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Autora: Prof. Pollyana Maria Saud Melo
Colaboradores: Prof. Flávio Buratti Gonçalves
 Profa. Marília Tavares Coutinho da Costa Patrão
Imunologia Clínica
Professora conteudista: Pollyana Maria Saud Melo
Graduada em Biomedicina pela Universidade de Uberaba, mestra e doutora em Ciências Biológicas 
(Biologia Molecular) pela Universidade Federal de São Paulo. Tem habilitação em Análises Clínicas. É docente 
titular/profissionalizante IV da Universidade Paulista (UNIP).
© Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta obra pode ser reproduzida ou transmitida por qualquer forma e/ou 
quaisquer meios (eletrônico, incluindo fotocópia e gravação) ou arquivada em qualquer sistema ou banco de dados sem 
permissão escrita da Universidade Paulista.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
M528i Melo, Pollyana Maria Saud.
Imunologia Clínica / Pollyana Maria Saud Melo. – São Paulo: 
Editora Sol, 2021.
204 p., il.
Nota: este volume está publicado nos Cadernos de Estudos e 
Pesquisas da UNIP, Série Didática, ISSN 1517-9230.
1. Métodos. 2. Diagnóstico. 3. Doenças autoimunes. I. Título. 
CDU 577.27
U512.43 – 21
Prof. Dr. João Carlos Di Genio
Reitor
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Unip Interativa – EaD
Profa. Elisabete Brihy 
Prof. Marcello Vannini
Prof. Dr. Luiz Felipe Scabar
Prof. Ivan Daliberto Frugoli
 Material Didático – EaD
 Comissão editorial: 
 Dra. Angélica L. Carlini (UNIP)
 Dr. Ivan Dias da Motta (CESUMAR)
 Dra. Kátia Mosorov Alonso (UFMT)
 Apoio:
 Profa. Cláudia Regina Baptista – EaD
 Profa. Deise Alcantara Carreiro – Comissão de Qualificação e Avaliação de Cursos
 Projeto gráfico:
 Prof. Alexandre Ponzetto
 Revisão:
 Aline Ricciardi
 Ricardo Duarte
Sumário
Imunologia Clínica
APRESENTAÇÃO ......................................................................................................................................................7
INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................................................7
Unidade I
1 CONCEITOS BÁSICOS DE IMUNOLOGIA .....................................................................................................9
2 ANTÍGENOS E ANTICORPOS ........................................................................................................................ 25
2.1 Interações antígeno-anticorpo ....................................................................................................... 34
2.2 Produção de anticorpos monoclonais ......................................................................................... 35
3 MÉTODOS NÃO MARCADOS E MARCADOS .......................................................................................... 39
3.1 Métodos não marcados ..................................................................................................................... 40
3.1.1 Imunoprecipitação ................................................................................................................................. 40
3.1.2 Aglutinações ............................................................................................................................................. 45
3.1.3 Ensaios líticos ........................................................................................................................................... 56
3.2 Métodos marcados ou conjugados ............................................................................................... 58
3.2.1 Fluorescências .......................................................................................................................................... 58
3.2.2 Radioimunoensaios ................................................................................................................................ 62
3.2.3 Ensaios imunoenzimáticos .................................................................................................................. 63
3.2.4 Imunocromatografias ........................................................................................................................... 72
3.2.5 Western Blotting ou Imunoblot ........................................................................................................ 73
4 IMPORTÂNCIA DOS MÉTODOS SOROLÓGICOS E PARÂMETROS SOROLÓGICOS ................... 75
Unidade II
5 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DAS HEPATITES, DO HIV E DE OUTRAS 
DOENÇAS EMERGENTES ................................................................................................................................... 90
5.1 Hepatites virais ...................................................................................................................................... 90
5.1.1 Hepatite A .................................................................................................................................................. 91
5.1.2 Hepatite B .................................................................................................................................................. 93
5.1.3 Hepatite C .................................................................................................................................................. 97
5.1.4 Hepatite D .................................................................................................................................................. 99
5.1.5 Hepatite E ................................................................................................................................................100
5.2 Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ................................................................................101
5.3 Arboviroses ............................................................................................................................................110
5.3.1 Febre amarela ......................................................................................................................................... 112
5.3.2 Dengue ......................................................................................................................................................114
5.3.3 Zika .............................................................................................................................................................121
5.3.4 Chikungunya .......................................................................................................................................... 124
5.4 Sarampo .................................................................................................................................................127
5.5 Coronavírus (SARS-CoV-2) .............................................................................................................129
6 DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DAS DOENÇAS CONGÊNITAS ..........................................................133
6.1 Citomegalia ...........................................................................................................................................133
6.2 Rubéola ...................................................................................................................................................136
6.3 Toxoplasmose .......................................................................................................................................140
6.4 Sífilis ........................................................................................................................................................143
Unidade III
7 HIPERSENSIBILIDADES E DOENÇAS AUTOIMUNES .........................................................................154
7.1Hipersensibilidade imediata ou do tipo I ..................................................................................154
7.2 Hipersensibilidade do tipo II ..........................................................................................................160
7.3 Hipersensibilidade do tipo III .........................................................................................................161
7.4 Hipersensibilidade do tipo IV .........................................................................................................163
7.5 Doenças autoimunes e os marcadores imunes utilizados no diagnóstico .................166
7.5.1 Doenças autoimunes órgão-específicas ..................................................................................... 169
7.5.2 Doenças autoimunes reumáticas .................................................................................................. 172
8 APLICAÇÃO DE IMUNOLOGIA CLÍNICA EM BANCOS DE SANGUE .............................................177
8.1 Sistema ABO .........................................................................................................................................182
8.2 Sistema Rh ............................................................................................................................................185
8.3 Antígenos plaquetários ....................................................................................................................189
7
APRESENTAÇÃO
A imunologia clínica tem como objetivo apresentar os métodos imunológicos utilizados para o 
diagnóstico diferencial das mais diversas patologias. Além de descrever e caracterizar as infecções virais 
e congênitas mais frequentes, aborda as hipersensibilidades e doenças autoimunes do ponto de vista 
das ciências biomédicas. Faz parte da área também a imuno-hematologia, que apresenta os antígenos 
eritrocitários, leucocitários e plaquetários e como as técnicas imunológicas são utilizadas para triagem 
de doadores em bancos de sangue.
Assim, este livro vai ser composto de três unidades. A primeira vai rever conceitos básicos de 
imunologia, cruciais no entendimento da aplicação clínica, e os métodos sorológicos. Na unidade II, 
serão discutidas as principais patologias virais, o HIV, as hepatites, as arboviroses, o sarampo e a 
COVID-19, além das infecções com transmissão congênita. Já a unidade III é composta das doenças 
ocasionadas por resposta exacerbada ou inadequada do sistema imunológico, as hipersensibilidades e 
doenças autoimunes. O estudo de imunologia clínica é finalizado com a imuno-hematologia.
INTRODUÇÃO
A imunologia básica é a área da biologia em que são estudados os mecanismos moleculares e celulares 
do sistema imunológico contra patógenos ou agentes estranhos. A partir desses conhecimentos, é 
possível utilizar as moléculas envolvidas nas respostas imunológicas como marcadores no diagnóstico 
diferencial, tanto de doenças ativas como pregressas, o que é a base da imunologia clínica.
Assim, a imunologia clínica é a área que vai ensinar como utilizar a resposta imunológica em métodos 
de exames laboratoriais, que serão utilizados no diagnóstico, descrição de fase da doença, prognóstico, 
critério de cura, levantamentos epidemiológicos, triagem de doadores e receptores de órgãos e tecidos, 
entre outros.
As moléculas antígenos e anticorpos vão, a partir de agora, ser estudadas, além de suas funções 
nos tecidos e no indivíduo, como parte da resposta imune adquirida humoral, e serão as ferramentas 
utilizadas para o diagnóstico in vitro. O uso dessas moléculas vai permitir uma grande variedade de 
combinações em métodos de diagnóstico com aplicações variadas.
Além disso, como essas moléculas estão sendo cada dia mais estudadas e aprimoradas e com os 
avanços tecnológicos, tem-se hoje uma alta sensibilidade e especificidade de detecção das doenças, pois 
esses métodos se tornaram capazes de detectar precocemente os microrganismos patogênicos, com 
muita confiabilidade.
Com a compreensão dos métodos de diagnóstico imunológico, será possível aplicar todo 
o conhecimento adquirido para criar um pensamento racional e científico da imunologia na 
medicina diagnóstica.
Bons estudos!
9
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Unidade I
1 CONCEITOS BÁSICOS DE IMUNOLOGIA
Antes de iniciar o estudo de imunologia clínica, será necessário que os conceitos básicos de imunologia 
sejam revistos e estejam bem assimilados pelo estudante, pois são essenciais para o entendimento 
do conteúdo apresentado. Por isso, inicialmente, serão abordados os principais tópicos de imunologia, 
desde definições de sistema imunológico, seus componentes e suas funções, dando ênfase às interações 
antígenos-anticorpos, até a explanação de alguns mecanismos de resposta imune contra patógenos.
O sistema imunológico tem como função proteger o organismo contra patógenos, entre eles, os 
vírus, as bactérias, os fungos, assim como pode atuar contra células tumorais e com dano e, ainda, 
contra proteínas próprias ao desencadear uma resposta imunológica.
Quando essa resposta é contra patógenos e células tumorais, o intuito é a eliminação do que não é 
próprio, o que mantém a integridade do organismo. Contudo, em alguns casos, poderá haver respostas 
contra antígenos próprios, o que ocasiona doenças de autoimunidade, que é quando o sistema imune 
gera uma lesão tecidual em seu próprio organismo devido à perda da autotolerância.
Diariamente, os seres vivos entram em contato com diferentes microrganismos patogênicos ou não 
patogênicos, mas, na maioria das vezes, não ocorrerá a doença, pois o sistema imune vai neutralizar os 
invasores através de uma resposta imediata contra o agente estranho ou até mesmo através de uma 
resposta previamente gerada em um momento anterior, a memória imunológica.
Devido à capacidade de o sistema imune responder especificamente a um antígeno, na resposta 
imune adquirida, tornou-se possível o desenvolvimento dos imunoensaios, que permitem a realização 
do diagnóstico diferencial de diversas doenças, mesmo quando estas apresentam sinais e sintomas 
semelhantes, além de possibilitar a detecção dos patógenos com os quais um organismo já entrou em 
contato. Esses métodos, ditos sorológicos, serão abordados logo adiante, porém é necessário que alguns 
conceitos da resposta imunológica sejam revistos brevemente antes de iniciar o estudo desses métodos.
A resposta imune é dividida em inata e adquirida (figura seguinte). No início da resposta, logo após 
o reconhecimento de um agente estranho, o antígeno, vai ocorrer a ativação da resposta imune inata, 
que está sempre pronta para agir, de forma inespecífica e sem a necessidade de uma exposição anterior 
a um antígeno. Por isso, é dita como não específica, ou seja, independentemente do tipo de agente 
agressor, os mecanismos de ação e componentes celulares e moleculares que estão envolvidos no início 
da resposta imunológica serão muito semelhantes.
10
Unidade I
Microrganismo
Imunidade inata Imunidade adquirida
AnticorposLinfócitos BBarreiras epiteliais
Células 
dendríticas
Fagócitos
Complemento Células NK
Horas
0 6 12 1 3 5
Dias
Tempo após infecção
Linfócitos T
Células T efetoras
Figura 1 – Sistema imunológico. A resposta imune está dividida em inata e adquirida. A primeira a ser ativada após uma invasão 
é a inata, que age de forma inespecífica no combate aos patógenos. Após 7 a 10 dias, uma resposta imunológica mais complexa e 
com especificidade é iniciada, a resposta imune adquirida. Essa resposta é diversa, ou seja, é diferente para cada tipo de invasor. Essa 
mesma resposta gera o que é conhecido como resposta imunológica
Fonte: Abbas, Lichtman e Pilai (2007, p. 5).
Os tecidos de revestimento, o tecido epitelial, a pele e as mucosas, são a primeira barreira que 
oferece proteção contra doenças. Quando esses tecidos estão íntegros, já funcionam naturalmente 
como uma barreira física contra a entrada de patógenos nos organismos. Além disso, possuem peptídeosantimicrobianos, pH, leucócitos intraepiteliais, que ajudam na eliminação de um possível invasor ainda 
na superfície, sendo uma parte do sistema imunológico que atua ativamente contra a ocorrência de 
doenças. Entretanto, se essa barreira física é rompida, por qualquer razão, ou é ativamente rompida por 
um patógeno, será necessário que outros componentes da resposta imune sejam ativados.
Quando um patógeno ultrapassa a barreira física descrita, as células fagocíticas entram em ação. 
São elas:
• Células dendríticas: as que ainda não foram ativadas, ou seja, imaturas. Na epiderme e nos 
linfonodos, são conhecidas como células de Langerhans, que são células dendríticas mieloides. 
Já as células dendríticas plasmocitoides estão presentes principalmente no sangue e nos 
órgãos linfoides.
• Granulócitos: são as células brancas, ou glóbulos brancos, presentes em grandes quantidades 
principalmente na corrente sanguínea – os neutrófilos, eosinófilos e basófilos.
11
IMUNOLOGIA CLÍNICA
• Monócitos ou macrófagos: nomeados de acordo com a sua localização, sangue ou tecidos, 
respectivamente, também são parte das células brancas ou glóbulos brancos, de linhagem mieloide.
• Linfócito B: um glóbulo branco que, além de ter função fagocítica, é a célula que produz os 
anticorpos quando na sua forma ativada de plasmócito. Com isso, faz parte das respostas imunes 
inata e adquirida.
Para realizar a fagocitose, que é inespecífica, ou seja, age de forma semelhante independentemente 
do invasor, as células fagocíticas deverão reconhecer o agente invasor a partir de receptores de 
reconhecimento-padrão (PRR) presentes em sua superfície. Os principais PRR são os toll-like receptors, 
que reconhecem nos patógenos os padrões moleculares associados a patógenos, os PAMPs. Essa ligação 
PRR-PAMP é o estímulo inicial para a ativação da resposta imune. Os PAMPs são moléculas exclusivas 
de patógenos. É comum que os PRR reconheçam como PAMPs moléculas como RNAs de dupla fita, 
proteínas formiladas, DNAs microbianos, entre outras, que não estão presentes nos seres humanos.
Como a resposta imune não é exclusiva contra microrganismos, outras moléculas podem ser 
reconhecidas pelos PRR. São os padrões moleculares associados ao dano celular, DAMPs, e os padrões 
moleculares associados a venenos ou toxinas, os VAMPs.
Os DAMPs são moléculas liberadas quando as nossas células morrem por necrose. Pode ser uma 
proteína de choque térmico ou fragmentos danificados de membrana, material genético da mitocôndria, 
entre outros, que vão ser reconhecidos pelos PRR, ativando a resposta imune inata contra essas células, 
garantindo a homeostase e a eliminação de células estressadas.
Já os VAMPs, como o próprio nome sugere, são toxinas e venenos oriundos de bactérias e animais 
peçonhentos, que, quando reconhecidos pelos PRR, são também capazes de ativar a resposta imune.
Além dos receptores da família toll-like, participam do reconhecimento dos micróbios os receptores 
de lectinas C, que são receptores de carboidratos do tipo manose, receptores varredores (scavengers), 
que reconhecem lipoproteínas, receptores a N-formil Met-Leu-Phe, que se ligam ao peptídeo 
N-formilmetionina e proteínas que contêm domínio de ativação e recrutamento de caspase (CARD).
Após o reconhecimento do micróbio pelas células fagocíticas, fatores de transcrição serão ativados 
no núcleo da célula. Com isso, essas células vão traduzir e secretar quimiocinas, citocinas e moléculas 
de adesão, que vão atrair para o local de infecção células de defesa e gerar resposta inflamatória 
para eliminar o agente agressor. Os fagócitos vão englobar os patógenos, formando no citoplasma da 
célula o fagossomo, que posteriormente vai se fundir com os lisossomos, o fagolisossomo. Como essa 
organela é composta de diversas enzimas digestórias, quando liberadas e em contato com o micróbio 
fagocitado, vão degradar, eliminando o invasor. Além das enzimas, outros mecanismos estão envolvidos 
na destruição dos patógenos no interior dos fagolisossomos, como os mecanismos do metabolismo do 
óxido nítrico, com a formação de radicais livres, microbicidas (figura seguinte).
12
Unidade I
1. Pseudópodes 
envolvendo 
patógenos
2. Os patógenos são 
englobados por 
endocitose
3. Forma-se um 
vacúolo que cerca 
os patógenos
4. O vacúolo e o 
lisossomo se fundem
5. Compostos 
tóxicos e enzimas 
lisossômicas destroem 
os patógenos
Lisossomo 
contendo 
enzimas
Célula fagocítica
Patógeno
Vacúolo
6. Os restos dos 
patógenos são 
excretados por 
exocitose
Figura 2 – Esquema da fagocitose. Na etapa 1, há o reconhecimento, os PRR se ligam aos PAMPs. Em 2, vai ocorrer a emissão de 
pseudópodes, que vão englobar o patógenos. Em 3, o vacúolo vai formar-se, nomeado de fagossomo. Em 4, ocorre a posterior fusão 
com o lisossomo, com a formação do fagolisossomo. Em 5, nessa vesícula, enzimas lisossomais e outros compostos serão liberados 
para que ocorra a destruição do patógenos. Em 6, o resultado gerado da degradação dos patógenos é então liberado por exocitose
Fonte: Reece et al. (2015, p. 948).
Além das células fagocíticas, ainda na resposta imune inata, temos as proteínas do sistema do 
complemento, com mais de trinta componentes, cujas principais funções são a defesa contra infecção 
por microrganismos e a eliminação de complexo antígeno-anticorpo circulante e de produtos de 
injúrias teciduais.
Essas proteínas têm sua atividade regulada por diversos mecanismos que evitam que o sistema do 
complemento seja ativado desnecessariamente, o que ocasionaria lesão tecidual. Sua ativação pode 
ocorrer por três vias diferentes: a via alternativa, a via clássica e a via das lectinas. Independentemente 
da via de ativação, sempre há uma proteína que vai fazer a ligação do sistema do complemento, podendo 
ser uma proteína microbiana, um anticorpo ou uma lectina ligadora de manose, respectivamente. 
Como resultado da ativação, poderá acontecer o recrutamento de neutrófilos, servindo como local de 
reconhecimento dos fagócitos e formação de um poro, o complexo de ataque à membrana, que vai 
resultar na ruptura do micróbio.
13
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Ainda no início da resposta imunológica, vai ocorrer a resposta inflamatória aguda, que não é 
exclusiva a patógenos, podendo acontecer por injúrias físicas ou químicas. Tem como efeito vasodilatação, 
aumento de permeabilidade capilar, aumento do fluxo sanguíneo na região, quimiotaxia, migração de 
leucócitos para a zona lesada, febre e proliferação de leucócitos e, com isso, gera-se uma resposta 
inflamatória. Devido aos processos hemodinâmicos e imunes da inflamação, são observados os cinco 
sinais cardinais: dor, calor, rubor, edema e perda da função do tecido (figura seguinte).
Músculo 
liso
Mastócito
Fibras elásticas
Fibroblasto
Fibras colágenas
Macrófago
Proteoglicanos
Vasos
Matriz 
do tecido 
conjuntivo
Células 
do tecido 
conjuntivo
Endotélio
Leucócito Leucócito 
polimorfonuclearpolimorfonuclear LinfócitoLinfócito
PlaquetasPlaquetas
MonócitosMonócitos
Fatores de Fatores de 
coagulação, coagulação, 
cininogênios e cininogênios e 
componentes do componentes do 
complementocomplemento EosinófiloEosinófilo
BasófiloBasófilo
Membrana 
basal
Figura 3 – Inflamação e sinais cardinais. Os eventos que vão acontecer em consequência de uma lesão tecidual física, química ou de 
microrganismos patogênicos mostrados na ilustração são os responsáveis pelo calor, rubor, edema e dor
Fonte: Barone (2020, p. 8).
