Aula prática - Aminoácidos

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Universidade Federal do Piauí
Departamento de Bioquímica e Farmacologia
Roteiro das aulas práticas de Bioquímica
______________________Prof. Dr. Maximiliano Zierer______________________
Determinação Qualitativa dos Aminoácidos
As proteínas são substâncias orgânicas de alto peso molecular formadas por um grande número de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas. As células de todos os organismos vivos contêm uma variedade de proteínas com funções diferentes. As membranas que circundam as células contêm proteínas, as reações metabólicas que se dão no interior das células são catalisadas por enzimas que são proteínas. A reprodução das células e a transmissão das características hereditárias dependem das proteínas. Certos hormônios são proteínas, e os anticorpos que defendem o corpo são proteínas. Quando as proteínas são hidrolisadas, elas são convertidas numa mistura de aminoácidos. São conhecidos cerca de 20 aminoácidos obtidos a partir de proteínas. O propósito das experiências descritas é a determinação qualitativa de aminoácidos bem como a pesquisa da ligação peptídica. A molécula protéica é tão complexa que às vezes é difícil interpretar o seu comportamento químico. As proteínas de um modo geral refletirão as propriedades químicas de seus aminoácidos. Muitas reações coloridas das proteínas dependem da presença de um determinado aminoácido.
1 - Reação do Biureto
As proteínas e seus produtos de hidrólise que contenham mais de duas ligações peptídicas são reagentes positivos para a Reação do Biureto.
O Biureto é formado da decomposição da uréia a uma temperatura de 180°C.
As soluções alcalinas com biureto apresentam uma coloração violeta na presença de sulfato de cobre (CuSO4). Isso ocorre pela formação de um complexo entre o íon Cu+2 e os átomos de nitrogênio da molécula do biureto.
As ligações presentes na molécula do biureto são semelhantes às ligações peptídicas que unem os aminoácidos na formação dos peptídeos e proteínas.
Reagente de Biureto
Dissolva 1,5g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) e 6,0g de tartarato de sódio e potássio (KNaC4H4O6.4H2O) em 500 mL de água destilada. Adicione, sob agitação constante, 300 mL de solução de hidróxido de sódio (NaOH) 10%. Complete o volume para 1L com água destilada e guarde o reagente em frasco âmbar. Conserve por tempo indefinido.
TÉCNICA
1) Material:
a. Soluções e reagentes:
i. Reagente de biureto;
ii. Solução de ovoalbumina 2%;
iii. Solução de gelatina 1%;
iv. Água destilada.
b. Vidraria:
i. 3 tubos de ensaio;
ii. 4 pipetas de 5 mL.
2) Procedimento:
a. Numere os tubos de ensaio;
b. Prepare os tubos com as seguintes soluções:
i. Tubo 1 com 2 mL de solução de ovoalbumina 2%;
ii. Tubo 2 com 2 mL de água destilada;
iii. Tubo 3 com 2 mL de solução de gelatina 1%;
c. Adicione 1 mL de reagente de biureto em cada tubo;
d. Agite os tubos;
e. Observe e anote os resultados.
2 - Reação de Ninhidrina
Aminoácidos que possuem um grupo amino livre aquecidos em solução com excesso de ninhidrina formam um composto chamado Púrpura de Rühemann. Essa reação pode ser utilizada para a detecção de peptídeos e proteínas que apresentam essas características, aminas primárias e amônia. Nas condições apropriadas, a intensidade da cor violeta produzida é relacionada à concentração das espécies presentes. A prolina, que é um iminoácido, forma um composto amarelo.
TÉCNICA
1) Material:
a. Soluções e reagentes:
i. Solução aquosa de ninhidrina [C6H4COCO.C(OH)2] 0,1%;
ii. Solução de ovoalbumina 2%.
b. Vidraria:
i. 1 tubo de ensaio;
ii. 2 pipetas de 5 mL.
2) Procedimento:
a. Preparar o tubo com as seguintes soluções:
i. 1 mL de solução de ovoalbumina 2%;
b. Adicione 10 gotas da solução de ninhidrina 1 %;
c. Agite o tubo;
d. Aqueça em banho maria durante 2 minutos;
e. Observe e anote os resultados.
