto da enzima 
Síntese 5’→3’ 
Remoção: atividade exonucleásica 3’→5’ 
Continuação da síntese 5’→3’ 
DNA polimerase 
Nucleotídeo incorreto 
 Atividade exonucleásica 3’→5’ 
5´ 
3´ 
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Não seria mais fácil ter um polimerase para 
sintetizar DNA no sentido 5´→3´e outra 
para o sentido 3´→5´? 
Leiam este texto e façam um desenho para entender melhor essa questão! 
 
 
Leading and lagging strand synthesis is complicated! Why not have a second DNA polymerase 
that extends the strand in the 3' to 5' direction instead? Having two polymerases, yoked together 
and proceeding on both strands simultaneously would seem to be a simpler solution. The energy 
requirement would still be fulfilled: to run polymerization in the opposite direction we'd simply 
have a growing strand that ends with a 5' triphosphate, which would be attacked by the 3' OH of 
the incoming dNTP. However, the imaginary polymerase that adds to the 5' end, rather than 3' 
end of the chain would have issues with proofreading. Their most recently added nucleotide 
carries the triphosphate. If this base is erroneous, and excised by the proofreading exonuclease, 
there will no longer be a triphosphate at the 5' end of the chain. Therefore, the chain could 
not be elongated. Try drawing this situation, for a real polymerase vs. this imaginary polymerase 
that elongates the 5' end of the growing chain. 
Terminação da Replicação 
 Terminação: encontro de duas forquilhas de replicação 
 Região 180o a partir da ori contém terminadores (Ter) em polaridades diferentes 
 para parar as duas forquilhas 
 A proteína Tus se liga aos sítios Ter 
 Tus: 35.8 kDa, um monômero 
 
 Tus para a forquilha por meio da inibição da helicase DnaB 
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Resolução dos replicons 
Replicação 
procar. x eucar. 
Replissomo eucariótico 
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Replicação das extremidades 
O problema da replicação de replicons 
lineares 
Se a síntese não iniciar exatamente na última base, a cada ciclo 
de replicação, a cadeia tornar-se-á cada vez mais curta 
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Estratégias para resolver o problema 
• Fagos T4 e λ: conversão de um replicon linear em uma 
molécula circular multimérica 
 
• Adenovírus, fago φ29 e poliovírus: ação de uma 
proteína ligada covalentemente à base 5´ terminal 
 
• Cromossomos eucarióticos: telômero/telomerase 
 
A replicação por círculo rolante 
Replicação do Adenovírus 
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Telômeros e telomerase 
• Estas sequências são adicionadas através da telomerase, 
uma polimerase especializada que adiciona repetições da 
unidade básica 
Desta forma, a 
cada divisão 
celular, o DNA 
perdido pode 
ser facilmente 
reposto 
 
A telomerase 
 A telomerase não é ativa em células somáticas 
adultas 
 O crescimento dos telômeros é maior durante a 
gametogênese e depois eles não crescem mais, só 
diminuem de tamanho 
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A sobre-extensão de bases 
na região 3´ pode resultar 
em uma estrutura em laço em 
telômeros longos, protegendo 
a ponta do cromossomo 
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Telômeros humanos: TTAGGG 
Estrutura em laço (loop) em telômero de camundongo 
T-Loop 
Reparo 
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Reparo do DNA 
• Mesmo raramente, erros ocorrem 
 
• Diversas modalidades de reparo garantem maior fidelidade à 
replicação 
 
• Tipos de mutação 
– Pontual 
• Transições (Pu→Pu ou Py→Py) 
• Transversões (Pu→Py) 
– Inserções 
– Deleções 
– Rearranjos 
– Alterações na natureza química das bases ou ligações 
• Dímeros de pirimidina causados por luz UV 
• Hidrólises, alquilações, oxidações 
Se não houver reparo... 
Garantias de fidelidade da replicação 
• Três mecanismos 
cumulativos garantem 
uma baixa taxa de erro do 
processo 
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Reparo do DNA 
• Tipos de reparo 
• Correção de erro de pareamento (mismatch repair) 
• Excisão de base 
• Excisão de nucleotídeos 
• Polimerização translesional 
• Reparo por recombinação 
1) Reparo para correção de erro de 
pareamento 
Pergunta: como o sistema de reparo 
de bases não-pareadas sabe qual é a 
base incorreta? 
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Resposta: assinalando a fita-mãe 
quimicamente 
• Sistema de metilação dam de E. coli 
• Reconhece sequências GATC 
• A sequência metilada inibe MutH 
2) Excisão de base 
Várias modificações químicas das bases 
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Excisão de base 
Excisão de base 
Outros tipos de reparo de modificações 
químicas de bases 
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Mutação de base/distorção 
Corte nas regiões 5’ e 3’ 
Excisão 
Síntese de nova fita 
Ação da DNA ligase 
3) Excisão de Nucleotídeo (REN) 
Sistema UvrABCD 
Reparo por excisão 
de nucleotídeos 
 
Sistema UvrABCD 
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Reparo por excisão 
de nucleotídeos 
4) Reparo 
translesional 
5) Reparo por recombinação 
• Esse sistema entra em ação em situações em que 
não há o molde para a correção do erro. 
 
• A fita molde é fornecida pelo cromossomo 
homólogo em eucariotos, ou por um cromossomo 
extra, em procariotos. 
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Reparo por recombinação pós-replicação 
Replicação do DNA 
Distorção 
estrutural 
Excisão de um pedaço da 
fita normal e inserção na falha 
Reparo da falha 
Reparo por excisão? 
(RecA) 
Doenças humanas ligadas a 
erros no reparo 
Xeroderma Pigmentosum (XP) 
• XP é uma rara doença autossômica recessiva que afeta 1:250.000 
• Pacientes com XP hipersensíveis à luz do sol (UV) e são 
predisposto a ter câncer na pele quando jovens 
• Tendência a ter degeneração neurológica 
• Principal defeito no células XP está no reparo por excisão de 
nucleotídeo 
 
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Síndrome de Cockayne (CS) 
• Desordem no desenvolvimento e no sistema nervoso 
• Defeitos no reparo por excisão de nucleotídeo 
• A célula não consegue recuperar a transcrição após danos ao 
DNA 
• Não há aumento da incidência de câncer 
• Apenas 12 anos de expectativa de vida