No recrutamento de células brancas de defesa para a região, o neutrófilo que está circulante na 
corrente sanguínea será o principal leucócito recrutado para o tecido. Esse evento faz parte da resposta 
inflamatória. A função dessas células no tecido será fagocitar e destruir o invasor. Para tal, mediadores 
químicos serão necessários. A bradicinina, os fibrinopeptídeos, as prostaglandinas e as proteínas do 
complemento (C3a, C4a e C5a) serão os mediadores químicos responsáveis pela liberação dos conteúdos 
da granulaçãodos macrófagos no local, com a consequente liberação de histaminas, principalmente as 
interleucinas IL-1, IL-6 e IL-8, além do TNF-α.
O neutrófilo será atraído para o local, os macrófagos teciduais que fagocitaram os micróbios vão liberar 
citocinas, TNF-α e IL-1, que aumentarão a expressão de receptores de selectina no endotélio vascular. 
Com isso, neutrófilos atraídos para a região vão se ligar a esses receptores no endotélio do vaso, aumentando 
a sua afinidade de ligação ao endotélio. Os neutrófilos vão, então, rolar pelo endotélio, e a expressão de 
integrinas vai aumentar. Com o aumento da afinidade, ocorrerá a adesão. Depois, as células brancas vão 
migrar do vaso através do tecido endotelial para o tecido infectado. Esse processo é nomeado diapedese. 
Posteriormente à migração para o tecido, os neutrófilos exercem sua função de fagócitos e de liberação de 
quimiocinas, que atrai mais células de defesa para o local (figura seguinte).
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Unidade I
Ativação leucocitária
Ativação endotelial
Lúmen arterial
Células endoteliais
Camada íntima
Injúria
Quimiotaxia
VCAM-1
ICAM-1P-selectina
E-selectina
Figura 4 – Inflamação. Sempre que ocorrer a infecção de um tecido, as células de defesa serão atraídas para o local para que aconteça 
a migração dos neutrófilos do vaso sanguíneo para o tecido. Serão ativados por quimiocinas. Haverá o aumento da expressão de 
receptores de selectina nas células endoteliais, onde as integrinas neutrofílicas vão se ligar, aumentando a afinidade de ligação ao 
tecido endotelial. As células vão rolar sobre o tecido até a sua adesão. Depois, vão migrar do vaso para o tecido, processo nomeado de 
diapedese. A partir do momento em que se encontrarem nos tecidos, haverá a fagocitose e a produção de mais quimiocinas
Fonte: Souza (2008, p. 35).
A resposta inflamatória é crucial para a eliminação de microrganismo e para a recuperação de 
tecidos que sofreram injúria, pois, como resultado dessa resposta, vai ocorrer o reparo tecidual, ou a 
fibrose, que é a formação de tecido de cicatrização. Nesse último caso, há o quinto sinal cardinal da 
inflamação: a perda da função do tecido. Apesar de ser essencial para a recuperação da injúria, algumas 
vezes, pode acontecer uma resposta inflamatória muito exacerbada, que vai causar dano tecidual e 
que pode ser irreversível. E, ainda, em alguns casos, quando há uma resistência para a eliminação do 
patógeno, a resposta inflamatória vai se tornar crônica, sendo nomeada de granuloma. Com a resposta 
inflamatória crônica, em longo prazo, o tecido inflamado vai perder sua função, podendo chegar à 
falência e, até mesmo, levar o hospedeiro ao óbito.
Além de realizarem fagocitose, essas células são também células apresentadoras de antígenos 
(APCs), que após englobarem o microrganismo, vão apresentar um “pedaço” dele para as células TCD4+ 
auxiliadoras, ou helpers, fazendo a conexão entre as duas respostas: a inata e a adquirida.
O último componente a ser descrito, ainda da resposta inata, são os linfócitos NK, natural killers, 
que, como o próprio nome diz, têm a função efetora de eliminar microrganismos e células tumorais, por 
citotoxicidade. Esses linfócitos têm importante função contra vírus, que são patógenos intracelulares. 
15
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Quando as células NK reconhecerem uma célula infectada, haverá a eliminação dela e, consequentemente, 
do vírus, impedindo a replicação do patógeno.
O reconhecimento da célula que precisa ser eliminada vai acontecer porque as células NK estão 
sempre fazendo a vigilância imunológica. Quando ocorrer a diminuição da expressão do receptor 
nomeado de MHC classe I like, o linfócito NK vai ser ativado, destruindo a célula, com a liberação de 
perforinas e granzimas de seus grânulos. As células NK destroem tanto células infectadas por vírus como 
células tumorais, que também deixam de expressar esses receptores na superfície, sendo um sinal para a 
eliminação, o que vai controlar a proliferação dessas células, impedindo a formação de um tumor. Essa 
célula atua diretamente na imunidade do câncer.
Posteriormente aos eventos da resposta imune inata, será iniciada a resposta imune adquirida. Essa 
resposta só está presente nos vertebrados, é específica, diversa e gera memória imunológica. Os linfócitos 
são os protagonistas dessa resposta, tanto o linfócito B como o linfócito T. A resposta imune adquirida 
será ativada diretamente pelo antígeno e pelo resultado da resposta imune inata, que funcionará como 
segundo sinal para a ativação dos linfócitos.
A resposta imune adquirida é dividida em humoral e celular. Na resposta imune adquirida humoral, 
as células responsáveis são os linfócitos B, que possuem a função de produzir e secretar anticorpos. 
A produção de anticorpos e as funções efetoras dos anticorpos ou imunoglobulinas serão descritas com 
detalhes adiante.
 Lembrete
O linfócito B quando é ativado vai se diferenciar em plasmócitos, que é 
o nome dado à célula quando há a produção e a secreção dos anticorpos.
Já os linfócitos T, responsáveis pela resposta imune adquirida celular, possuem funções efetoras 
e regulatórias. Entre os linfócitos com funções efetoras, os linfócitos TCD4+ são conhecidos como 
linfócitos auxiliadores, que possuem a função de produzir citocinas e, com isso, conseguem sinalizar as 
respostas imunes tanto inatas como adquiridas. Já o linfócito TCD8+ possui a função de citotoxicidade, 
destruindo ativamente as células infectadas ou com danos.
Além disso, os linfócitos TCD4+ são divididos em subgrupos, o Th1, Th2 e Th17. Essa variedade 
de linfócitos TCD4+ é gerada quando as células percussoras recebem estímulos diferentes; com isso, 
terá funções distintas. O Th1 vai agir contra patógenos intracelulares, processos inflamatórios e 
autoimunidade; o Th2, contra patógenos extracelulares, alergias e asma; e o Th17, contra patógenos 
extracelulares, inflamações e autoimunidade. O que permite essa diferença na ação dos subgrupos é o 
perfil de citocinas produzidas por eles:
16
Unidade I
• Th1 produz INF-γ;
• Th2 produz IL-4, IL-5 e IL-13;
• Th17 produz IL-17A e IL-17F (figura seguinte).
Th2 Th17
LT
Th1
IL-4R
Patógenos 
extracelulares 
Alergia e asma
IL-4 
IL-5 
IL-13
IL-17A 
IL-17F
INF-γ
IN
F-γ
IL-6 TGF-β
IL-4
IL-23
IL-23R
Patógenos 
extracelulares 
Inflamação e 
autoimunidade
IL-12
IL-12R
Patógenos 
intracelulares
Inflamação e 
autoimunidade
Precursor
Figura 5 – Diferentes tipos de linfócitos TCD4+. As subpopulações dos linfócitos TCD4+ 
são geradas a partir de diferentes estímulos recebidos no início do seu processo de diferenciação e, 
consequentemente, vão produzir diferentes citocinas com funções efetoras diferentes
Fonte: Voltarelli (2008, p. 17).
Assim como as demais células sanguíneas, os linfócitos são produzidos na medula óssea, mas o 
processo de amadurecimento ocorre em locais diferentes. O linfócito B será amadurecido na medula 
óssea, bone em inglês. Já o linfócito T vai amadurecer no timo. Durante o amadurecimento, as células 
começarão a expressar receptores viáveis em suas superfícies, BCR e TCR, respectivamente.
Esses receptores é que vão reconhecer os agentes invasores, ligando-se em antígenos. Após esse 
reconhecimento, inicia-se a resposta imune adquirida. Como o reconhecimento dos linfócitos T e B é 
específico, os seres humanos possuem um repertório de, pelo menos, 109 diferentes clones de linfócitos, ou 
seja, durante o processo de amadurecimento serão sintetizados, em média, 109 diferentes linfócitos, 
cada um deles expressando um diferente receptor específico em sua superfície. Essa quantidade de 
clones permite que os linfócitos sejam capazes de reconhecer esse mesmo número de antígenos. Essa 
grande variedade de linfócitos é chamada de diversidade, uma característica importante da resposta 
imune adquirida. Acredita-se que todo ser humano tem uma diversidade de receptores suficiente para 
17
IMUNOLOGIA CLÍNICA
o reconhecimento, podendo responder imunologicamente a qualquer antígenocom o qual entre em 
contato durante a sua vida.
Mas esses linfócitos só serão ativados e terão função efetora após o reconhecimento de seu 
antígeno específico. Cada receptor do repertório imunológico será capaz de reconhecer apenas o 
seu antígeno, o que é a característica de especificidade da resposta imune adquirida. Os linfócitos, 
após o seu amadurecimento nos órgãos linfoides primários, medula óssea e timo, não estarão ativados 
até o reconhecimento do seu antígeno específico. Essas células, que estão prontas para agir, entretanto, 
sem função efetora, são nomeadas de naive, ou “virgens”. São responsáveis pelo que é conhecido como 
“vigilância imunológica”.
A vigilância imunológica consiste nas células em estado naive circularem por órgãos linfoides 
secundários, linfonodos e vasos linfáticos, baço, entre outros, à procura do seu antígeno específico. Após 
a circulação pelos vasos linfático ou sanguíneo, não havendo o reconhecimento de um antígeno, eles 
retornam para o linfonodo e o baço, nos quais ficam estocados ainda na forma naive. Essa vigilância 
acontece constantemente. Caso ocorra o reconhecimento do antígeno, o linfócito vai ativar-se, para 
exercer a função efetora; haverá a expansão clonal, que é a proliferação desse clone celular, aumentando 
o número de células que expressam esse receptor específico para que o combate ao invasor seja mais 
eficaz (figura seguinte).
Células T naive Células T efetoras
Células 
apoptóticas
Células T de memória
Figura 6 – Expansão clonal. Os linfócitos naive, após reconhecerem seu antígeno específico, 
serão ativados e vai acontecer a expansão clonal, proliferação do linfócito com o mesmo receptor. 
Após exercerem o combate, parte das células vai sofrer apoptose; outra parte serão as células 
de memória, que ficarão quiescentes na medula óssea
Adaptada de: Nunes ([s.d.], p. 43).
Após a expansão clonal e a ação dos linfócitos ativos, a maior parte das células vai sofrer apoptose 
para que o sistema imunológico volte a sua homeostasia. Parte das células que sofreram ativação 
não vão se tornar apoptóticas e se tornarão células de memória, outra característica importante da 
resposta imune adquirida.
18
Unidade I
 Observação
São características da resposta imune adquirida a diversidade, a 
especificidade e a memória imunológica.
A memória imunológica é uma das características da resposta imune adquirida e permite que 
o organismo seja capaz de reconhecer com maior rapidez e eficácia um antígeno quando entra em 
contato com ele uma segunda vez.
Nesses casos, a ativação da resposta imune será muito mais rápida, pois os linfócitos que serão 
ativados não são mais naive, não precisando passar por todas as etapas de ativação linfocitária.
Também são geradas células B de memória, que, na sua forma quiescente, ficam produzindo 
pequenas concentrações de anticorpos constantemente. A presença desses anticorpos atua como um 
neutralizante de invasores muito mais rapidamente em um segundo contágio, não sendo necessário 
o prazo de 7 a 10 dias, tempo que uma infecção primária demora para a ativação de toda a resposta 
imune adquirida (figura seguinte). Esses anticorpos secretados constantemente são uma ferramenta 
importante para o diagnóstico diferencial de patologias, as sorologias.
Antígeno X
Semanas
Antígeno X
+ antígeno Y
Resposta 
anti-X 
secundária
Células B de 
memória
Células B de 
memória
Resposta 
anti-Y 
primária
Resposta 
anti-X 
primária
Células B 
imaturas
2 4 6 8 10
Células B de 
memória
Plasmócito
Plasmócito
Plasmócitos
Tí
tu
lo
 d
e 
an
tic
or
po
 sé
ric
o
Figura 7 – Memória imunológica. A capacidade da resposta imunológica em desenvolver células de memória permite que, quando o 
organismo entrar em contato uma segunda vez com o patógeno, a resposta seja mais rápida e eficaz na eliminação ou neutralização. 
Observe na figura o aumento expressivo do título de anticorpos contra antígeno X produzido na infecção secundária em comparação 
com uma primoinfecção
Fonte: Abbas, Lichtman e Pilai (2007, p. 10).
19
IMUNOLOGIA CLÍNICA
A memória imunológica é a característica que permitiu o desenvolvimento das vacinas, que são 
um composto imunobiológico constituído de microrganismos atenuados, inativados, subunidades do 
microrganismo ou material genético dos patógenos, que, ao ser administrado em um indivíduo com o 
intuito de imunização, vai funcionar como uma primoinfecção, com a geração de memória imunológica. 
Assim, quando o vacinado entrar em contato com o patógeno no ambiente, o organismo vai responder 
como a uma infecção secundária, impedindo que haja tempo para o desenvolvimento da patologia.
 Saiba mais
Para saber um pouco mais sobre vacinação, acesse o artigo:
SLIFKA, M. K.; AMANNA, I. How advances in immunology provide insight 
into improving vaccine efficacy. Vaccine, v. 32, n. 25, p. 2948-2957, May 2014.
A ativação dos linfócitos B e T ocorre a partir de dois sinais: o patógeno e um segundo sinal, os 
compostos resultantes da resposta inata, as quimiocinas e as citocinas. Quando o patógeno é fagocitado 
nos tecidos pelas células apresentadoras de antígenos (APCs), essas células vão processar o antígeno 
em fragmentos de proteínas, os peptídeos, que serão apresentados para os linfócitos T, tanto o TCD8+ 
como o TCD4+.
As APCs, em especial as células dendríticas, são responsáveis pela ativação da célula naive. Elas 
migram do local da fagocitose para os órgãos linfoides secundários, em que vão apresentar o peptídeo 
para um linfócito que possui o receptor específico para o peptídeo gerado. Quando a APC e o TCR correto 
se encontram, ocorre a ativação desse clone linfocitário e, consequentemente, a expansão clonal.
Os microrganismos que têm origem exógena serão fagocitados com as formações do fagossomo, 
que, posteriormente, vai se fundir com o lisossomo, que é uma organela rica em enzimas proteolíticas 
ácidas, formando o fagolisossoma, uma vesícula ácida com função de degradar o microrganismo. Nesses 
casos, os peptídeos gerados se ligam com o complexo de histocompatibilidade (MHC) classe II, que será 
externalizado e apresentado na superfície da APC.
A molécula de MHC classe II apresenta peptídeos para o linfócito TCD4+, ou helper, ou, ainda, 
auxiliar. A ativação dessas células resulta na produção de citocinas, pró e pré-inflamatórias, capazes de 
desencadear diversas respostas imunes, ativando o próprio linfócito TCD4+, o linfócito B, para que ele se 
diferencie em plasmócito e produza anticorpos e, também, os fagócitos, entre outras funções.
Entretanto, quando temos antígenos de origem endógena, ou seja, peptídeos gerados no próprio 
citoplasma, a apresentação desse antígeno poderá ocorrer por qualquer célula nucleada do organismo.
A degradação desse antígeno vai acontecer no proteassoma, que é um conjunto multiproteico com 
propriedades catalíticas que têm a função de degradar as proteínas das células que não possuem mais 
função. Esses peptídeos gerados no citoplasma são oriundos da própria célula, ou podem ser resultantes 
20
Unidade I
de uma infecção viral, ou, ainda, de célula cancerígena. Eles vão se ligar à molécula do MHC de classe I 
e serão externalizados na célula. Apresentados para um linfócito TCD8+, com TCR específico para 
esse antígeno, ocorrerá a ativação da célula TCD8+, que possui a função de citotoxicidade, que vai 
eliminar a célula.
Por exemplo, em pacientes com uma infecção viral como a hepatite B, o vírus replicando dentro do 
hepatócito vai gerar peptídeos, que se ligarão no MHC de classe I. Posteriormente, o linfócito TCD8+ com 
o TCR específico para o vírus de hepatite B será ativado e vai liberar seu conteúdo citotóxico, que são 
basicamente enzimas que destroem o hepatócito. Por isso, em alguns casos, há a hepatite fulminante 
no indivíduo infectado com o vírus da hepatite B, pois a rápida replicação do vírus, associada a uma 
resposta imune exacerbada, destrói completamente o fígado, levando ao óbito.
Mas o que vem a ser o MHC? O MHCfoi originalmente descrito em estudos com camundongos 
na rejeição de tecidos entre membros de uma mesma espécie em estudos sobre transplantes. Dessa 
descoberta, vem o nome “complexo de histocompatibilidade”. Atualmente, é sabido que as moléculas 
expressas pelos genes do MHC também são importantes no timo, na apresentação de antígenos próprios 
para o desenvolvimento de linfócitos T maduros. A molécula de MHC é uma proteína expressa no 
extracelular, que se acopla ao TCR quando há interação célula-célula. Havendo a apresentação de um 
peptídeo específico, essa interação vai estimular as células T para que elas desempenhem suas funções 
reguladoras, acoplem sinais para o sistema imune inato e exerçam suas funções efetoras de integração, 
de regulação e de coordenação. Em humanos, as proteínas responsáveis por apresentar antígenos às 
células T são conhecidas como antígeno leucocitário humano, o HLA.
O polimorfismo genético do complexo MHC gera uma grande diversidade de moléculas dentro de 
uma população, porém todas as células de um indivíduo expressam o produto de um mesmo grupo 
de genes do MHC, ou seja, um único indivíduo terá pouca diversidade de molécula de MHC. Observe no 
quadro seguinte as principais características e diferenças das moléculas do MHC.
Quadro 1 – Características e diferenças das moléculas do MHC classe I e classe II
MHC classe I MHC classe II
Células que expressam Quase todas as células nucleadas Apenas as APCs
Nível de expressão Pode ser estimulado e inibido com estímulos imunológicos
Combinação gênica (cromossomo 6) Seis genes em combinação, nomeados de HLA-A, HLA-B e HLA-C
Pareamento do gene DBR permite de 
10 a 20 combinações
Origem dos peptídeos apresentados Endógena, citoplasmática Exógena, vesícula ácida
Peso molecular 43-49 kDa
Subunidades α1, α2 e β2 microglobulina α1, α2 e β1, β2 
Tamanho da fenda Liga peptídeos de 8 a 10 aminoácidos Liga peptídeos de 13 a 24 aminoácidos
Apresentação aos linfócitos TCD8+ TCD4+
21
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Na figura seguinte, é possível observar a representação ilustrativa das moléculas de MHC classe I 
e classe II, mostrando as cadeias, a inserção nas células e sua fenda de ligação no peptídeo. Após 
a recombinação dos genes do locus MHC no cromossomo 6, a molécula proteica será expressa e 
externalizada sempre com um peptídeo ligado em sua fenda, porém nem sempre esse peptídeo vai ser 
reconhecido por um TCR. Uma molécula de MHC tem a capacidade de se ligar a diferentes peptídeos. O 
que dá o especificado da resposta é o reconhecimento pelo TCR.