3 - Precipitação com Sais de Metais
Os cátions de metais como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam precipitados insolúveis de proteínas pela formação de sais insolúveis de metal com as proteínas negativamente carregadas, forma em que se encontram em meio alcalino. Essa precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI) porque nessa circunstância, a carga total sobre a proteína é negativa, o que favorece a interação com os cátions metálicos. Pode ocorrer a ressolubilização se o pH for corrigido.
TÉCNICA
1) Material:
a. Soluções e reagentes:
i. Solução de cloreto de mercúrio (HgCl2) 5%;
ii. Solução de acetato de chumbo [(CH3COO)2Pb.3H2O] 10%;
iii. Solução de ovoalbumina 2%.
b. Vidraria:
i. 2 tubos de ensaio;
ii. 3 pipetas de 5 mL.
2) Procedimento:
a. Numere os tubos de ensaio;
b. Prepare os tubos com as seguintes soluções:
i. 2 mL de solução de ovoalbumina 2%;
c. Adicione ao primeiro tubo 7 gotas de HgCl2 5%;
d. Adicione ao segundo tubo 5 gotas de (CH3COO)2Pb.3H2O 10%;
e. Agite levemente;
f. Observe e anote os resultados.
4 - Precipitação pelos Ácidos Fortes
Estes ácidos desnaturam as proteínas transformando-as em metaproteínas insolúveis. Essa precipitação é mais intensa quando o pH está abaixo do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, abaixo do pI, a carga líquida sobre a proteína é positiva, favorecendo a interação com os ânions provenientes dos ácidos fortes. Pode ocorrer a ressolubilização se o pH for corrigido.
Proteína + HNO3 → Metaproteína↓
TÉCNICA
1) Material:
a. Soluções e reagentes:
i. Solução de ácido nítrico concentrado (HNO3);
ii. Solução de ovoalbumina 2%;
iii. Água destilada.
b. Vidraria:
i. 1 tubo de ensaio;
ii. 3 pipetas de 5 mL.
2) Procedimento:
a. Prepare o tubo com a seguinte solução:
i. 1 mL de solução de ovoalbumina 2%;
b. Adicione 3 mL de água destilada;
c. Incline o tubo e acrescente lentamente pelas paredes 0,5 mL de ácido nítrico concentrado (HNO3), sem agitar;
d. Observe e anote os resultados.
5 - Reação Xantoproteica
O benzeno reage lentamente com o ácido nítrico (HNO3) concentrado formando o nitrobenzeno. Essa reação pode ser acelerada por aquecimento tornando a coloração da reação amarela. Essa reação também ocorre com aminoácidos que possuam em suas cadeias laterais anéis benzênicos, que ocorre com a tirosina e o triptofano, e em condições de nitração mais fortes, ocorre também para a fenilalanina. Se a reação for mantida em meio básico, a coloração será vermelho alaranjada.
TÉCNICA
1) Material:
a. Soluções e reagentes:
i. Solução de ácido nítrico concentrado (HNO3);
ii. Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 2N;
iii. Solução de ovoalbumina 2%.
b. Vidraria:
i. 1 tubo de ensaio;
ii. 3 pipetas de 5 mL.
2) Procedimento:
a. Prepare o tubo com a seguinte solução:
i. 1 mL de solução de ovoalbumina 2%;
b. Acrescente 10 gotas de ácido nítrico concentrado (HNO3);
c. Aqueça o tubo em banho maria;
d. Adicione 4 mL de solução de hidróxido de sódio (NaOH) 2N;
e. Observe e anote os resultados.
6 - Reação de Millon
O grupamento hidroxifenil da tirosina sofre uma nitração pelo ácido nítrico presente na solução. Após a nitração, esse produto reage com os íons mercúrio na solução, formando o fenolato de mercúrio que forma uma solução ou precipitado vermelho, resultados positivos. Como a tirosina é o único aminoácido a apresentar um grupo fenólico, esse teste se torna específico para verificação da presença ou ausência desse aminoácido. A reação não deve ser feita em meio alcalino forte devido à precipitação do mercúrio sob a forma de óxido.
Reativo de Millon
Adicione 40 mL de ácido nítrico (HNO3) concentrado frio em 20 g de mercúrio (Hg0), dissolvendo por aquecimento. Dilua com água destilada 2 vezes em volume. Deixe decantar por 24 horas e use o sobrenadante. O reativo de Millon pode ser armazenado por longos períodos em geladeira.