Espaço 
extracelular
Proteína MHC classe I Proteína MHC classe II
Cadeia α Cadeia β
Membrana 
plasmática
Citosol
COOH
COOH COOH
HOOC
NH2
NH2NH2 H2N
α1α2
α2
α1 β1
β2
β2-microglobulina
Figura 8 – Molécula do MHC classe I e classe II. Demonstração das estruturas das 
moléculas de MHC classe I e classe II. Representação da porção citoplasmática e da porção 
da membrana plasmática e do extracelular. O MHC classe I possui uma cadeia na 
membrana plasmática e no citosol, enquanto o MHC classe II possui duas cadeias. Além disso, 
o MHC classe I é composto da cadeia β2-microglobulina, que é menor que a cadeia β2 da molécula MHC classe II
Fonte: Puelker (2005, p. 26).
Na superfície dos linfócitos T, são expressos aproximadamente 105 diferentes TCR, algo semelhante 
à quantidade de moléculas de MHC expressas em uma APC, contudo serão necessárias apenas 
100 ligações específicas, não simultâneas, o que envolve aproximadamente 0,1% das moléculas de 
MHC da APC para que ocorra a ativação do linfócito T. Essas ligações vão formar um agregado ou um 
dímero, sugerindo que esse evento seja importante no processo de ativação do linfócito T pelo MHC. 
As moléculas auxiliares, os cluster of differentiation, CD4 e CD8, serão as moléculas estabilizadoras da 
ligação peptídeo-MHC e TCR (figura seguinte).
22
Unidade I
APC
TCR
CD4
CD8
Célula T CD8 Célula T CD4
TCR
MHC 
classe I
MHC 
classe II
APC
Figura 9 – Ligação entre o MHC e o linfócito T. O CD4 e o CD8 vão participar da ligação 
entre a molécula MHC e o TCR. A ligação vai dos coestimuladores e ocorre na região 
conservada do MHC. Sempre será entre a molécula do MHC classe I e o CD8 e 
a molécula do MHC classe II e o CD4
Adaptada de: Universiteit Utrecht (2009, p. 19).
Nesse processo de estimulação de função efetora, também será importante para a ativação do linfócito 
que outras moléculas coestimulatórias liguem-se a proteínas das APCs. Um exemplo é o receptor CD28, 
que é estimulado pela proteína B7 da APC. Essa proteína quando expressa na célula sinaliza que há uma 
invasão por um patógeno. Sem essa coestimulação, as células T podem até reconhecer um peptídeo na 
fenda do MHC, entretanto não vai ocorrer ativação, ou seja, uma resposta imunológica.
Após exercerem as suas funções efetoras, os linfócitos T vão sofrer mecanismos de inibição, o que 
impede uma resposta exagerada do sistema imune. A inibição será dependente de estímulos de moléculas 
coestimuladoras, os receptores CTLA-4 e PD-1, que quando ligados a proteínas das APCs, B7 e PDL-1/2, 
respectivamente, induzem o sinal de inibição.
Já a resposta imune humoral é a efetivada pelos linfócitos B, que serão ativados diretamente por 
antígenos, ligando-se aos BCR. Na superfície dos linfócitos B, tem-se expressas imunoglobulinas, IgD e 
IgM, que funcionam como molécula reconhecedora de antígeno específico.
As células B, após a sua ativação, migram para os folículos e vão formar centros germinativos nos 
órgãos linfoides secundários. Essas células B ativadas vão se proliferar, a expansão clonal, e diferenciar-se 
por hipermutação somática, o que ocasiona o processo de maturação por afinidade. Assim os agora 
nomeados de plasmócitos saem dos linfonodos e migram para a medula óssea, na qual será iniciada 
a secreção dos anticorpos, ou imunoglobulinas. As suas funções e as diferentes classes dos anticorpos 
serão descritas adiante.
23
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Em alguns casos, o antígeno sozinho não será suficiente para a estimulação dos BCR. Será necessário 
que os linfócitos B sejam ativados de forma T-dependente. Como a célula B é também um fagócito, 
também é uma APC. Por isso, a célula poderá fagocitar o antígeno, processar e apresentar uma molécula 
MHC classe II para um linfócito TCD4+, que não está mais na forma naive. Esse linfócito T, ao reconhecer 
seu antígeno específico, vai liberar citocinas, IL-4, que vão estimular a diferenciação da célula em 
plasmócito, com a produção e a secreção de anticorpos contra o antígeno em questão.
Resumindo: na resposta imune adquirida, o seu início acontece após o reconhecimento do antígeno. 
Os linfócitos T e B vão realizar expansão clonal, com função efetora, responsável por eliminar os antígenos. 
Depois, vai ocorrer a apoptose das células de defesa, o que reestabelece a homeostasia. Algumas células, 
contudo, vão permanecer viáveis, o que é a memória imunológica (figura seguinte).
Reconhecimento 
do antígeno
Ativação 
do linfócito
Eliminação 
do antígeno
Contração 
(homeostasia) Memória
Eliminação dos 
antígenos
Imunidade 
humoral
Imunidade 
celular
Células de 
memória 
sobreviventes
Linfócito T 
efetor
Célula 
produtora de 
anticorpos
Célula 
apresentadora 
de antígeno
Linfócito T 
virgem
Dias após a exposição ao antígeno
Linfócito B 
virgem
0 7 14 21
Apoptose
Diferenciação
Expansão 
clonal
Figura 10 – Resposta imune adquirida. As etapas da resposta imune são o reconhecimento do antígeno, 
a ativação dos linfócitos, a eliminação do antígeno, a contração e a memória
Fonte: Abbas, Lichtman e Pilai (2007, p. 14).
O que foi descrito é uma breve explanação de como funciona o nosso sistema imunológico. Esses 
mecanismos são consequências da entrada de um agente invasor, ou seja, são uma resposta imune 
ativa, que é específica e gera memória imunológica.
Contudo, em alguns casos específicos, por exemplo, na picada de animais peçonhentos, como cobras, 
aranhas e escorpião, ou na presençade toxinas microbianas, como a toxina do Clostridium tetani, agente 
etiológico do tétano, ocorrerá dano tecidual rapidamente antes da ativação da resposta imune.
24
Unidade I
Para neutralizar as toxinas e conter os danos, é utilizado um soro heterólogo produzido em outros 
animais (sendo comum o uso do cavalo), que vai possuir um conjunto de anticorpos contra determinada 
toxina. Então, se uma pessoa é picada por uma cobra venenosa, a toxina vai disseminar-se rapidamente 
pela corrente sanguínea e começar a causar danos teciduais. A aplicação do soro antiofídico vai 
neutralizar rapidamente as toxinas da cobra, evitando o óbito. É uma imunidade passiva.
Para a produção desses soros, a toxina de interesse deverá ser injetada em um animal que não o ser 
humano. Posteriormente, será separado do sangue do animal o conjunto de anticorpos contra aquela 
toxina. O indivíduo que receber esse soro não vai produzir seus próprios anticorpos, nem haverá ativação 
das suas células de defesa. Não havendo ativação do sistema imunológico, a contenção da invasão é 
feita de forma passiva e, consequentemente, não vai gerar memória imunológica. Com isso, se houver 
um segundo contato com essa toxina, será necessário usar o soro novamente (figura seguinte).
Antígeno 
microbiano 
(vacina ou 
infecção)
Soro (anticorpos) 
de indivíduo 
imune
Infecção
Sim
Especificidade Memória
Sim
Sim
Não
Exposição à 
infecção
Dias ou 
semanas
Recuperação 
(imunidade)
Imunidade 
ativa
Imunidade 
passiva Recuperação (imunidade)Administração 
de soro ao 
indivíduo não 
infectado
Figura 11 – Representação da imunidade ativa e passiva. Na imunidade ativa, após a entrada do invasor, o sistema imunológico é 
ativado; há a recuperação e a memória imunológica. Já na imunidade passiva, a neutralização da infecção é feita por um soro de um 
indivíduo imune; há a recuperação, mas como não há ativação do sistema imune, não há geração de memória imunológica
Fonte: Abbas, Lichtman e Pilai (2007, p. 9).
Um exemplo importante de imunização passiva é a transferência de anticorpos da classe IgG 
da mãe para o feto durante a gestação pela barreira placentária. Essa imunização será essencial 
para os primeiros meses de vida do recém-nascido, quando o bebê ainda não possui anticorpos de 
memória imunológica.
Agora que os conceitos básicos de resposta imune foram apresentados, serão descritas com mais 
detalhes as moléculas antígenos e anticorpos, pois são essenciais para o desenvolvimento dos métodos 
imunológicos do diagnóstico.
25
IMUNOLOGIA CLÍNICA
2 ANTÍGENOS E ANTICORPOS
Para a realização dos métodos sorológicos e suas aplicações, é necessário saber o que é um antígeno, 
um imunógeno, um hapteno e um epítopo, assim como as funções e as classes dos anticorpos.
Dessa forma, inicialmente, será descrita a molécula do anticorpo, que são proteínas circulantes 
presentes apenas nos vertebrados, produzidas pelos plasmócitos, um linfócito B diferenciado, em 
resposta a um antígeno. Os mediadores da resposta imune humoral contra os micróbios são altamente 
diversificados e específicos. O anticorpo bem como as moléculas do MHC e os TCR constituem as classes 
de moléculas que fazem o reconhecimento dos antígenos dentro da imunidade adquirida. Sendo que os 
anticorpos possuem maior capacidade para discriminar e se ligar a diferentes tipos de antígenos.
Os anticorpos podem ser encontrados na superfície das células B, funcionando como receptores 
de antígenos. Quando são secretados, são encontrados na circulação, nos tecidos e nas mucosas. A 
sua secreção ocorrerá após a ativação e transformação do linfócito B em plasmócitos. Os anticorpos 
podem, nesses locais, ligar-se de forma específica em seus antígenos, neutralizando toxinas, bloqueando 
a entrada dos patógenos nos tecidos e evitando a disseminação do agente invasor.
São funções efetoras das moléculas de anticorpos:
• Neutralização de microrganismos ou toxinas microbianas.
• Ativação do sistema do complemento.
• Opsonização de patógenos.
• Citotoxicidade das células mediada por anticorpos.
• Hipersensibilidade imediata, desencadeando a função dos mastócitos.
 Lembrete
Uma opsonina é uma molécula que sinaliza para o sistema imunológico 
a presença de um invasor, fazendo com que ele seja mais facilmente 
localizado e eliminado.
Os linfócitos B são os produtores exclusivos dos anticorpos. Essas proteínas, inicialmente, estão 
expressas na superfície das células, funcionando como receptores de antígeno, o BCR. Após a exposição 
ao seu antígeno específico nos tecidos linfoides, principalmente no baço e nos linfonodos, os plasmócitos, 
sua forma ativada, vão iniciar a produção dos anticorpos. Alguns plasmócitos maduros produtores de 
anticorpos de longa duração vão permanecer em alguns tecidos, principalmente, na medula óssea, 
participando da memória imunológica.
26
Unidade I
As formas secretadas dos anticorpos estão presentes em diversos fluidos biológicos, por exemplo, na 
porção líquida do sangue, o plasma, nas secreções das mucosas e no líquido intersticial. Um indivíduo 
adulto saudável, de 70 Kg, produz aproximadamente de 2 a 3 g de anticorpos por dia, sendo a segunda 
proteína mais presente na corrente sanguínea, ficando atrás apenas da albumina. Na circulação, os 
anticorpos são na sua maioria da classe IgG e possuem uma meia-vida de cerca de 3 semanas.
Para uma melhor compreensão da funcionalidade dos anticorpos, é crucial conhecer a sua estrutura. 
Anticorpos são proteínas globulares encontradas no terceiro grupo de migração das globinas presentes 
no plasma quando submetidas a uma eletroforese de proteínas, nomeadas de gamaglobulinas ou 
imunoglobulinas (Ig). Todas as moléculas de anticorpos têm uma estrutura molecular básica semelhante 
entre elas, porém apresentam uma grande variedade nas suas regiões de ligação aos antígenos, o que 
permite que ocorra a ligação a uma enormidade diferente de antígenos pelos anticorpos. Na região 
variável, ocorre o reconhecimento e a ligação dos antígenos específicos, porém as outras funções 
efetoras estão associadas à região conservada, que é semelhante aos anticorpos de uma mesma classe. 
Para um melhor entendimento da estrutura, observe a figura seguinte.
-S
-S
-
-S
-S
-
-S
-S
-
-S
-S
-
-S-S-
-S-S-
-S-
S-
-S-
S-
-S-
S-
-S-
S-
-S-
S-
-S-
S-
CH3
CH2
CH1
Do
br
ad
iç
a
CH0
Fab
Fc
N
N N
N
VH
C
CC
C
-S-S-
-S-S--S-
S-
Atividade 
biológica
Antígeno
Figura 12 – Estrutura do anticorpo. É possível observar que o anticorpo possui duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. Toda a 
parte estrutural, representada em azul, constitui a porção conservada do anticorpo, Fc, que exerce as funções efetoras da molécula. 
Entretanto a região representada em laranja é a porção variável, que tem como função reconhecer e ligar-se aos antígenos, nomeada 
de Fab (ab – antigen binding). Essa porção de aminoácidos e variável diferencia as moléculas entre elas
Adaptada de: Montassier ([s.d.]a, p. 16).
A estrutura molecular do anticorpo (figura anterior) é constituída de duas cadeias pesadas 
idênticas e duas cadeias leves idênticas, formadas por repetições homólogas de aminoácidos com 
aproximadamente 110 resíduos cada, que se dobram formando os domínios das Ig. Essas dobras, 
assim como as cadeias, estão unidas por pontes dissulfetos. Nessas alças, estão presentes aminoácidos 
envolvidos no reconhecimento de antígenos.
Na extremidade do anticorpo na qual estão presentes tanto a cadeia pesada como a cadeia leve – 
que, na região aminoterminal da molécula, é a única região variável (representada na cor laranja na 
27
IMUNOLOGIA CLÍNICA
figura anterior) – ocorre o reconhecimento e a ligação do antígeno, nomeada de Fab (do inglês 
antigen binding) Já na porção carboxiterminal dos anticorpos, há apenas as duas cadeias pesadas; 
é a região conservada, nomeada de Fc, que apresenta as funções efetoras da molécula.
Ainda é possível observar na figura anterior que uma única molécula de anticorpo possui duasporções Fab; por isso, pode se ligar simultaneamente a dois antígenos; entretanto, como as cadeias 
são idênticas, a ligação simultânea vai ocorrer apenas quando houver dois antígenos idênticos. Para 
possibilitar a ligação de antígenos iguais que estão “distantes” em uma célula, a molécula do anticorpo 
pode movimentar-se, afastando ou aproximando suas porções Fab devido à presença de uma estrutura 
nomeada de dobradiça (hinge, em inglês). A ligação dos anticorpos nas células do sistema imune, como 
nos mastócitos, nos eosinófilos, nos neutrófilos, por exemplo, é feita pela porção Fc. Quando o anticorpo 
se liga à membrana dessas células, passa a funcionar como um receptor para a ativação dessas células.
A maior parte das diferenças nas sequências está em uma extensão da estrutura do anticorpo, 
conhecida como segmento hipervariável, constituída dos domínios V das proteínas, tanto na cadeia 
pesada, VH, como na cadeia leve, VL.
A porção Fab dará a diversidade e a especificidade das moléculas de anticorpos, mas são as 
características da porção Fc que serão responsáveis pela divisão dos anticorpos em classes e subclasses. 
As classes dos anticorpos também são nomeadas de isotipos. São elas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que, 
em seres humanos, podem ser divididas em subclasses: IgA1 e IgA2, e IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Entre as 
classes, as cadeias pesadas vão apresentar a mesma sequência de aminoácidos. Estas serão pertencentes 
ao mesmo isotipo e designadas pelas letras do alfabeto grego, sendo respectivamente α (α1 e α2), 
δ, ε, γ (γ1, γ2, γ3 e γ4) e µ. Além disso, as IgA, IgD e IgG possuem três domínios conservados, enquanto 
as IgE e IgM possuem quatro (figura seguinte).
IgG
IgD
IgM
IgA
IgE
Figura 13 – Diferentes classes dos anticorpos. Os anticorpos podem ser divididos em cinco 
diferentes classes de acordo com a constituição de suas cadeias pesadas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM
Fonte: Stephens et al. ([s.d.], p. 49).
Na membrana dos linfócitos B, são encontrados dois tipos de anticorpos: a IgD e a IgM, que serão os 
receptores de antígenos, participando do reconhecimento dos antígenos e da ativação celular. Depois, 
28
Unidade I
os anticorpos que serão inicialmente secretados serão da classe IgM e, posteriormente, haverá a maturação 
por afinidade desses anticorpos, quando começarão a ser secretados anticorpos da classe IgG com a mesma 
especificidade, ou seja, a mesma porção Fab, mas com a troca do isotipo, pela troca da cadeia pesada de 
µ para γ. A forma secretada, livre nos líquidos biológicos, possui sua porção carboxiterminal hidrofílica.
Como descrito, a primeira molécula de anticorpo a ser secretada será da classe IgM, porém ela é 
diferente daquela ancorada na membrana plasmática do linfócito B, a IgM estará na forma pentâmera, 
ou seja, cinco monômeros de IgM estarão ligados entre si pela porção Fc. A IgA, por sua vez, é secretada 
como um dímero. Já a IgG e a IgE estão na forma de monômero. A IgD não é secretada. Por esse motivo, 
somente é encontrada ligada à membrana das células B.
Além das cadeias pesadas, os anticorpos possuem também as cadeias leves. Cada molécula vai 
possuir duas cadeias leves, idênticas entre si, que podem ser κ ou λ, sendo sempre ou duas κ, ou duas λ. 
Em uma mesma molécula, a cadeia κ é a mais comum, estando presente em 60% das moléculas. Essas 
variedades de moléculas e os constituintes dos anticorpos são extremamente necessários, pois as 
diferentes classes de anticorpos possuem funções efetoras, meia-vida sérica e concentrações distintas 
entre si, apresentadas no quadro seguinte, o que permite uma grande gama de mecanismos efetores na 
resposta imune.
Quadro 2 – Características das classes de anticorpos
Classe Concentração sérica (mg/dl)
Meia-vida 
sérica (dias) Funções
IgA 3,5 6 Imunidade de mucosas
IgD Traços 3 Receptor nas células B naive 
IgE 0,05 2 Defesa contra helmintos e hipersensibilidade imediata (alergias)
IgG 13,5 23 Opsonização, ativação do complemento, citotoxicidade mediada por anticorpos, imunidade neonatal
IgM 1,5 5 Receptor nas células B naive, ativação do complemento 
Por ser secretada inicialmente, logo após a ativação do linfócito B, a molécula de anticorpo da classe IgM 
é associada aos processos agudos, ou iniciais, de uma infecção; já as de classe IgG, aos processos crônicos. 
Além disso, quando se fala de memória imunológica, as IgG são as moléculas que podem ser detectadas. 
Por isso, a quantificação de IgM é amplamente utilizada para o diagnóstico de patologias durante a 
manifestação de sinais e sintomas; já a IgG auxilia no diagnóstico diferencial de doença pregressa 
e vacinação.
 Observação
Um resultado positivo de IgG em um exame para diagnóstico não permite 
a diferenciação entre doença ativa ou cura, ou seja, memória imunológica.
29
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Observe a figura seguinte. Nela, está exemplificado como ficarão os níveis de produção de anticorpos 
no curso de uma patologia. Independentemente de qual seja o patógeno, após entrarmos em contato com 
o microrganismo, há um período de, em média, 7 dias, em que não é possível quantificar anticorpos. Esse 
período compreende o tempo necessário para o corpo ativar a resposta imune inata e, posteriormente, 
a adquirida. Essa última compreende a produção de anticorpos e é nomeada de janela imunológica.
Logo após o início da produção de anticorpos pelos linfócitos B, a primeira classe que será secretada 
e poderá ser quantificada nos líquidos biológicos é a IgM, associada, por esse motivo, à doença na 
fase inicial ou aguda, pois a possibilidade de sua quantificação coincide com a manifestação clínica da 
doença. Entretanto os níveis dessa imunoglobulina vão diminuir com o passar do tempo e deixarão de 
ser quantificáveis.
A classe IgG, por outro lado, será secretada em um segundo momento, quando houver o 
amadurecimento da afinidade dos linfócitos B. Essas moléculas terão mais função efetora de eliminação 
do patógeno e permanecerão com níveis quantificáveis por um longo período. Em alguns casos, se 
houver a formação de memória imunológica, sempre será possível quantificar essa classe de anticorpos 
após o contato com o patógeno em questão. Por isso a presença de IgG quantificável contra um 
patógeno está associada a processos crônicos, doenças curadas e vacinação prévia. Observe o gráfico a 
seguir divulgado pela Labtest (2020).
0
Infecção
21 427 28 014 35 7 14 21 28 35
Dias
IgM
IgM
Início dos 
sintomas
Testes sorológicos
Técnica de PCR
N
ív
ei
s d
e 
an
tíg
en
o/
an
tic
or
po
s
Nova exposição
Carga viral
IgG
Figura 14 – Níveis de anticorpos IgM e IgG após o contato com um antígeno. A primeira classe a ser secretada e passível de 
quantificação será a IgM. A IgG começará a ser secretada logo a seguir, no decorrer do desenvolvimento de resposta imunológica. 
Entretanto os níveis de IgM diminuem e deixam de ser quantificados primeiro; já os de IgG vão permanecer detectáveis 
por um longo período
Outra característica importante da classe de anticorpo IgG é a capacidade que ela possui de ultrapassar 
a barreira placentária, ou seja, as mulheres durante a gestação conseguem imunizar de forma passiva 
o seu feto, transferindo seu repertório de anticorpos da classe IgG. Assim, esse feto, durante o período 
30
Unidade I
de formação e logo após o nascimento, por um período de aproximadamente 6 meses, estará protegido 
contra os patógenos com os quais a mãe já tenha entrado em contato.
Esse evento de imunização passiva de mãe para o feto é extremamente importante, pois permite 
que o neonato possua por um tempo proteção contra uma boa quantidade de patógenos, até que haja 
o amadurecimento de seu sistema imune e a obtenção de memória imunológica por imunização ativa, 
seja de forma natural ou por vacinação. Lembrando que o amadurecimento do sistema imunológico se 
completará apenas quando a criança alcançar 8 anos de idade.
Por esse motivo também os programas de vacinação infantil ocorrem principalmente no primeiro 
anode vida de uma criança, permitindo que a imunização passiva, vinda da mãe, seja substituída por 
imunização ativa, vinda da vacina, que vai gerar memória imunológica, evitando a ocorrência da doença 
em questão por toda a existência desse indivíduo ou, pelo menos, nos primeiros anos de vida.
Um pouco mais sobre as funções efetoras dos anticorpos será apresentado no decorrer deste livro. 
As classes IgA e IgE serão abordadas com mais detalhes adiante.
Outra molécula crucial para a resposta imune é o antígeno, que é qualquer substância que pode 
se ligar de maneira específica em um receptor das células T, TCR, ou em um anticorpo de superfície 
da célula B, BCR, ou ainda em anticorpos secretados e nas moléculas do MHC. A característica do 
antígeno é ser uma molécula capaz de conseguir desencadear uma resposta imunológica. Os antígenos 
reconhecidos por anticorpos podem ser carboidratos, lipídeos, hormônios, metabolitos intermediários, 
ácidos nucleicos e proteínas; já os de células T são principalmente os peptídeos.
Mesmo havendo o reconhecimento dos linfócitos específicos aos antígenos, nem sempre vai ocorrer 
a ativação celular de resposta imune, pois os receptores conseguem diferenciar os antígenos próprios 
dos não próprios. Quando houver ativação de resposta imunológica nomeamos de imunógeno, um 
antígeno que possui antigenicidade, que é apenas a capacidade de se ligar a um receptor ou anticorpo.
Em geral, quanto maior for a molécula dos antígenos, maior a probabilidade de ela ser reconhecida 
como não própria. Além disso, a composição química, a estranheza e a possibilidade de serem degradados 
permitem que o organismo reconheça como antígeno de patógeno.
Para a ativação de linfócitos B diretamente pelo antígeno, é necessário que o antígeno seja uma 
macromolécula, que haja ligações múltiplas nos anticorpos da superfície. Caso o antígeno sozinho não 
seja capaz de ativar o linfócito B, será necessária a participação dos linfócitos T auxiliares, CD4+, para 
estimular a sua ativação em plasmócitos, com posterior produção e secreção de anticorpos. Lembrando 
que o linfócito B é um fagócito, ele próprio poderá agir como uma APC apresentando um peptídeo 
na molécula MHC classe II para a célula T. Os linfócitos TCD4+ vão liberar citocinas, IL-2 e IL-4, que 
estimularão o linfócito B para a diferenciação em plasmócito (figura seguinte).
31
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Célula T auxiliar Célula B
TCR
CD40
Peptídeo 
MHC II
CD4
0L
CD4
IL-2/4/5
ILR
BCR
BCR
Antígeno
Figura 15 – Ativação de linfócito B dependente de linfócito T auxiliar. Quando o antígeno sozinho não for grande e imunogênico 
o suficiente para a ativação do linfócito B, além da ligação direta do antígeno no BCR, a célula B vai fagocitar e apresentar um 
peptídeo na molécula MHC classe II para o linfócito TCD4+, que vai liberar citocinas, IL-2, IL-4 e IL-5, que vão ativar o linfócito B
Adaptada de: Ighodaro et al. (2017, p. 59).
Substâncias muito pequenas com caráter antigênico são os haptenos. Por serem moléculas 
pequenas, menores do que 4 kDa, como, por exemplo, compostos químicos, medicamentos, metais, 
entre outros, terão dificuldade física em ativarem os receptores celulares. Por esse motivo, sozinhas, 
não conseguem ativar resposta imune, sendo que a ligação em uma molécula carreadora aos haptenos, 
proteínas, vai permitir o acoplamento do determinante antigênico com os receptores de linfócitos. 
Normalmente, essas proteínas são a albumina. A associação de um hapteno com a molécula carreadora 
é um grupo haptênico.
Já as macromoléculas, que são muito maiores do que os sítios de ligação do antígeno, terão regiões 
específicas de ligação para o anticorpo, que são os determinantes ou epítopos. Um antígeno pode 
ter mais do que um epítopo e se ligar a mais de um anticorpo simultaneamente. Em alguns casos, 
é possível que um mesmo epítopo se repita na superfície desse antígeno, o que é a multivalência 
ou polivalência.
32
Unidade I
Determinantes antigênicos
Antígeno
Vírus
Antígenos
Antígenos
Proteínas 
globulares
Anticorpos reagem com os 
determinantes antigênicos
Figura 16 – Antígenos e epítopos. Um único microrganismo pode apresentar vários epítopos, 
ou determinantes antigênicos. Cada um será reconhecido por um diferente anticorpo
Adaptada de: Sistema... ([s.d.], p. 11).
Os microrganismos normalmente não apresentam polivalência. Com isso, a ativação da resposta 
imunológica será policlonal: vários receptores celulares de linfócitos diferentes serão ativados de forma 
simultânea, levando à produção policlonal de anticorpos - diferentemente do que é realizado hoje em 
laboratórios, onde é isolado um único epítopo com o intuito de produzir anticorpos monoclonais.
 Observação
Um anticorpo monoclonal possui alta especificidade, reconhece 
um único epítopo; seu uso no diagnóstico e como medicamento vem 
aumentando de forma significativa.
Além disso, a disposição dos determinantes antigênicos no antígeno vai interferir na forma em 
que o anticorpo se ligará na molécula. É possível encontrar determinantes lineares proteicos que 
ficarão expostos na forma enovelada ou estendida. Quando o determinante antigênico está em uma 
posição justaposta da estrutura primária, é o determinante conformacional; caso ocorra 
uma desnaturação dessa proteína, o anticorpo fica incapaz de se ligar no determinante. Já os 
determinantes neoantigênicos ou neoantígenos são produzidos quando a proteína for sofrer uma 
modificação, podendo ser fosforilação ou proteólise, o que altera a ligação antigênica (figura seguinte).
33
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Determinante 
conformacional
Perda do determinante 
por desnaturação Ig liga-se ao determinante somente 
na proteína desnaturada
Determinante próximo 
ao sítio da proteólise
Ig liga-se ao determinande 
na proteína nativa ou 
desnaturada
C
C
C
C
C
C
N
N
N
N
N
N
N
N
C
C
Determinante 
linear
Determinante 
acessível
Determinante 
inacessível
Determinante 
ausente
Novo 
determinante
Sítio de 
proteólise 
limitadaDesnaturaçãoDesnaturação
Desnaturação
Determinante neoantigênico 
(criado por proteólise)
Figura 17 – Representação dos determinantes antigênicos. Os determinantes antigênicos podem ser do tipo conformacional, 
quando a estrutura terciária da proteína tem de ser conservada para que o anticorpo possa se ligar ao determinante. Nesses casos, 
a desnaturação proteica impede a ligação. Pode haver ainda determinantes lineares, em que a sequência de aminoácidos que o 
anticorpo reconhece está justaposta na estrutura primária, e neoantigênicos, que são os determinantes formados após uma alteração 
na proteína, o que permitirá a ligação do anticorpo
Fonte: Abbas, Lichtman e Pilai (2007, p. 91).
E, ainda, para a ligação dos anticorpos aos antígenos, vários fatores concorrem, influenciando na 
imunogenicidade do antígeno. Entre eles, temos:
• a natureza química da molécula (as proteínas são as moléculas que apresentam maior 
imunogenicidade);
• as características filogenéticas, uma vez que, quanto maior a distância filogenética entre o 
antígeno e o receptor, maior a probabilidade de aquele ser reconhecido como não próprio;
• o tamanho e a complexidade da molécula, a sua estrutura espacial, que poderá facilitar ou 
dificultar o reconhecimento do sistema imune;
• a acessibilidade (os epítopos internos não podem ser reconhecidos), a estabilidade (uma rápida 
degradação não permite o reconhecimento) e a forma de administração do antígeno;
34
Unidade I
• a presença de adjuvantes, que auxilia na resposta imune, e as vias de administração subcutânea, 
intramuscular e intradérmica, que impedem a rápida circulação na corrente sanguínea e, por 
conseguinte, a degradação do antígeno de forma precoce;
• as características do hospedeiro respondedor, pois um hospedeiro pode ou não responder a 
um antígeno.
2.1 Interações antígeno-anticorpo
O estudo dessa ligação pode ser feito in vitro, observando a formação da ligação de antígenos 
multivalentes ao seu anticorpo específico,com a formação dos complexos imunes. A ligação do 
anticorpo ao antígeno é não covalente, ou seja, pode ser desfeita. Existem vários tipos de interações 
possíveis, como as com a força eletrostática, as pontes de hidrogênio, as forças de Van der Waals e as 
hidrofóbicas. Por ser uma ligação reversível, segue os princípios básicos da termodinâmica, a lei das 
massas de Guldberg e Waage:
[Ag]+[Ac] 
kA
 [Ag-Ac]
KA = [Ag-Ac]=([Ag]+[Ac])
Onde:
KA: constante intrínseca de associação (proporcional à afinidade)
[Ag]: concentração de antígeno livre
[Ac]: concentração de anticorpo livre
[Ag-Ac]: concentração de imunocomplexo formado
O grau de afinidade vai corresponder com a interação da metade dos anticorpos presentes no 
sistema analisado. KA será diretamente proporcional à quantidade de complexos imunes formados. 
Pode-se determinar a força de ligação de um antígeno a um anticorpo em um único sítio de ligação 
pela técnica de diálise de equilíbrio. A afinidade de um anticorpo será inversamente proporcional 
à constante de dissociação, que é a concentração necessária de antígenos para ocupar metade 
das moléculas de anticorpos do sistema. Quanto menos antígenos forem necessários, maior será a 
afinidade. Por isso, ela representa a força com que o antígeno se liga em um anticorpo.
Quando é medida a ligação em todos os sítios do anticorpo, tem-se a avidez, que pode ser 
monovalente, bivalente ou polivalente, quando apresentar apenas um, dois ou vários antígenos ligados 
na molécula de anticorpo, respectivamente. Quanto maior o número de ligações, maior será a avidez. 
Por isso, as moléculas de classe IgM, que podem ligar até dez epítopos ao mesmo tempo, são as que 
possuem maior avidez.
35
IMUNOLOGIA CLÍNICA
106
Avidez
1010
Avidez
104
AfinidadeKeq = 
Figura 18 – Valência e avidez das interações antígeno-anticorpo. Quanto mais ligações a antígenos 
um anticorpo é capaz de fazer, maior será a sua avidez. Com isso, os anticorpos podem 
ser monovalentes, bivalentes ou polivalentes. Observe que, em anticorpos monovalentes, 
a força de ligação é descrita como afinidade, pois corresponde à força de ligação de 
um único sítio ao seu epítopo específico
Fonte: Mayer ([s.d.], p. 3).
A maioria dos anticorpos é extremamente específica para um antígeno, tornando-se capaz de 
distinguir pequenas variações entre os antígenos, porém, quando o estímulo para a produção 
de anticorpos é realizado contra uma preparação antigênica, pode ocorrer a reação cruzada, em que 
o anticorpo se liga aos antígenos estruturalmente relacionados, um antígeno homólogo. Anticorpos de 
baixa afinidade podem se ligar a antígenos muito diferentes do seu epítopo específico em uma reação 
cruzada com um antígeno heterólogo.
A especificidade dos anticorpos é aplicada ao reconhecimento da molécula antigênica. Por isso, é 
necessário que a especificidade seja muito refinada. Como todos os seres possuem muita semelhança, 
a alta especificidade dos anticorpos impede o reconhecimento de antígenos próprios, quando foram 
gerados em uma resposta contra microrganismos.
2.2 Produção de anticorpos monoclonais
Utilizar anticorpos como ferramenta diagnóstica vem se tornado cada vez mais comum, 
principalmente no diagnóstico clínico. Porém, quando se tem a produção natural, são gerados soros 
contendo anticorpos policlonais, derivados de uma resposta imune ocasionada por diversos epítopos 
e expansão de vários clones de linfócito B. Nesses soros, há a presença de uma grande variedade de 
anticorpos, o que permite que esses soros se liguem em muitos epítopos diferentes. Por essa razão, 
a aplicabilidade de anticorpos policlonais proporciona muitas ligações não esperadas, diminuindo a 
confiabilidade das técnicas.
 Lembrete
É chamada de soro uma solução com a presença de anticorpos. Pode 
ser policlonal, com diferentes tipos de anticorpos, ou monoclonal, com um 
único tipo de anticorpo.
36
Unidade I
Para melhorar a especificidade e confiabilidade das técnicas, é melhor, sempre que possível, a 
utilização de anticorpos monoclonais, que vão garantir a ligação em um único epítopo. Contudo, 
como descrito, um antígeno microbiano pode conter diversos epítopos; com isso, estimula-se uma 
expansão policlonal de linfócitos B.
Então, o uso de técnicas de produção de anticorpos em cobaias, coelhos, cabras, cavalos, entre outros 
animais, não permite a produção de um soro monoclonal, uma vez que nessas técnicas é introduzido 
o epítopo de interesse na cobaia, que vai produzir anticorpos contra ele. Posteriormente, o soro do 
animal é separado do sangue, entretanto esse soro será policlonal, possuindo outros anticorpos além 
do desejado.
Por isso, em 1975, Georges Köhler e César Milstein descreveram a primeira técnica para a obtenção 
de anticorpos monoclonais. A técnica, inovadora para o período, fez com que os cientistas fossem 
laureados com o prêmio Nobel em 1984. Hoje é amplamente utilizada e é baseada no fato de que 
um clone de linfócito B só é capaz de produzir um único anticorpo de especificidade única. A técnica 
descrita por esses cientistas consiste em utilizar células de mieloma (um tipo de tumor de linfócito B), 
que podem ser imortalizadas em uma cultura de células in vitro. Para tal, é necessário fazer a fusão 
dessas células com um linfócito B com a especificidade de interesse, produzindo e secretando anticorpos.
A fusão é necessária porque in vitro uma cultura de linfócitos B não pode ser mantida por longos 
períodos, não é passível de ser imortalizada. Assim é produzido o hibridoma, que poderá ser mantido 
secretando o anticorpo de interesse de forma indefinida. Como os anticorpos são produzidos a partir de 
um único clone, os anticorpos são ditos monoclonais.
Para a fusão, é necessária uma linhagem de mieloma com a possibilidade de indução de defeito na 
via de síntese de nucleotídeos. Assim essas células vão crescer em meio a cultura normal, mas não em 
meios seletivos. Além disso, essas linhagens devem ser não secretoras de IgG. Já foram obtidas células 
desse tipo de mielomas de ratos LOU/c, células da linhagem MOPC-21, entre outras.
As linhagens de mieloma devem se tornar deficientes da enzima hipoxantina-guanina 
fosforribosiltransferase (HGPRT) ou timidina quinase (TK) através de mutagênese. A ausência dessas 
enzimas vai permitir o uso de meios de cultura seletivos com a presença de substrato dessas enzimas. 
As células HGPRT-negativas ou TK-negativas serão incapazes de sobreviver em meio HAT, que contém 
hipoxantina, aminopterina e timidina. Assim, apenas as células que forem fusionadas aos linfócitos B, 
que possuem as enzimas, vão sobreviver, permitindo separar os hibridomas da cultura celular. Células 
que não fizerem fusão vão morrer - no caso dos mielomas, pela ausência das enzimas; e dos linfócitos 
B, por não se dividirem in vitro.
Para que esse linfócito B, que será fundido ao mieloma, seja secretor do anticorpo monoclonal, 
anteriormente à fusão, deve-se imunizar camundongos, ratos ou hamsters com o antígeno de interesse. 
Após a imunização, é retirado o baço ou linfonodo do animal, que são órgãos ricos em linfócitos B. 
Essas células serão então misturadas com as células do mieloma HGPRT-negativas ou TK-negativas não 
secretoras de imunoglobulinas. A fusão é feita com o uso de polietilenoglicol.
37
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Após a seleção no meio HAT, que é feita em placa de 96 poços, como cultura celular em monocamada, 
vai ser mantida em condições ideais de crescimento. Posteriormente o sobrenadante da cultura 
desses hibridomas será testado quanto à presença do anticorpo de interesse utilizado na imunização 
da cobaia. O teste da presença do anticorpo poderá ser feito por ensaio imunoenzimático (ELISA), 
radioimunoensaio (RIA), Western Blotting, entre outras técnicas imunológicas.
Quando o anticorpo for encontrado no sobrenadante, essas células serão imediatamente clonadas 
e reclonadas, sempre testando a presença do anticorpo no sobrenadante. Posteriormente, quando 
for confirmado várias vezesque o hibridoma está secretando o anticorpo de interesse, a cultura será 
expandida, ou in vitro ou in vivo, com a inoculação do tumor num animal, e poderá ser mantida 
produzindo o anticorpo de forma indeterminada (figura seguinte).
Cultura de células 
de mieloma
Células do baço
Células de mieloma
Antígeno
Seleção de células que produzem 
o anticorpo correto
Seleção e crescimento 
de células híbridas
Propagação de 
clones
Crescimento em 
cultura
Anticorpo Anticorpo
Indução de 
tumores
Congelar
Descongelar
Figura 19 – Produção de anticorpos monoclonais. Esquema ilustrativo da produção de anticorpo monoclonal. São necessárias células 
de mieloma em cultura e o baço ou linfonodo de uma cobaia inoculada com o antígeno de interesse. Essas células vão ser fusionadas, 
formando um hibridoma. Depois, os hibridomas serão selecionados em meios de cultura e o sobrenadante da cultura será testado 
para averiguar a presença do anticorpo monoclonal. Quando a cultura for positiva para a presença do anticorpo, ela será expandida e 
poderá ser mantida in vitro ou in vivo
Disponível em: https://bit.ly/3vR7xE8. Acesso em: 18 maio 2021.