TÉCNICA
1) Material:
a. Soluções e reagentes:
i. Solução do reagente de Millon;
ii. Solução de gelatina 1%;
iii. Solução de ovoalbumina 2%.
b. Vidraria:
i. 2 tubos de ensaio;
ii. 3 pipetas de 5 mL.
2) Procedimento:
a. Numere os tubos de ensaio;
b. Prepare os tubos com as seguintes soluções:
i. 1 mL de solução de ovoalbumina 2%;
ii. 1 mL de solução de gelatina 1%;
c. Adicione aos dois tubos5 gotas do reativo de Millon;
d. Agite levemente;
e. Observe e anote os resultados;
f. Aqueça em banho maria o tubo com a solução de ovoalbumina com reativo de Millon;
g. Observe e anote os resultados.
7 – REAÇÃO DO GRUPO SULFIDRILA
Dos aminoácidos que apresentam enxofre em sua constituição apenas a cisteína e a cistina são capazes de liberá-lo à quente e no meio alcalino. O enxofre liberado forma sulfeto de sódio que reage com o acetato de chumbo, formando o sulfeto de chumbo precipita na cor preta ou castanha. O enxofre da metionina não é liberado em meio básico.
TÉCNICA
1) Material:
a. Soluções e reagentes:
i. Chumaço de cabelo;
ii. Solução de acetato de chumbo [(CH3COO)2Pb] 5%;
iii. Solução de hidróxido de sódio (NaOH) 50%.
b. Vidraria:
i. 1 tubo de ensaio;
ii. 2 pipetas de 5 mL.
2) Procedimento:
a. Coloque o chumaço de cabelo no tubo de ensaio;
b. Adicione 5 gotas da solução de acetato de chumbo [(CH3COO)2Pb] 5%;
c. Acrescente 2 mL da solução de hidróxido de sódio (NaOH) 50%;
d. Ferva durante 5 minutos;
e. Observe e anote os resultados.
Aminoácidos e Proteínas 1
O
R
N
H
3
+
O
-
2
+ HgCl
2
2NaOH
Hg
O
R
N
H
3
+
O
O
R
N
H
3
+
O
+ 2NaCl + 2H
2
O
Proteína
Cloreto de Mercúrio
Sal Insolúvel do metal
Cloreto de sódio
O
R
N
H
3
+
O
-
2
2NaOH
Pb
(II)
O
R
N
H
3
+
O
O
R
N
H
3
+
O
+ 2CH
3
COONa + 2H
2
O
Proteína
Acetato de Chumbo
Sal Insolúvel do metal
Acetato de sódio
Pb
(II)
C
H
3
O
O
C
H
3
O
O
O
N
H
3
+
O
H
O
-
Tirosina
 (Tyr)
Nitroderivado 
amarelo
O
N
H
3
+
O
H
O
-
N
+
O
-
O
+ HNO
3
D
-H
2
O
NaOH
Nitroderivado 
vermelho 
alaranjado
Nitroderivado 
amarelo intenso
+ HNO
3
D
-H
2
O
NaOH
Nitroderivado 
vermelho 
alaranjado intenso
O
N
H
3
+
N
H
O
-
Triptofano
 (Trp)
O
N
H
3
+
N
H
O
-
N
+
O
-
O
O
N
H
3
+
O
H
O
-
Tirosina
 (Tyr)
+Hg
++
HNO
3
D
Hg
O
O
O
N
H
3
+
C
H
3
O
-
Alanina 
(Ala)
2
2
Fenolato de mercúrio
O
N
H
3
+
S
H
O
-
Cisteína 
(Cys)
2NaOH
D
Na
2
S + H
2
O +
O
N
H
3
+
O
H
O
-
Serina
 (Ser)
Na
2
S + 
Acetato de Chumbo
Pb
(II)
C
H
3
O
O
C
H
3
O
O
D
PbS + 2
Na
O
O
C
H
3
Sulfeto de sódio
Sulfeto de chumbo
Acetato de sódio
Sulfeto de sódio
R
H
H
H
R
N
N
O
N
O
R
H
H
H
R
N
N
O
N
O
Cu
2+