38
Unidade I
A importância do uso do anticorpo monoclonal é enorme, uma vez que ele possui diversas 
aplicações, entre elas:
• diagnóstico, para detecção de patógenos;
• diagnóstico, nas imuno-histoquímicas;
• aumento da especificidade dos testes sorológicos;
• tratamento oncológico;
• tratamento de doenças autoimunes;
• tratamento de doenças infeciosas, entre outras.
 Saiba mais
Para mais informação sobre anticorpos monoclonais, leia o artigo:
GRILO, A. L.; MANTALARIS, A. The increasingly human and profitable 
monoclonal antibody market. Trends of Biotechnology, v. 37, n. 1, p. 9-16, 
Jan. 2019.
Com o aumento do uso de anticorpos monoclonais como medicamento, principalmente, contra o 
câncer, o que vem se mostrando eficaz e com baixo efeito colateral, tornou-se necessária a modernização 
da produção, para maior rendimento e menos efeitos adversos. São exemplos de alguns anticorpos 
monoclonais utilizados na medicina humana:
• Herceptin: tratamento de câncer de mama, previne o crescimento do tumor ao se ligar ao 
receptor HER-2.
• OKT3: previne rejeição de órgãos transplantados ao se ligar no CD3.
• Infliximab: promissor em doenças inflamatórias como artrite reumatoide, ao se ligar ao TNF-α.
• Rituximab: tratamento de linfomas de linfócito B, liga-se ao CD20 do linfócito B.
• Daclizumab: prevenção de rejeição a transplante renal, liga-se em uma porção do receptor de IL-2.
Mas, apesar da eficácia e do uso em humanos, há uma dificuldade intrínseca a utilizar anticorpos 
monoclonais produzidos em camundongos. Estes possuem a abreviação mab no seu nome, pois 
como são produzidos em outra espécie, são reconhecidos pelo sistema imunológico como estranhos. 
39
IMUNOLOGIA CLÍNICA
O paciente em terapia poderá produzir anticorpos anticamundongo (HAMA). Nesses casos, a terapia se 
torna ineficaz, pois o paciente vai neutralizar e degradar o anticorpo rapidamente, não havendo tempo 
para atingir o efeito esperado.
 Lembrete
Anticorpos são globulinas, ou seja, proteínas. As proteínas são as 
moléculas que melhor apresentam características antigênicas para a 
ativação do sistema imunológico.
Por isso, a produção para o uso na medicina humana precisou ser modernizada, sendo feita de forma 
humanizada. Como não é possível utilizar seres humanos como cobaias, é produzido um anticorpo 
quimérico; o anticorpo com a região variável de interesse é produzido em camundongos. Posteriormente 
essa região é fundida com a região constante de uma molécula de anticorpo humano. Essa produção é 
feita por técnicas de engenharia genética.
É feita a inserção apenas dos aminoácidos da região hipervariável do sítio de combinação com 
o antígeno na molécula de anticorpo humanizado. Os genes são expressos em células de mamíferos 
cultivadas em cultura. Outra forma de solucionar a produção de HAMA seria o uso de camundongos 
knockout, que produziriam anticorpos humanos.
Pela dificuldade de obter os anticorpos monoclonais, o custo de produção ainda é elevado, o que 
dificulta o uso em ampla escala.
3 MÉTODOS NÃO MARCADOS E MARCADOS
Serão descritos diversos métodos utilizados em imunologia clínica que apresentam características 
semelhantes, como, por exemplo, a utilização da formação do complexo antígeno-anticorpo para 
quantificar a presença de diferentes analitos. Contudo esses métodos têm várias diferenças na sua 
constituição e finalidade de uso. Por isso, para melhor entendimento de cada método e seus princípios, 
eles serão divididos em não marcados e marcados.
Os métodos não marcados são mais simples. Eles quantificam antígenos e anticorpos apenas pela 
formação dos complexos imunes. São eles: as imunoprecipitações, as aglutinações e os ensaios líticos. 
Já os métodos marcados têm um antígeno ou anticorpo “marcado”, ou seja, que estará conjugado com 
uma molécula, o que o torna capaz de aumentar a sensibilidade e a visualização das reações.
As técnicas marcadas são mais modernas e conseguem detectar menores concentrações 
do analito nas amostras. Os conjugados utilizados podem ser enzimas, isótopos radioativos ou 
fluoróforos. Os métodos são nomeados de ensaio imunoenzimático (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e 
imunofluorescência (IFA), respectivamente.
40
Unidade I
3.1 Métodos não marcados
3.1.1 Imunoprecipitação
As técnicas de imunoprecipitações permitem identificar e quantificar, semiquantitativamente, as 
precipitações que ocorrem com a formação de complexos imunes, que são ligações de antígenos a 
anticorpos. Nessa técnica, observada pela primeira vez em 1897 por Rudolf Kraus, vai ocorrer a mistura 
de antígenos e anticorpos solúveis, que preferencialmente devem ter antígenos multivalentes quanto 
ao número de epítopos e os anticorpos devem ser policlonais. Para anticorpos monoclonais, é essencial 
que o epítopo esteja em uma posição acessível e em grande concentração no antígeno ao qual o 
anticorpo se ligará.
A formação dos imunocomplexos vai acontecer com uma mistura de um antígeno solúvel com um 
anticorpo até que o número de ligações se torne grande o suficiente, e, com isso, insolúvel, que precipita. 
Os anticorpos em solução vão precipitar com a adição gradual de antígenos solúveis na mistura.
No início da adição, haverá excesso de anticorpos na reação e, com isso, as ligações em poucos 
antígenos não serão suficientes para formarem imunocomplexos para a precipitação, a zona de excesso 
de anticorpos. Com a adição de mais antígenos, será atingida a concentração equivalente entre as 
duas moléculas, o que vai permitir a formação de complexo imune e a máxima precipitação, a zona de 
equivalência. Contudo, quando houver o excesso de antígenos, um anticorpo ficará ligado em suas 
duas regiões Fab, não ocorrendo a formação do imunocomplexo, diminuindo a precipitação, a zona de 
excesso de antígenos (figura seguinte).
Excesso 
Ac
Ac ≡ Ag
Concentração do analito
Im
un
op
re
ci
pi
ta
çã
o
Excesso 
Ag
Figura 20 – Imunoprecipitação. A adição de antígeno solúvel em uma mistura de anticorpos vai permitir a formação de 
imunocomplexos, insolúveis, que vão precipitar. No início, na zona de excesso de anticorpos, haverá pouca precipitação. Na zona de 
equivalência, ocorre a formação de muito complexo imune, havendo muita precipitação. Na zona de excesso de antígeno, novamente 
a formação de imunocomplexo é comprometida, diminuindo a precipitação
Fonte: Labtest (2009, p. 2).
41
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Porém a visualização do imunoprecipitado em meio líquido é difícil, pois já há turvação e coloração 
natural das amostras, que é variável. Por essa razão, é uma metodologia de difícil padronização, mas esse 
inconveniente é resolvido pelas possibilidades de utilizar esse princípio nas técnicas de automação, que 
são os métodos de nefelometria e turbidimetria, muito mais sensíveis do que o olho humano, capazes 
de corrigir ou anular os interferentesinerentes das amostras.
Como essa técnica depende da capacidade da ligação do antígeno ao anticorpo, que é reversível, 
não covalente, vários fatores podem interferir na capacidade de ligação, e deverão ser controlados para 
evitar falsos negativos ou positivos. São alguns dos interferentes do método:
• proporções relativas dos reagentes;
• temperatura;
• pH;
• força iônica;
• características de afinidade e avidez dos anticorpos.
Além disso, atualmente, a técnica manual de precipitação é usada preferencialmente em meio 
gelificado, o que facilita a leitura e ainda permite a redução do volume de reagentes utilizados para que 
ocorra a interação do antígeno com o anticorpo, mas, em contrapartida, essas técnicas são demoradas, 
pode levar de horas a dias para que o imunocomplexo seja visualizado.
As técnicas em meios gelificados são as imunodifusões, em que substâncias solúveis se difundem 
ao acaso em meios gelificados, como, por exemplo, a agarose ou o ágar. Essas moléculas livres 
se movimentam até encontrarem o seu ligante e formarem o imunocomplexo insolúvel, que vai se 
precipitar no gel, ficando imobilizadas, permitindo a visualização como uma turvação. Assim como na 
imunoprecipitação líquida, as imunodifusões possuem vários interferentes, os já citados anteriormente 
e, principalmente, a pureza dos reagentes e a distribuição homogênea dos componentes no gel.
Existem quatro técnicas de imunodifusão:
• Simples: um componente está fixo no gel, e o outro, solúvel.
• Dupla: os dois elementos são móveis e migram simultaneamente.
• Linear ou unidimensional: uma corrente elétrica direciona a migração.
• Radial: o movimento ocorre em todas as direções.
42
Unidade I
Na imunodifusão simples, descrita por Oudin em 1946, o anticorpo é adicionado na fase gelificada, 
que é sólida, em um tubo, e o antígeno é adicionado no topo da coluna. Em seguida, os tubos deverão 
ser vedados e mantidos à temperatura constante. Depois de aproximadamente 7 dias, será possível 
observar se ocorreu a formação do imunocomplexo pela visualização de turvação.
Nesses ensaios, a concentração de antígeno será proporcional à espessura da linha de turvação 
formada, assim como a distância percorrida pelo antígeno até a formação do imunocomplexo 
(figura seguinte).
Antígeno
Imunocomplexo
Anticorpo + gel
Figura 21 – Imunodifusão simples. O antígeno solúvel vai migrar pelo gel com anticorpo. 
De acordo com a concentração de antígeno, a região de turvação será maior ou menor, 
assim como a região de formação vai ser diferente
A imunodifusão simples pode ser do tipo radial, descrita em 1965 por Carbonara e Heremans. Nessa 
técnica, uma quantidade fixa de anticorpo específico é adicionada em meio gelificado. Depois, são 
realizados orifícios sobre a superfície desse gel, onde são adicionados os antígenos a serem testados, 
além de uma amostra-controle com o antígeno de interesse em concentração conhecida. O antígeno 
vai se difundir no gel até encontrar com o anticorpo, formando o imunocomplexo, porém, se uma 
grande quantidade de antígeno chegar à região, ocorrerá a zona de excesso de antígeno. Com isso, os 
imunocomplexos se desfazem, migram mais, encontram novos anticorpos e precipitam novamente. 
Somente quando o antígeno estiver na zona de equivalência, haverá a precipitação dos imunocomplexos 
e turvação do gel.
Ao redor do orifício, no local em que há precipitação, vai se formar um halo, que quanto mais 
distante do centro, maior será a concentração de antígeno. É uma técnica utilizada para quantificação 
de proteínas de fases agudas e de imunoglobulinas. A sensibilidade dessa técnica é de aproximadamente 
10 μg/dl. Além disso, a técnica exige uma rigorosa padronização das condições e dos reagentes usados. 
Pode ser usada para quantificação, desde que seja realizada uma curva-padrão com o antígeno-controle, 
com a implementação de técnicas de automação de nefelometria e turbidimetria. O método, que 
demorava até 72 horas, pode ser realizado em alguns minutos.
43
IMUNOLOGIA CLÍNICA
 Observação
As técnicas de imunoprecipitações manuais vêm sendo substituídas 
por técnicas mais modernas e até mesmo automatizadas. Entretanto a 
imunodifusão radial pode ser um método de escolha para a determinação 
de proteínas, sendo elas de fase aguda e até mesmo de anticorpos. 
A amostra utilizada será o soro do paciente.
A) B) 
Diâmetro do halo
Tempo de incubação: 45 a 72h
Figura 22 – Imunodifusão simples radial. A) Ilustração da técnica, em que os círculos vermelhos 
são antígenos, os anticorpos estão representados em azul e o halo de cinza. 
B) Imagem de um resultado de imunodifusão radial simples, quanto mais o halo 
se distancia do centro do orifício, maior é a concentração do antígeno na amostra em estudo
A) Adaptada de: Montassier (2015, p. 4); B) Adaptada de: Barone e Fernandes (2020, p. 12).
Ainda nas técnicas de imunodifusão, tem-se a imunodifusão dupla radial, descrita por Ouchterlony 
em 1947. Nessa técnica, tanto o anticorpo como o antígeno migram em todas as direções radialmente a 
partir de orifícios em um meio gelificado. Da mesma forma que ocorre na imunodifusão simples, quando 
o antígeno e o anticorpo se encontram na zona de equivalência, ocorre a formação de imunocomplexos, 
que vão precipitar. Nessa técnica, pode ser feita uma comparação, ou comparações múltiplas, em um 
mesmo gel. É um método semiquantitativo de baixa sensibilidade, necessitando de antígenos em 
concentrações altas, em mg/dl, além de soros policlonais contendo anticorpos de alta avidez.
Na técnica de testagem múltipla, é possível observar a formação de arcos, que permitem avaliar se 
houve a identidade total, parcial ou a ausência de identidade na ligação entre o anticorpo e o antígeno, 
sendo constatado que os antígenos testados são idênticos, diferentes ou semelhantes com o mesmo 
epítopo para a ligação do anticorpo (figura seguinte).
44
Unidade I
A) 
Anticorpo
Matriz ágar Precipitado
Antígeno
 
B) 
C) 
Reação de 
identidade
Reação de 
identidade 
parcial
Reação 
de não 
identidade
Figura 23 – Imunodifusão radial dupla. A) Ilustração representativa da difusão radial 
com dois componentes; a região intermediária é o local da zona de equivalência, onde há a precipitação. 
B) Imagem de uma imunoprecipitação dupla em gel de agararose. C) Representação de 
imunoprecipitação dupla radial com mais de um componente, que permite visualizar se há 
identidade total, parcial ou ausência de identidade da ligação do antígeno ao anticorpo
A) Adaptada de: Barone e Fernandes (2020, p. 9); B) Adaptada de: Togashi et al. (2009, p. 2); 
C) Adaptada de: Lopes e Montassier (2016, p. 38).
É possível, ainda, combinar a técnica de imunodifusão dupla com a eletroforese, que é a aplicação 
de um campo elétrico no sistema de gel, a imunoeletroforese. Essa combinação de técnicas aumentará 
a resolução do resultado, pois os componentes poderão ser separados também pela carga elétrica em 
diferentes regiões do gel, discriminando um número maior de moléculas presentes na amostra, que é 
uma mistura de material antigênico.
45
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Como a carga elétrica vai ser responsável pela separação da amostra, é importante garantir que o 
ensaio aconteça em pH, temperatura e força iônica adequados, além de conhecer o ponto isoelétrico da 
proteína antigênica de interesse, pois todos esses fatores vão influenciar na migração. Após a realização 
da corrida eletroforética, é feita a imunodifusão com soros de anticorpos, que formam turvação no gel, 
na região da precipitação do imunocomplexo.
 Observação
Ponto isoelétrico ou pI de uma proteína é o valor do pH em que a 
proteína tem a carga elétrica líquida igual a zero.
Assim, a imunoeletroforese é um método qualitativo que permite identificar substâncias solúveis 
imunogênicas. Uma aplicação comum dessa técnica é o estudo de gamapatias monoclonais e policlonais, 
porém possui baixa sensibilidade, não conseguindo diagnosticar a doença na fase inicial.
Paraa detecção precoce das gamapatias monoclonais, pode ser utilizado o método da 
imunofixação, que vai permitir a diferenciação das gamapatias biclonais, das doenças de cadeia 
pesada do anticorpo e da monitoração de doenças linfoproliferativas. Para a realização desse método, 
são utilizados soros monoespecíficos contra uma classe de anticorpo que é fixada em cada porção 
de um gel; a visualização é possível com o uso de um corante. Porém, antes da reação de fixação, é 
necessária a realização da corrida eletroforética e da imunoprecipitação dos componentes.
Além disso, o uso de campo elétrico pode ser feito para aumentar a velocidade de migração dos 
antígenos e anticorpos e, consequentemente, da formação de imunocomplexos. É a eletroimunodifusão, 
que pode ser simples, linear, dupla linear ou contraimunoeletroforese, técnica que permite quantificar 
tanto antígenos quanto anticorpos.
3.1.2 Aglutinações
Os ensaios imunológicos de aglutinação partem do princípio de que é possível aglutinar partículas 
com a formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos com 
partículas insolúveis, que contêm determinantes antigênicos em sua superfície.
A aglutinação vai acontecer em dois estágios. No primeiro, uma mistura das partículas insolúveis 
recobertas pelos antígenos vai se ligar com os anticorpos; no segundo estágio, como resultado das colisões 
que ocorrem entre essas partículas, os anticorpos já ligados a uma partícula se ligam a determinantes 
antigênicos de outra, formando agregados que serão visualizados (figura seguinte).
46
Unidade I
Látex sensibilizado 
com anticorpo
Antígeno
B)
A)
Anticorpo
Complexo aglutinado
Figura 24 – As duas etapas da aglutinação. Primeiro, vai ocorrer a ligação do antígeno 
ao anticorpo para a posterior ligação entre as partículas: (A) a aglutinação ocorre 
por antígeno livre; (B) a aglutinação ocorre por anticorpo livre
Fonte: Silveira (2005, p. 2).
Como ilustrado na figura anterior, a característica principal da aglutinação, que se diferencia da 
técnica de precipitação, é a presença de uma partícula insolúvel, que será o “suporte” para a reação. 
Essas partículas, ao se ligarem a um componente livre, que pode ser antígeno ou anticorpo, formarão 
uma rede tridimensional que aglutinará. Essas partículas insolúveis podem ser:
• Partículas que apresentam antígenos naturais em sua superfície, como as hemácias, bactérias, 
protozoários, entre outros.
• Partículas inertes, látex, poliestirenos, cristais de colesterol.
• Células antigenicamente não relacionadas, às quais se adsorvem ou se fixam antígenos insolúveis, 
como, por exemplo, hemácias e bactérias.
47
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Vários fatores podem interferir no ensaio. Por isso, é importante saber o tipo do anticorpo que estará 
presente, pois a IgM se liga muito mais facilmente aos antígenos do que a IgG. Desse modo, quando se 
deseja detectar apenas a IgG, é necessário utilizar reagentes que neutralizam a IgM, como, por exemplo, 
o 2-mercaptoetanol.
Outros fatores podem interferir nas ligações, como, por exemplo:
• eletrólitos;
• pH;
• presença de macromoléculas, que, em pequenas quantidades, impedem autoagregação das partículas;
• presença de enzimas que interferem impedindo as ligações inespecíficas;
• tempo e temperatura devem ser respeitados para permitir a ligação entre os componentes do teste.
As técnicas de aglutinação podem ser divididas em direta, passiva ou indireta, inibição da aglutinação 
e floculação, dependendo das etapas que ocorrem para a formação do aglutinado.
Na aglutinação direta, são utilizadas partículas antigênicas insolúveis em sua forma íntegra 
ou fragmentada. Essas partículas podem ser hemácias, bactérias, fungos ou protozoários. Possuem 
antígenos em sua superfície naturalmente, e por isso podem ser aglutinados diretamente por anticorpo.
Para a aglutinação acontecer, é utilizado um antissoro, que é uma solução de anticorpos específicos. 
Após um período de incubação, a adição do antissoro vai permitir a formação da aglutinação completa. 
Por isso, é uma técnica de detecção de antígenos. Quando o resultado é positivo, ele geralmente é 
expresso com um título que corresponde à diluição usada do antissoro. O resultado será a máxima 
diluição em que ocorrer a aglutinação.
A aglutinação direta é a técnica utilizada para a realização do ensaio de tipagem sanguínea. Esse 
teste é utilizado para determinar o tipo sanguíneo do paciente, com a determinação dos antígenos 
eritrocitários do sistema ABO, que determina se o indivíduo é do tipo sanguíneo A, B, AB ou O. 
É utilizado também para a determinação da presença dos antígenos do sistema Rh, que pode ser 
positivo ou negativo.
Nessa técnica, deverá ser coletada uma amostra de sangue total, com o uso do anticoagulante EDTA, 
para obtenção das hemácias íntegras do indivíduo do qual se deseja saber o tipo sanguíneo, sendo que 
a partícula insolúvel, que servirá de suporte da aglutinação, será a hemácia do paciente, que possui 
naturalmente na sua superfície a presença de antígenos que podem ser do tipo A, B ou os dois juntos, 
AB. Já o indivíduo O será aquele que não possui antígenos A nem B na superfície da sua hemácia. Além 
disso, o fator Rh será determinado pela presença ou ausência do antígeno D na superfície da hemácia.
48
Unidade I
Como a amostra já fornece o antígeno em uma partícula insolúvel, será necessário o uso de anticorpos 
contra esses mesmos antígenos. Esses anticorpos estarão presentes em um reagente comercial, o soro 
ou antissoro. Observe a figura seguinte, com as etapas da técnica de aglutinação direta para determinar 
o tipo sanguíneo:
Anticorpo Antígeno (hemácia) Aglutinação
Figura 25 – Reação de aglutinação direta. A técnica de aglutinação direta 
é utilizada para a determinação da tipagem sanguínea em lâmina
Fonte: Garcia ([s.d.], p. 8).
Ao adicionar o soro com anticorpos contra os possíveis antígenos presentes na superfície da hemácia 
do indivíduo, o resultado poderá ser observado pela presença ou ausência de formação de aglutinação. 
Se o paciente possuir o antígeno na superfície da hemácia que será o “suporte” insolúvel da reação, vai 
aglutinar, pois o anticorpo do soro vai se ligar aos antígenos, formando o complexo imune, que será 
visível a olho nu, não sendo necessário nenhum equipamento para a revelação dos resultados.
 Observação
Na tipagem sanguínea, para cada antígeno, haverá um soro específico. 
Por isso, não se podem colocar dois soros simultaneamente na amostra, 
pois seria impossível determinar qual reagiu com a amostra.
Então, por exemplo, se um indivíduo é de tipo sanguíneo B positivo (B+), no teste de tipagem 
sanguínea, a amostra vai gerar uma reação de aglutinação no soro anti-B e anti-D, não podendo 
haver aglutinação na presença do soro anti-A. Já um paciente O positivo (O+) deverá apresentar como 
resultado a ausência da aglutinação na presença de anti-A e também na presença de anti-B, porém vai 
reagir na presença de anti-D.
Os indivíduos que possuem um determinando antígeno vão ter anticorpos no seu soro que são da 
classe IgM - por exemplo, o indivíduo B+ vai ter anticorpos anti-A no seu soro. Por esse motivo, o ideal 
é que o teste de tipagem sanguínea seja feito após a lavagem das hemácias em solução fisiológica, 
retirando os anticorpos presentes no soro do indivíduo, que podem interferir na técnica, resultando em 
erro de interpretação.
49
IMUNOLOGIA CLÍNICA
 Observação
A tipagem sanguínea sempre deverá ser realizada em triagem do 
doador e do receptor em bancos de sangue. O conhecimento do tipo 
sanguíneo de um indivíduo é crucial, pois nos casos de doações de sangue, 
a incompatibilidade do sistema ABO e Rh entre doador e receptor ocasiona 
uma anemia hemolítica e reação transfusional, o que poderá levar o 
paciente ao óbito.
Soro
anti-Rh
Soro
anti-A
Soro
anti-B
Soro
anti-A
anti-B
Tipo sanguíneo 
determinado pela 
aglutinação das 
hemácias
A Rh-
B Rh+
AB Rh-
O Rh-
Figura 26 – Resultados possíveisencontrados na tipagem sanguínea. Na tipagem sanguínea, o sangue de um indivíduo vai aglutinar 
na presença de um soro comercial, contendo anticorpos. Haverá a formação do complexo imune quando o indivíduo possuir o 
antígeno na superfície de sua hemácia que seja igual ao anticorpo presente no soro. Essa reação é vista com a formação de pequenos 
“grumos”. Na ausência do antígeno, não vai ocorrer a reação, ficando homogêneo
Adaptada de: Vieira (2013, p. 11).
Além da aglutinação direta, em que o antígeno em questão está em um suporte natural, há a inibição 
da aglutinação direta. A técnica baseia-se na capacidade que certos antígenos possuem em aglutinar 
espontaneamente com hemácias, com anticorpos presentes na amostra, que vão encobrir a partícula 
inibindo uma posterior aglutinação. Nesses casos, os testes positivos não apresentam aglutinação. 
É uma técnica utilizada para a detecção da presença de anticorpos de alguns vírus, como o da rubéola, 
do sarampo e da influenza.
Quando não há uma partícula insolúvel natural para a detecção de um antígeno ou um anticorpo, 
esses “suportes” para reações imunes são extremamente úteis no diagnóstico de diversas doenças, 
como, por exemplo, a doença de Chagas, toxoplasmose, sífilis, entre outras, e podem ser produzidos 
50
Unidade I
em laboratório. Nesses casos, em que um antígeno ou anticorpo for artificialmente adsorvido numa 
partícula insolúvel, a técnica é nomeada de aglutinação indireta ou passiva (figura seguinte).
Essas partículas podem ser hemácias ou partículas inertes, como látex, um polímero de poliestireno, 
sefarose, entre outras. Podem ser sensibilizadas por técnicas como:
• Adsorção passiva, devida ao contato direto com antígenos solúveis.
• Adsorção via agentes químicos, sendo muito comum o uso de ácido tânico.
• Conjugação do antígeno por meio de ligações covalentes.
Partícula carregadora Antígeno
Anticorpo
Aglutinação
Partícula sensibilizada
Partícula sensibilizada
Figura 27 – Aglutinação indireta ou passiva. Um antígeno é ligado em uma partícula 
insolúvel carregadora, artificialmente, passando a ser o “suporte” da reação de aglutinação, 
que consiste na ligação do anticorpo específico nessa partícula; posteriormente, 
vão se ligar entre si, formando a aglutinação
Adaptada de: Castro Júnior (2021, p. 7).
Em 1951, Boyden verificou que proteínas podem ser adsorvidas em hemácias quando tratadas 
com ácido tânico. Essas células poderiam aglutinar-se com anticorpos específicos, o que permitiria 
a detecção de presença de anticorpos em uma amostra, contra antígenos. Para a realização dessa 
técnica, que utiliza a hemácia como a partícula insolúvel, a aglutinação indireta é nomeada de 
hemaglutinação passiva.
51
IMUNOLOGIA CLÍNICA
 Lembrete
A possibilidade de preparar em laboratório hemácias adsorvidas a 
antígenos permite que essas células sejam utilizadas para a detecção 
de anticorpos presentes no soro de indivíduos. Nos laboratórios de 
análises clínicas, a hemaglutinação passiva pode ser usada para 
determinar a presença de anticorpos contra toxoplasmose, Chagas, sífilis, 
entre outras doenças.
É uma técnica de simples execução, que não exige a utilização de nenhum equipamento especial. 
Como esse método é comumente utilizado para a detecção de anticorpos de algumas doenças, como 
Chagas, toxoplasmose, entre outras, a amostra de escolha é o soro. Apesar das facilidades, é necessária 
sempre a realização, juntamente com o teste, de um controle positivo e um negativo, garantindo a 
confiabilidade do resultado obtido.
O uso de diluição seriada da amostra de soro testada permite a realização de uma semiquantificação 
da presença do analito investigado, ou seja, terá como resultado um título de reação, que representa a 
diluição máxima em que há anticorpos presentes na amostra. Quanto maior a diluição em que ocorrer 
a reação positiva, maior é a concentração de anticorpos na amostra.
Para que seja possível visualizar a reação de aglutinação, é preciso realizar o ensaio em uma placa 
própria, que possui o fundo em V. Lembrando que, quando a reação de aglutinação ocorre, há a formação 
de uma rede tridimensional. O resultado positivo será visualizado como um “tapete”; já o resultado 
negativo será observado com a presença da formação de um “botão”. Esse botão nada mais é do que 
as hemácias livres que não se ligaram a anticorpos, sedimentadas no fundo do poço (figura seguinte).
Figura 28 – Resultados da hemaglutinação. As imagens do lado esquerdo representam o resultado positivo: há a formação de um 
tapete, no fundo do poço em V, devido à ligação de anticorpos nas hemácias, formando um complexo, uma rede tridimensional. Do 
lado direito, está o resultado negativo: na ausência de ligação de anticorpos aos antígenos, as hemácias livres sedimentam-se
Adaptada de: Montassier ([s.d.]b, p. 15).
52
Unidade I
Por ser um teste semiquantitativo, esse método sempre é realizado com o soro diluído em diferentes 
títulos. A positivação em diferentes diluições permite dizer se há poucos ou muitos anticorpos na amostra 
testada. Além disso, a diluição da amostra elimina a ocorrência do efeito prozona, que é quando o resultado 
é falsamente negativo (FN) devido à reação estar acontecendo na zona de excesso de anticorpos. Nesses 
casos, a amostra possui muitos anticorpos, mas como todas as regiões Fab ficam ligadas por antígenos e 
vários anticorpos ficarão livres, não é possível haver a ligação entre as hemácias; consequentemente, a 
amostra que é positiva não vai formar complexo imune. A diluição do soro consegue resolver esse falso 
negativo, pois vai fazer com que a reação aconteça na zona de equivalência, em um título maior, sendo 
possível visualizar o resultado positivo (figura seguinte).
1/
2
1/
8
1/
32
1/
12
8
1/
51
2
Po
sit
iv
o
1/
4
1/
16
1/
64
1/
25
6
1/
10
24
N
eg
at
iv
o
64
Título
1
Paciente
5123
325
327
82
<24
1286
48
Figura 29 – Título de positividade da hemaglutinação. Todas as amostras estão positivas, 
porém a amostra que possui maior concentração de anticorpos é a 3, que foi positiva até o 
título de diluição 1/512; já a que possui menor concentração de anticorpos é a 8, positiva 
apenas até a diluição 1/8. A amostra 6 é a representação do efeito prozona: 
as primeiras duas diluições são falsamente negativas por haver excesso de anticorpo; 
quando a amostra é diluída, a reação acontece na zona de equivalência e se torna positiva
Fonte: Mayer ([s.d.], p. 5).
A hemaglutinação indireta é usada para a detecção de anticorpos contra vários parasitas, entre eles, 
anticorpos de Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii e Treponema pallidum. As hemácias utilizadas 
como suporte da reação antígeno-anticorpo são de baixo custo e fáceis de serem obtidas e mantidas, 
permitem a ligação de vários antígenos e podem ser suspensas em soluções estabilizadoras que evitam 
reações inespecíficas.
Utilizam-se preferencialmente hemácias de aves e antígenos de polissacarídeos, que se ligam 
prontamente a essas hemácias; já os proteicos precisam de tratamento com ácido tânico ou cloreto 
de cromo. Quanto mais puros, maior a sensibilidade e especificidade do sistema, mas, mesmo com 
antígenos purificados, é necessário tratar a amostra, soro do paciente, com soluções que extingam 
53
IMUNOLOGIA CLÍNICA
as IgM. Comumente, é usado o mercaptoetanol para quantificar apenas as IgG. Caso não haja 
o tratamento da amostra, será quantificado qualquer anticorpo contra o antígeno em questão, 
independentemente da classe.
Outra aplicação de hemácias como suporte para a aglutinação é usá-las para a detecção de pequenas 
quantidades de antígenos solúveis, haptenos ou anticorpos que competem com a substância na qual a 
hemácia foi sensibilizada. É um teste de competição pelo anticorpo, no qual a reação de aglutinação será 
inibida na presença do analito na amostra, inibição da hemaglutinação passiva. Uma aplicação dessa 
técnica é para detectar a presença de antígenos da hepatite (figura seguinte).Antes do teste
Teste
Amostra do paciente
Figura 30 – Inibição da hemaglutinação. A presença de antígenos na amostra vai competir com 
as hemácias pelos anticorpos no teste; com isso, a reação positiva será a ausência de aglutinação
Fonte: Mayer ([s.d.], p. 6).
Lembrando que as imunoglobulinas de uma espécie são imunogênicas quando inoculadas em outra 
espécie, ou seja, haverá produção de anticorpos anti-imunoglobulinas, que vão reagir com a região Fc de 
um anticorpo e ainda poderão se ligar ao seu antígeno específico na região Fab. A anti-imunoglobulina 
produzida em laboratório pode ser utilizada de diversas formas nos métodos diagnósticos, como, por 
exemplo, nas técnicas de aglutinação.
Esse conhecimento possibilitou o desenvolvimento do teste de Coombs. Nele, é utilizado um soro 
como reagente, o soro de Coombs, que é uma solução de anticorpos contra a imunoglobulina IgG. Esse 
soro é utilizado em dois tipos de teste de Coombs: o teste de Coombs direto, que é feito para detectar 
hemácias em uma amostra de sangue total que estão sensibilizadas por anticorpos, o que acontece, por 
exemplo, em anemias hemolíticas, reações transfusionais e na eritroblastose fetal; e o teste de Coombs 
indireto, que vai determinar a presença desses anticorpos no soro de uma amostra.
No teste de Coombs direto, a amostra é o sangue total. Coletada em um tubo de tampa roxa, 
contendo o anticoagulante EDTA, deverá ser centrifugada, “lavada” em solução fisiológica e suspendida 
54
Unidade I
a 5% para a adição do soro de Coombs. Caso as hemácias estejam ligadas a anticorpos, sensibilizadas, os 
anticorpos do soro de Coombs se ligarão, formando a aglutinação (figura seguinte).
Antígenos na 
membrana da 
célula
Antieritrócitos
Aglutinação
(anti-Ig + complexo 
antígeno-anticorpo)
Soro de Coombs 
é adicionado 
(anti-Ig humana)
Amostra de sangue 
de um paciente com 
anemia hemolítica 
autoimune: eritrócitos 
sensibilizados
Legenda
Anti-Ig humana 
(soro de Coombs)
Figura 31 – Teste de Coombs direto. A amostra é o sangue total. O soro de Coombs, que 
será adicionado, possui anticorpos contra-Ig humana, que vão formar a aglutinação, 
resultado positivo, quando as hemácias estiverem sensibilizadas
Fonte: Vizzon e Silva (2015, p. 7).
Já no teste de Coombs indireto, a amostra é o soro, coletada em um tubo seco. Posteriormente 
à coagulação, o soro é separado das células. Por isso, é necessário que seja adicionado o “suporte” 
da reação de aglutinação, que serão hemácias de um doador do tipo sanguíneo O+. O soro deverá 
ser misturado com as hemácias; caso existam anticorpos contra essas células, haverá a ligação. Após 
essa etapa, o soro de Coombs é adicionado e a reação de aglutinação vai ocorrer, igual acontece no 
teste de Coombs direto. A presença desses anticorpos contra antígenos eritrocitários em um indivíduo 
sempre ocorre se, por algum motivo, em algum momento, ele teve contato com hemácias, sangue, que 
possuíam antígenos diferentes dos seus próprios.
Um exemplo em que o teste de Coombs indireto é usado ocorre em mulheres Rh negativo, ou seja, 
que não possuem antígeno D na superfície de suas hemácias. Caso essas mulheres engravidem de um 
feto Rh positivo, que vai possuir o antígeno na superfície de sua hemácia, ao entrar em contato com o 
sangue do feto, o que é mais comum de acontecer no momento do parto, elas vão produzir anticorpos 
contra hemácias.
Caso essa mesma mulher engravide novamente de outro feto Rh positivo, esses anticorpos gerados, 
que serão da classe IgG, vão passar pela barreira placentária, causando anemia hemolítica no feto 
durante a formação fetal, o que vai resultar em um aborto. Essa patologia é a doença hemolítica do 
recém-nascido ou a eritroblastose fetal.
Hoje em dia, com os exames de pré-natal sendo obrigatórios para todas as gestantes, a ocorrência 
da eritroblastose fetal é incomum, pois todas as gestantes que forem Rh negativo vão tomar a profilaxia 
55
IMUNOLOGIA CLÍNICA
RhoGAM, um soro com anticorpos contra anticorpos, que vai imunizar passivamente a gestante, para 
que, caso ela entre em contato com hemácias Rh positivo do feto, estas sejam neutralizadas antes de a 
mulher ativar sua resposta imune e produzir os próprios anticorpos, impedindo a geração de memória e 
evitando, assim, a eritroblastose fetal.
Teste positivo
Figura 32 – Teste de Coombs indireto. A amostra é o soro. Quando houver anticorpos antieritrócitos, 
estes se ligarão em hemácias de um doador, sensibilizando-as. Depois, será adicionado o soro de Coombs, 
que vai se ligar no Fc dos anticorpos, gerando a aglutinação
Fonte: Seltenreich ([s.d.], p. 17).
Para finalizar as técnicas de aglutinação, serão descritas as metodologias que utilizam partículas 
inertes: a gelatina, o látex e o cristal de colesterol.
Também são técnicas de aglutinação indireta, pois a partícula insolúvel foi artificialmente ligada a 
um anticorpo ou a um antígeno. Essas partículas são uma alternativa à utilização das hemácias. Elas 
são fixadas com o uso de formaldeído e, por não terem antigenicidade, não há problema de reação 
inespecífica, com a presença de anticorpos heterófilos, o que proporciona uma maior especificidade e 
sensibilidade. A gelatina é usada popularmente para testes de triagem de HIV e hepatites B e C.
O látex é uma esfera de poliestireno. O teste que utiliza essa partícula é realizado quando o reagente 
é misturado com a amostra de soro em uma placa de fundo escuro. É utilizado para a detecção de 
antígenos, como, por exemplo, a proteína C reativa, além de diversas bactérias, ou pode ser utilizado 
para a detecção de anticorpo, como o fator reumatoide.
Por último, temos a floculação, que também é uma aglutinação indireta, na qual a visualização dos 
imunocomplexos no meio líquido será possível com o auxílio de uma lupa ou microscópio ótico.
O VDRL (Venereal Diseases Research Laboratories) é um exemplo de floculação. A partícula insolúvel 
é o cristal de colesterol, uma suspensão antigênica alcóolica de cardiolipina e lecitina que será usada 
na pesquisa de anticorpos anticardiolipinas, as reaginas. O VDRL é o teste utilizado para o diagnóstico 
da sífilis, causada pelas bactérias Treponema pallidum. Assim como as demais técnicas de aglutinação, 
no uso de partícula inerte, os anticorpos da amostra vão formar o complexo imune com a partícula 
56
Unidade I
insolúvel, e consequentemente o aglutinado. Para essa metodologia, também é crucial que as amostras 
sejam testadas em diferentes diluições (figura seguinte).
Anticorpos não treponêmicos
Cardiolipina
Lecitina
Colesterol
Figura 33 – Floculação. A imagem é a representação esquemática da reação de floculação do teste VDRL, em que anticorpos não 
treponêmicos se ligam às cardiolipinas presentes na superfície do cristal de colesterol, aglutinando. O resultado será positivo (+) 
quando forem visualizados grumos; e negativo (-) na ausência deles
Fonte: A) Oliveira Júnior et al. (2017, p. 4); B) Silva et al. (2014, p. 3).
3.1.3 Ensaios líticos
O último método não marcado apresentado são os ensaios líticos. São imunoensaios que permitem 
detectar a presença ou não de um analito a partir da ocorrência de hemólise. Para que ocorra a ruptura 
das hemácias, poderão ser utilizadas proteínas do complemento ou toxinas bacterianas.
Os ensaios líticos com sistema do complemento são realizados com base no fato de que a 
ativação do sistema do complemento ocorre com a presença de anticorpos, o que será reproduzido 
in vitro, utilizando o mecanismo de ativação do sistema do complemento (RFC – reação de fixação do 
complemento). Como todas as três vias do sistema do complemento, após a ativação, geram a ruptura 
celular devido à formação do complexo de ataque à membrana, a presença ou ausência dessa 
ruptura celular é que será visualizada nesses testes.
Uma das aplicações dessa técnica é justamente dosar o sistema do complemento, o ensaio CH50, 
que mede a capacidade funcional de ativação pela via clássica do sistema do complemento,pela ruptura 
de hemácias de carneiro revestidas com anticorpos de coelho e anti-hemácia, das classes IgG e IgM, 
nomeados de hemolisina.
Ao final da reação, é observada a hemólise, que será quantificada, nome CH50, porque o método 
vai medir a hemólise a 50%, em comparação com a hemólise total em água. A coleta e a retração da 
amostra deverão ser feitas com temperatura controlada, baixas, pois os componentes do sistema do 
complemento, principalmente o C2, são termolábeis. A amostra deverá ser diluída em vários títulos e a 
57
IMUNOLOGIA CLÍNICA
hemólise quantificada por espectrofotometria para o posterior cálculo da determinação da concentração 
do complemento (figura seguinte).
O teste do CH50 é utilizado na investigação de imunodeficiência funcional do sistema do 
complemento, porém, para quantificar cada um dos componentes separadamente, são utilizadas 
técnicas de automação de imunoprecipitação, turbidimetria ou nefelometria.
C C
C
C
C
C
CC
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
Figura 34 – CH50, dosagem do complemento. As hemácias de carneiro revestidas com anticorpos são as hemolisinas. Ao adicionar o 
soro, a amostra e o complemento se ligam ao anticorpo, que é ativado, causando a hemólise, a qual será quantificada: quanto mais 
hemólise, mais complemento está presente na amostra
Fonte: Singh (2015, p. 40).
Já a reação de fixação do complemento é empregada para detectar a presença das proteínas do 
sistema do complemento, ou até mesmo semiquantificar antígeno e anticorpos, através da reação 
de hemólise das hemácias de carneiro revestidas com anticorpos. A técnica é executada em duas 
diferentes etapas:
• Primeira etapa: a amostra é incubada em diluições crescentes com o extrato antigênico na 
concentração conhecida, que apresenta, além do antígeno, soro de cobaia, que é a fonte de 
sistema do complemento.
• Segunda etapa: é adicionado o sistema indicador, ou hemolítico, que são as hemácias revestidas 
com anticorpos.
Primeiro, haverá a interação do antígeno com o anticorpo, o complexo imune, e, depois, com o 
sistema indicador. Se houver anticorpo específico para o extrato antigênico, serão formados os complexos 
imunes; quando posteriormente for adicionado o indicador, não haverá ruptura das hemácias, ou seja, 
a ausência de hemólise é positiva para a presença do anticorpo específico.
Os ensaios líticos com toxinas bacterianas é um teste de inibição de hemólise comumente 
utilizado na pesquisa do ASLO, o anticorpo antiestreptolisina O, que é determinante para o diagnóstico 
de infecções crônicas por Streptococcus pyogenes, ou β-hemolítico do grupo A, pois essas bactérias 
são produtoras de hemolisinas, que vão estimular a produção de anticorpos. Por isso, a detecção do 
58
Unidade I
anticorpo in vitro é feita a partir do conhecimento de que eles vão neutralizar as hemolisinas, inibindo a 
hemólise. Para a realização do método, é necessário incubar a amostra com antígenos de estreptolisina 
em diferentes concentrações. Depois, deverão ser adicionadas as hemácias de carneiro e o sistema 
revelador. Havendo anticorpos, haverá a neutralização dos antígenos e, por isso, não haverá lise.
3.2 Métodos marcados ou conjugados
Apesar da aplicabilidade dos ensaios não marcados que foram apresentados anteriormente, 
muitas vezes, a eficácia e a confiabilidade do ensaio não podem ser asseguradas, pois nem sempre 
é possível realizar a visualização sem a ajuda de equipamentos, da formação do complexo imune 
in vitro. Porém, devido aos avanços tecnológicos, desde 1950, é possível detectar com maior 
sensibilidade e especificidade a formação dos complexos imunes com o uso da conjugação de 
moléculas aos componentes dos testes, o que tornou a detecção das reações imunológicas mais 
fáceis de serem mensuradas.
A conjugação é a ligação de um componente, de forma covalente, a uma molécula do teste, que 
será uma proteína, que pode ser tanto um antígeno como um anticorpo. A ligação do conjugado deve 
ser realizada de forma que mantenha a funcionalidade das moléculas. As moléculas que podem ser 
utilizadas como conjugados são:
• fluorocromos;
• radioisótopos;
• substâncias luminescentes;
• enzimas com diferentes substratos, podendo ser fluorescentes, cromogênicos ou luminescentes.
A ligação do conjugado pode ser realizada tanto em antígenos purificados como naqueles 
produzidos por recombinação genética. Já os anticorpos que serão conjugados podem ser monoclonais 
ou policlonais, independentemente de qual é a molécula que será conjugada. Quanto maior o seu 
grau de pureza, maior será a eficiência do teste em questão. Além de propiciar uma maior eficácia 
e confiabilidade aos testes, as marcações permitiram o desenvolvimento de diversos sistemas 
de automação.
3.2.1 Fluorescências
Os ensaios que empregam o uso de fluorocromos permitem a ligação do conjugado em antígenos 
ou em anticorpos. Essas moléculas vão emitir fluorescência quando estimuladas em um determinado 
comprimento de onda, pois a molécula fluorescente absorve uma grande quantidade de energia, 
elevando o nível de energia nos seus elétrons, que, quando retornam ao nível basal, emitem luz, a 
fluorescência, em um comprimento de onda maior. A emissão dessa luz poderá ser observada em um 
microscópio de fluorescência (figura seguinte).
59
IMUNOLOGIA CLÍNICA
NÁtomo
Luz
Fluorescência
Emissão de energia 
(comprimento de onda maior)
Excitação do elétron 
(comprimento de onda menor)
Figura 35 – Emissão de fluorescência. A molécula absorve energia, que deixa os elétrons excitados. 
Quando estes voltam a seus níveis basais, emitem energia em um comprimento 
maior do que a luz absorvida, que é a fluorescência
Disponível em: https://bit.ly/3j2Fuis. Acesso em: 8 jun. 2021.
Por usarem fluorescência ligada a antígenos ou anticorpos, os ensaios são nomeados de 
imunofluorescência. Podem ser do método competitivo ou não competitivo, homogêneos ou 
heterogêneos ou, ainda, realizados em fase líquida ou sólida.
As técnicas de fluorescência ainda são utilizadas em laboratório de diagnóstico, contudo vem sendo 
substituídas pelas técnicas imunoenzimáticas, pois, para a visualização da fluorescência, é necessário 
o uso de microscópios próprios. Porém, em laboratórios de pesquisa, a imunofluorescência ainda é 
amplamente utilizada, já que permite uma grande variabilidade de aplicações para um mesmo método.
A detecção de um antígeno diretamente em uma célula ou em um tecido é realizada pelo método 
da imunofluorescência direta. A única limitação do teste é a necessidade de utilizar um anticorpo 
monoclonal conjugado para cada antígeno que se desejar detectar (figura seguinte). A utilização de 
imunofluorescência direta é feita em:
• imuno-histoquímicas;
• pesquisa de Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionella sp., influenza tipo A e B, 
entre outros patógenos;
• determinação de subgrupos de linfócitos;
• presença de depósitos proteicos específicos na doença autoimune lúpus.
60
Unidade I
Anticorpo conjugado 
com fluoresceína
Célula infectada
Imunofluorescência direta
Antígeno viral
Figura 36 – Imunofluorescência direta. Na técnica, o anticorpo conjugado 
com a fluoresceína se liga diretamente ao antígeno alvo
Fonte: Varella (2021, p. 9).
 Observação
As imuno-histoquímicas são utilizadas para detectar a presença de um 
marcador tumoral em um tecido, para confirmação de um câncer ou até 
mesmo para determinar a capacidade metastática de um tumor.
 Saiba mais
Saiba mais sobre a importância dos marcadores tumorais no artigo:
ALMEIDA, J. R. C. et al. Marcadores tumorais: revisão de literatura. 
Revista Brasileira de Cancerologia, Brasília, v. 53, n. 3, p. 305-316, 2007. 
Disponível em: https://bit.ly/2UmXz0e. Acesso em: 9 jun. 2021.
Já na técnica para detecção de anticorpos, na imunofluorescência indireta (IFI), serão utilizados 
anticorpos anti-imunoglobulina conjugados, nomeados de anticorpos secundários. É necessário que 
uma lâmina com os antígenos fixados previamente seja incubada com a amostrabiológica, que é 
o soro, contendo uma mistura de anticorpos, porém apenas o anticorpo específico vai se ligar aos 
antígenos da lâmina.
Após a incubação, será adicionado o anticorpo secundário conjugado, que se ligará na porção Fc do 
anticorpo específico que se ligou no antígeno presente na lâmina. O conjugado estará ligado na porção Fc 
da anti-imunoglobulina, permitindo a ligação pela porção Fab. Para garantir que não haverá ligações 
inespecíficas entre anticorpos da amostra e o antígeno da lâmina, entre cada etapa do procedimento, é 
necessário realizar lavagens com soluções próprias (figura seguinte).
61
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 Etapa 4
Conjugado
Anticorpo
Antígeno
A) B) 
Figura 37 – Imunofluorescência indireta. A detecção do anticorpo específico é possível porque, quando ele está presente na amostra, 
vai se ligar ao antígeno previamente fixado em uma lâmina. Para que a ligação antígeno-anticorpo seja visualizada, adiciona-se um 
anticorpo anti-imunoglobulina conjugado com um fluoróforo. Depois, a imagem será visualizada no microscópio de fluorescência. 
Em (A), a amostra não possui anticorpos específicos contra o antígeno da lâmina, é negativa. Em (B), a amostra possui anticorpos 
específicos contra os antígenos da lâmina, é positiva
Fonte: Montassier ([s.d.]d, p. 6); Schwanke et al. (2014, p. 257).
Outra forma de usar conjugados de fluorescência são os ensaios homogêneos, os fluoroimunoensaios. 
São testes de uma única etapa em que os reagentes são homogeneizados em tubos ou cubetas sem a 
necessidade de etapas de lavagem. A técnica de fluorescência polarizada (FPIA) é útil para a detecção 
de haptenos, como, por exemplo, drogas terapêuticas, que, ao se ligarem, alteram a orientação molecular e, 
com isso, a emissão do fluorocromo. O método de ligação competitiva, no qual a amostra vai competir com 
um hapteno comercial marcado pelos sítios de ligação do anticorpo (a ligação do hapteno marcado), 
gera uma molécula maior do que se ligar apenas o hapteno, tornando a movimentação da molécula 
mais lenta. Consequentemente, a emissão da luz estará mais polarizada, ou seja, a detecção de 
polarização é inversamente proporcional à concentração de haptenos.
Já o SLFIA (Substrate-Labelled Fluorescent Immunoassay) é um fluoroimunoensaio que utiliza 
três reagentes:
• anticorpos específicos para o antígeno-alvo do ensaio;
• enzima galactosidase;
• antígeno ligado ao substrato.
62
Unidade I
Os anticorpos vão se ligar ao antígeno da amostra, ou aos antígenos ligados aos substratos, ou aos 
antígenos da amostra; esses antígenos são haptenos. Se houver haptenos na amostra, eles se ligarão 
ao anticorpo e o conjugado ficará livre para sofrer ação da enzima, formando produto fluorescente. 
Entretanto, quando não houver haptenos na amostra, o antígeno ligado ao substrato vai se ligar ao 
antígeno, e o substrato ficará inacessível para a enzima, não havendo a formação de produto.
3.2.2 Radioimunoensaios
É a primeira técnica imunológica capaz de detectar na amostra analitos com concentrações 
em pictogramas. Pode ser utilizada para quantificar hormônios, proteínas, drogas, anticorpos e 
vitaminas. A insulina foi o primeiro hormônio a ser quantificado por essa técnica, em 1960, por 
Berson e Yalow. Outra técnica com a mesma sensibilidade só foi desenvolvida em 1990 com o 
surgimento da quimioluminescência.
Os ensaios utilizam como conjugados isótopos radioativos (I125, I131, H3, C14, P32), que emitem raios 
gama, que serão contados pela emissão de raios por minuto. Um radioisótopo ou isótopo radioativo 
tem como característica apresentar um núcleo atômico instável, que emite energia ao se transformar 
num isótopo mais estável. Essa energia libertada na transformação pode ser chamada de partícula 
alfa, partícula beta ou de radiação gama. Pode ser detectada por um contador Geiger, contendo 
uma película fotográfica, ou por uma câmara de ionização. Será mensurada por minuto, o que é 
representado pela unidade CPM.
Os radioimunoensaios possuem dois formatos:
• Competitivos com anticorpo ou antígeno marcado, nomeados de radioimunoensaios (RIA);
• Não competitivos (sanduíche), nomeados de imunorradiométricos (IRMA).
Os métodos competitivos (RIA) são utilizados para a detecção tanto de antígenos como de 
anticorpos numa amostra. Para isso, é necessário que nos reagentes haja a mesma molécula conjugada 
com o isótopo. Ambos vão competir entre si para que ocorra a ligação, por exemplo, se os antígenos 
que competem pelo anticorpo são adsorvidos na fase sólida. A fase sólida pode ser de celulose, agarose, 
parede de tubo plástico. Após a competição entre as moléculas da amostra e as moléculas marcadas, a 
que estiver em maior quantidade vai se ligar em maior quantidade, até que seja atingido o equilíbrio. 
Posteriormente, deverá ser feita uma etapa de lavagem para retirar as moléculas que não se ligaram, 
garantindo que a CPM reflita apenas as moléculas ligadas.
Entretanto, quando não é utilizada uma fase sólida, será necessário separar as frações livres. Essa 
separação pode ser feita quimicamente, utilizando sulfato de amônia, etanol, polietilenoglicol, ou com 
o uso de adsorventes, como o talco, a sílica, as resinas, a celulose, sendo uma etapa crítica. Após a 
separação, é feita a leitura dos raios gama em CPM.
No método competitivo, a concentração do analito será inversamente proporcional à quantidade 
de CPM, pois sempre que houver muito isótopo ligado, vai significar que há baixa concentração da 
molécula na amostra analisada. Assim, ela “perdeu” a competição.
63
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Já no ensaio de sanduíche, o IRMA, após a ligação do analito de interesse da amostra, que mais 
comumente é um antígeno, no anticorpo de captura, um segundo anticorpo conjugado com o isótopo 
vai se ligar, formando o complexo de sanduíche. Após uma etapa da lavagem, será possível quantificar 
a formação do complexo imune “sanduíche” pelo detector de radiação.
No IRMA, como a presença do antígeno é necessária para capturar o anticorpo conjugado com o 
isótopo, o resultado de contagem por minuto de radiação é diretamente proporcional à concentração 
do analito. Os anticorpos de captura e marcados não precisam necessariamente ser iguais; podem 
se ligar na mesma molécula em epítopos diferentes. Esse método é mais sensível em comparação ao 
de competição.
 Observação
Os métodos IRMA foram muito utilizados para a detecção de antígenos 
que estão presentes em baixas concentrações em amostras. Um exemplo de 
uso em laboratórios de análises clínicas é para a quantificação de hormônio, 
como, por exemplo, a prolactina.
Além das aplicações do RIA para a quantificação de antígenos, o RIA é utilizado na quantificação 
de anticorpos da classe IgE pelos testes PRIST (Paper Radioimmunosorbent Test) e RAST 
(Radioallergosorbent Test), permitindo tanto a quantificação total de IgE quanto, até mesmo, de uma IgE 
específica, propiciando aos laboratórios um método simples para o estudo das alergias. Mas todas essas 
metodologias, apesar da alta sensibilidade, possuem um alto risco operacional e uma difícil execução 
devido à meia-vida dos reagentes radioativos, o que faz com que se torne necessário o uso de medidas 
de biossegurança de alto custo. Por essa razão, a metodologia foi trocada por técnicas mais seguras, 
como eletroquimioluminescência e quimioluminescência.
3.2.3 Ensaios imunoenzimáticos
Os ensaios imunoenzimáticos permitem a quantificação direta da interação antígeno-anticorpo 
através da atividade de uma enzima sobre um substrato com a formação de um produto. Além 
disso, permitem uma grande variedade de sistemas para detecção. A enzima que será utilizada como 
conjugado deverá ser de fácil obtenção por métodos de purificação, ter elevada atividade específica, ser 
facilmente conjugada aos componentes do teste, sem sofrer interferência no sítio catalítico, apresentar 
alta estabilidade e ter custo acessível.
Nos ensaios enzimáticos ditos homogêneos, não é necessária a separaçãoentre os reagentes 
marcados e livres, ou seja, não há necessidade da realização de etapas de lavagens. A atividade 
enzimática é alterada como resultado da interação imunológica. É uma metodologia rápida, adaptável 
e de fácil execução, com diferentes graus de automação, que possibilita a detecção de haptenos e 
drogas. No EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique), as enzimas de escolha são lisozimas, 
glicose-6-fosfato desidrogenase, beta-galactosidase, malato desidrogenase e ribonuclease A.
64
Unidade I
No EMIT, é utilizado o anti-hapteno e o hapteno ligado à enzima, que é o conjugado. Quando o 
anticorpo se liga ao conjugado, ocorre a inativação enzimática por impedimento esférico. Com isso, 
não há clivagem do substrato, porém o conjugado livre mantém a atividade enzimática. Quanto mais 
produto for formado, maior será a concentração de hapteno presente na amostra analisada, pois os 
conjugados ficaram livres; já com ausência ou baixa concentração de analito na amostra, os conjugados 
vão se ligar no anticorpo, não havendo clivagem do substrato (figura seguinte).
Presença da droga livre
Ausência da droga livre
Substrato
Produto
Hapteno
Anticorpo
Droga livre
G6DPH
Anticorpo
Substrato
Hapteno
G6DPH
Figura 38 – Representação do EMIT. Na presença do hapteno na amostra de estudo, o anticorpo vai se ligar a ele, deixando o sítio 
ativo da enzima livre, havendo a clivagem no substrato. Entretanto, na ausência do hapteno na amostra, o anticorpo liga-se no 
conjugado hapteno-enzima e impede a clivagem do substrato por impedimento estérico
Adaptada de: Analytical Toxicology ([s.d.], p. 19).
Como o EMIT é um método utilizado para a detecção de haptenos, seu uso é comum em detecção 
da presença de drogas, fármacos, em amostras biológicas, ou seja, ele detecta a presença de antígenos.
Já nos ensaios heterogênicos, a atividade da enzima não sofre alteração com a ligação antígeno-anticorpo. 
Por esse motivo, será necessária a separação dos conjugados ligados daqueles não ligados com etapas 
de lavagem, que vão retirar os componentes não ligados na fase sólida.
É uma metodologia amplamente empregada para detecção de moléculas maiores. Como os 
anticorpos, as enzimas mais utilizadas são a peroxidase e a fosfatase alcalina, e o substrato deve ser 
65
IMUNOLOGIA CLÍNICA
específico para a detecção da atividade da enzima empregada. É utilizado, além do substrato propriamente 
dito, outro, que vai sofrer ação do produto, propiciando a formação da cor. A cor resultante da reação 
enzimática será medida no comprimento de onda adequado e, a partir dessa leitura de absorbância, será 
possível quantificar o analito do teste em questão.
O principal imunoensaio heterogênico é o ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), que foi 
desenvolvido nos anos de 1970 e se popularizou comercialmente no ano de 1985, com o ensaio para 
detecção de anticorpos anti-HIV.
Esses ensaios possuem diversas apresentações, porém têm como base a imobilização de um antígeno 
ou um anticorpo em uma fase sólida e a utilização de um conjugado, que também poderá ser antígeno ou 
anticorpo ligado a uma enzima com atividade catalítica preservada. A formação de um produto 
colorido pode ser observada visualmente ou por meio de espectrometria, pela medida de absorbância. 
A observação visual permite determinar resultados qualitativos ou semiquantitativos se houver titulação 
da amostra; já a leitura da absorbância permite a quantificação do analito.
Foi um método criado como alternativa ao RIA. O ELISA, apesar de não detectar concentrações em 
pictogramas, possui alta sensibilidade e especificidade, é de rápida execução, baixo custo e altamente 
adaptável a diferentes graus de automação. Contudo é sempre necessário observar a padronização, as 
condições de execução da técnica em cada etapa do teste. Deve ser considerada a concentração ideal de 
cada reagente, as concentrações iônica e proteica, e o pH, que podem interferir na eficiência do teste.
São componentes desse método:
• Fase sólida ou suporte: podem ser partículas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno, 
entre diversas outras. Elas são tratadas para poder adsorver proteínas, ou linkers. As fases sólidas 
podem ser plásticas, tratadas com produtos químicos, que vão expor sítios para a ligação de 
proteínas; podem ser tubos, microplacas ou partículas e até mesmo micropartículas. A fase sólida 
vai capturar as moléculas do complexo imune, que não se perderão nas etapas de lavagem.
• Amostra: preferencialmente, o soro ou o plasma. Deve ser preferencialmente límpida, sem 
hemólise e sem lipemia. Pode ser mantida refrigerada por até 7 dias ou congelada.
• Bloqueio: são usadas proteínas bloqueadoras que não tenham relação com o antígeno e 
o anticorpo em estudo no sistema. Elas vão se ligar nos sítios remanescentes e, assim, evitar 
reações cruzadas. Podem ser utilizados leite desnatado, albumina purificada, caseína, gelatina, 
entre outros.
• Diluente da amostra: deve possuir componentes que vão diminuir a capacidade da amostra de 
se ligar no suporte sólido. Podem ser utilizados detergentes não iônicos e proteínas.
• Solução de lavagem: soluções isotônicas, no pH, na faixa neutra, com pequenas concentrações 
de detergente não iônico.
66
Unidade I
• Conjugados: podem ser o antígeno ou o anticorpo ligado covalentemente a uma enzima. Devem 
preservar sua função original.
• Substratos: precisam ser específicos para a enzima acoplada no sistema. O resultado da 
clivagem pode gerar cor. Além dos substratos cromogênicos, já são utilizados também substratos 
fluorogênicos e quimioluminescentes.
• Antígenos: podem ou não estar conjugados à enzima. Sua obtenção pode ser de um extrato 
bruto ou fracionado, purificado e por recombinação.
• Anticorpos: conjugados ou não às enzimas. Podem ser policlonais ou monoclonais, 
purificados ou totais.
• Resultados: independentemente da combinação que o sistema apresenta, sempre será necessário 
o cálculo do limiar de reatividade ou cut off, que vai determinar se o resultado é positivo 
ou negativo.
Nas metodologias competitivas para detecção de antígenos, será utilizada uma concentração 
limitada de antígeno marcado, que deve se ligar com a mesma avidez ao anticorpo que o antígeno 
da amostra. Ao se adicionar a amostra e o antígeno marcado, eles vão competir pelo sítio de ligação 
do anticorpo que estará adsorvido na fase sólida. Caso a amostra possua ausência ou pouco antígeno 
específico para esse anticorpo, os antígenos conjugados vão se ligar. Com isso, a enzima estará presente 
e o substrato cromogênico será clivado, gerando cor, ou seja, a concentração de analito na amostra é 
inversamente proporcional ao produto formado (figura seguinte).
StopS S S
A)
D)
B)
E)
C)
F)
Figura 39 – ELISA de competição. O antígeno da amostra (branco) e o antígeno marcado (vermelho) 
vão competir pelo mesmo sítio de ligação no anticorpo. A enzima conjugada no antígeno 
vai clivar o substrato (S), formando um produto colorido
Fonte: Motta e Duarte (2010, p. 6).
Esse método competitivo veio para substituir o RIA e pode ser amplamente empregado na detecção 
de antígenos, como, por exemplo, hormônios e proteínas.
Entre os métodos não competitivos, os ensaios de captura para antígenos são os métodos ditos 
“sanduíches”, semelhantes ao descrito no RIA, com a diferença de que o conjugado ligado covalentemente 
ao anticorpo será uma enzima, e não um isótopo (figura seguinte).
67
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Substrato
Anticorpo marcado 
com enzima
Antígeno
Anticorpo de captura
Figura 40 – ELISA “sanduíche”, captura de antígeno. Nesse método, o anticorpo está adsorvido na fase sólida. Será 
adicionada a amostra; se possuir o antígeno de interesse, ele se ligará ao anticorpo da fase sólida. Posteriormente, é 
adicionado o anticorpo conjugado com a enzima, que se liga ao mesmo antígeno, podendo ser no mesmo epítopo 
ou em epítopo diferente; na presença de antígeno na amostra, o anticorpo conjugado ligará, e a enzima acopladavai 
clivar a enzima, gerando um produto que será quantificado
Disponível em: https://bit.ly/3wPrsEQ. Acesso em: 23 jun. 2021.
Ainda dentro dos métodos não competitivos, existem vários sistemas que vão quantificar anticorpos. 
Eles são utilizados para a captura de uma classe específica de imunoglobulina: as metodologias de 
captura de imunoglobulina de classe específica, que apresentam uma alta sensibilidade. Poderão 
ser utilizados antígenos na captura dessas imunoglobulinas ou, até mesmo, anticorpo contra 
imunoglobulinas. Comumente essas metodologias são utilizadas para quantificar IgM nas fases iniciais 
das doenças e também IgE no diagnóstico dos processos alérgicos.
 Observação
O método de captura de IgM é utilizado como uma ferramenta 
importante para o diagnóstico diferencial das doenças de sinais e sintomas 
semelhantes, pois é a primeira imunoglobulina a ser produzida após a 
ativação dos linfócitos B. É bastante utilizado no diagnóstico das arboviroses, 
que possuem sintomas semelhantes e são decorrentes de diferentes vírus, 
como os agentes etiológicos da dengue, chikungunya, Zika e febre amarela.
 Lembrete
A IgM é de fase aguda e é a primeira a ser secretada pelos plasmócitos, 
deixando de ser secretada após um período, diferentemente da IgG, que 
será secretada por longos períodos.
68
Unidade I
No método de captura de IgM, há, na fase sólida, um anticorpo anti-IgM adsorvido, que vai capturar 
a IgM sérica. Caso ela esteja presente, após a lavagem para a retirada dos componentes não ligados, será 
adicionado o antígeno específico, uma vez que qualquer IgM poderá se ligar nesse anticorpo.
 Observação
A anti-IgM do método de captura não é específica; qualquer IgM poderá 
se ligar. O uso de antígeno específico é que vai permitir a diferenciação da 
patologia que está sendo investigada.
Após a adição do antígeno que dará a especificidade do método, será necessária a adição de mais 
um, o conjugado com a enzima. Este será específico contra o antígeno em questão. Após essa etapa, 
a reação poderá ser revelada (figura seguinte). Esse modelo de teste pode ser usado também para a 
detecção de IgG e IgE específica, mudando o anticorpo de captura.
ELISA de captura
Anti-IgM
Anticorpo IgM
Antígeno
Anticorpo conjugado
Figura 41 – ELISA de captura de IgM. Na fase sólida, estará adsorvida a anti-imunoglobulina de interesse, que vai 
capturar o anticorpo, se presente na amostra. Para dar a especificidade do método, é adicionado o antígeno. A ligação 
será então revelada com a adição de um anticorpo contra antígeno conjugado a uma enzima
Adaptada de: DRG International (2020, p. 11).
Já os métodos indiretos possuem como vantagem o uso de um anticorpo anti-imunoglobulina 
conjugado, que poderá ser utilizado na pesquisa de anticorpos de diversas patologias, pois a 
anti-imunoglobulina tem especificidade de ligação à porção Fc de qualquer anticorpo. Podem ser 
utilizados para a detecção de anticorpo contra qualquer patógeno (figura seguinte). As etapas da 
reação do método indireto são: a ligação do anticorpo presente na amostra (o soro ou outros líquidos 
biológicos) no antígeno presente na fase sólida; porém, para a revelação dessa ligação, será necessária 
a adição de um anticorpo secundário, que é o anticorpo conjugado com a enzima; após a adição do 
substrato, haverá a transformação em produto com a formação de cor nos resultados positivos.
69
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Ag Ag
Ag
E
E
E
Anticorpo 
primário
Anticorpo 
primário
Anticorpo 
primário
Anticorpo 
secundário
Anticorpo 
secundário
Anticorpo 
de captura
Substrato
Substrato
Substrato
Direto Indireto Sanduíche
Figura 42 – Diferentes métodos de ELISA. Representação dos métodos direto, indireto e sanduíche, 
utilizando uma enzima como conjugado
Disponível em: https://bit.ly/3wUjKJy. Acesso em: 9 jun. 2021.
Inicialmente, nos primeiros métodos de ELISA que foram desenvolvidos, os antígenos adsorvidos na 
fase sólida eram obtidos de um lisado feito com o patógeno, ou seja, geravam uma mistura de antígenos, 
o que permitia que houvesse ligações cruzadas, inespecíficas, pois a amostra do paciente é um soro 
policlonal. Esse é o método indireto conhecido como ELISA de 1ª geração, que surgiu em 1985.
Já em 1987, surgiu o ELISA de 2ª geração, que é uma metodologia indireta, que difere do método de 
primeira geração, pois começaram a ser utilizados peptídeos, antígenos, produzidos por recombinação 
genética, garantindo um único epítopo de ligação no sistema, o que aumentou a sensibilidade e 
especificidade dos testes, diminuindo a ocorrência de ligações cruzadas dos anticorpos dos pacientes.
Já em 1994, surgiu o ELISA de 3ª geração (figura seguinte), que é um ensaio de captura de IgM 
que utiliza antígenos recombinantes. A modificação do formato dos testes para ELISA “sanduíche” ou 
imunométrico tornou o ensaio mais sensível e específico, pois esse método permite a detecção de todas 
as classes de anticorpos IgG, IgM e IgA, diminuindo o período dito como janela imunológica, permitindo 
a detecção precoce de anticorpos em uma amostra biológica. A evolução desses métodos foi importante 
principalmente no diagnóstico do HIV, pois os métodos de 1ª e 2ª geração, com frequência, geravam 
resultados falsos negativos nas fases iniciais da doença.
70
Unidade I
Figura 43 – ELISA de 3ª geração. É um método de captura, que permite detectar tanto IgM como IgG. Utiliza um 
antígeno recombinante na fase sólida e um antígeno conjugado com a enzima. Seu uso é essencial para a diminuição 
de falso negativo, que acontece na janela imunológica do paciente recém-contaminado pelo HIV
Adaptada de: Telelab ([s.d.]a, p. 2).
A evolução tecnológica permitiu ainda o desenvolvimento do ELISA de 4ª geração. Nesses testes, 
na fase sólida, são adicionados anticorpos e antígenos, permitindo uma detecção ainda mais precoce da 
doença, pois é possível obter um resultado positivo em diversas condições:
• Apenas com a presença do patógeno, que se ligará ao anticorpo.
• Após o início da produção de anticorpos, que se ligarão ao antígeno.
Para o melhor entendimento do como esse método funciona, será descrito o método de 4ª geração 
para o HIV. Na fase sólida do ELISA de 4ª geração para diagnóstico de HIV, serão adsorvidos anticorpos 
contra o antígeno do vírus p24, proteínas tanto do HIV-1 e do HIV-2. Por isso, quando a amostra-teste 
é adicionada, se houver antígeno ou anticorpo, o teste poderá detectar a presença da doença. 
O antígeno p24 do vírus é capturado pelo anticorpo da fase sólida. Se já houver anticorpos, IgM ou IgG, 
eles serão ligados ao antígeno na fase sólida. Após a adição de um antígeno e um anticorpo anti-p24 
monoclonal conjugado à enzima, vai ser adicionado o substrato para que a reação seja revelada. Devido 
à possibilidade de detectar moléculas do vírus ou da resposta imune, o ELISA de 4ª geração é o melhor 
método para o diagnóstico do HIV, sendo o de escolha na atualidade (figura seguinte).
71
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Fase sólida 
Poço de uma placa de 96 poços
Incubação
Incubação
Legenda
Lavagem
Lavagem
Reação colorida indica 
a presença do antígeno 
ou do anticorpo
Substrato (S) 
Cromógeno + H2O2
Anticorpo IgG anti-HIV (Ac) 
Presente na amostra do indivíduo
Proteína p24 do HIV 
Presente na amostra do indivíduo
Conjugado (Conj) 
Antígeno + enzima
Anticorpo anti-p24 
Ligado à fase sólida - poço da placa
Antígeno de HIV (Ag) 
Ligado à fase sólida - poço da placa
Anticorpo IgM anti-HIV (Ac) 
Presente na amostra do indivíduo
Conjugado (Conj) 
Anticorpo anti-p24 ligado à enzima
Figura 44 – ELISA de 4ª geração. O método permite detectar tanto antígenos como anticorpos 
contra o HIV. Por isso, vem sendo o método de escolha para evitar a ocorrência de falsos 
negativos no período de janela imunológica da doença
Fonte: Brasil (2018a, p. 41).
 Saiba mais
Para o melhor entendimento das diferentes gerações de ELISA, acesse:
TELELAB. Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HIV. Brasília, 
[s.d.]a. Disponívelem: https://cutt.ly/in4BZtp. Acesso em: 9 jun. 2021.
72
Unidade I
Ainda dentro dos ensaios imunoenzimáticos, existe a técnica na qual a molécula é conjugada com 
um composto fluorescente, o ELFA (Enzyme-Linked Fluorescence Assay). Ele tem a apresentação igual 
ao ELISA, entretanto a revelação da reação não acontece pela formação do produto cromogênico, e sim 
por emissão de fluorescência.
Já quando o conjugado é uma molécula luminescente, o ensaio é nomeado de CLIA 
(Chemiluminescence Immunoassay). Essas moléculas, que serão covalentemente ligadas, podem ser 
o luminol, os ésteres de acridina ou derivados do nitrofenil oxalato, com os quais se obtém energia 
luminosa a partir de uma reação química. A emissão dessa luz é facilitada por uma enzima, a luciferase, 
ou uma fotoproteína.
 Lembrete
As metodologias ELISA, ELFA, CLIA são amplamente utilizadas no 
diagnóstico das mais diversas patologias. Toda vez que um médico solicita 
uma sorologia para uma determinada doença, uma dessas metodologias 
será empregada para determinar a presença ou não da doença.
3.2.4 Imunocromatografias
A imunocromatografia é também conhecida como teste rápido ou teste remoto. Está cada vez mais 
popular por não precisar de reagentes especiais, equipamentos ou um técnico especializado para a sua 
execução. É mais utilizada como teste de triagem, porém, como algumas metodologias já possuem alta 
sensibilidade para algumas patologias, por exemplo, a hepatite, já é considerada teste de confirmação 
do diagnóstico. Vários outros testes rápidos já estão disponíveis para o uso, por exemplo, os testes para 
HIV, sífilis, SARS-Cov-2, entre outros.
Em um dos métodos comumente utilizados, é usado um corante insolúvel, como o ouro coloidal 
(rosa) ou prata coloidal (azul), que vai revelar a formação do complexo imune, antígeno e anticorpo. 
O corante pode ser conjugado no antígeno ou no anticorpo. É insolúvel, ficando próximo ao local onde 
será aplicada a amostra, que é aquosa, e vai permitir a migração da amostra e do conjugado.
O teste é todo realizado em matriz de náilon ou nitrocelulose, revestida por acetato transparente. 
Nessa matriz, o antígeno ou o anticorpo é adsorvido em linhas, e o restante da matriz é recoberto de 
proteínas de bloqueio. A amostra é aplicada sobre o conjugado colorido e, após a migração, vai ocorrer 
a formação de imunocomplexo, que será revelada pelo depósito do corante coloidal na linha de captura.
Para garantir a qualidade do teste, sempre haverá uma região de controle interno do teste, em 
que, obrigatoriamente, terá de ocorrer o depósito do corante coloidal. Caso não seja visualizada a 
região-controle, o teste deve ser invalidado (figura seguinte).
73
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Ouro coloidal
Solução diluente
Amostra com anticorpos anti-T. pallidum
Superfície da amostra
Superfície absorvente
Superfície do conjugado
Membrana de nitroceluloseFluxo
Janela de leitura
Poço
TC
ConjugadoÁrea de controle
Área de 
teste Conjugado
Amostra + 
solução diluente
Antígeno T. pallidum
Proteína do T. pallidum
Anticorpo anti-T. pallidum
Anticorpo da amostra
Figura 45 – Imunocromatografia. A amostra é adicionada próximo ao local em que se encontra o conjugado, que possui um corante 
insolúvel. A migração do conjugado com a amostra vai ocasionar a formação de imunocomplexos em regiões específicas na tira de 
nitrocelulose. A interpretação do resultado como positivo é caracterizada pela visualização de uma linha colorida, sendo que a 
linha-controle deverá sempre aparecer
Fonte: Telelab ([s.d.]b, p. 3).
Esses testes rápidos têm diferentes apresentações, permitindo a detecção de antígenos quando forem 
usados anticorpos como conjugados, e também de anticorpos, mudando o conjugado para um antígeno 
ou até mesmo anticorpos anti-imunoglobulina. Por essa razão, é possível determinar até mesmo a 
presença de anticorpos da classe IgM e IgG, separadamente, em um mesmo teste.
3.2.5 Western Blotting ou Imunoblot
O Western Blotting vem sendo empregado desde 1980, mas recentemente foi incluído no diagnóstico 
e passou a ser vendido comercialmente. É utilizado para caracterizar antígenos, além de distinguir perfis 
de especificidades dos anticorpos. É um método qualitativo.
Para a realização da técnica, inicialmente, deverá ser realizada uma eletroforese, que vai separar uma 
mistura complexa de proteínas. A amostra terá suas proteínas solubilizadas, desnaturadas, e as pontes 
dissulfetos reduzidas, aplicadas em um gel de poliacrilamida, o qual estará submerso em um tampão. 
O sistema vai ser submetido a uma corrente elétrica, que vai separar as proteínas pelo peso molecular. 
Para a desnaturação das proteínas e neutralização das cargas das cadeias laterais dos aminoácidos, pode 
ser utilizado um detergente, o dodecil sulfato de sódio. Quando ele é utilizado, a corrida eletroforética 
é nomeada de SDS-PAGE (figura seguinte).
74
Unidade I
Ânodo
Cuba de plástico
Cátodo
A) B)
Tampão
Gel
Tampão
Aquecidas com SDS e mercaptoetanol
Eletroforese em gel de poliacrilamida
Placa de gel de poliacrilamida
Amostra aplicada no 
gel com uma pipeta
Proteína com duas 
subunidades, A e B, 
unidas por uma 
ligação dissulfeto
Proteína com uma 
única unidade
A
A
A
B
B
B
C
C
C
SH
S-S
HS
Moléculas de 
SDS carregadas 
negativamente
Figura 46 – Corrida eletroforética, SDS-PAGE. A amostra é adicionada a gel de poliacrilamida 
e a mistura é separada por corrente elétrica, pelo peso molecular
Adaptada de: Montassier ([s.d.]c, p. 4).
Após a eletroforese, a amostra é transferida para uma membrana e ficará imobilizada. Pode ser 
uma membrana de nitrocelulose ou acetato. O resultado na membrana será revelado com o uso de um 
anticorpo primário, que é específico para o antígeno, uma proteína que estava presente na amostra, que 
já está imobilizada na membrana, porém essa ligação será visualizada sem a presença de um revelador.
Será necessário adicionar um anticorpo secundário, uma anti-imunoglobulina, conjugada com uma 
enzima, ou um radioativo, ou um fluoróforo. Dependendo do conjugado, o método de revelação vai 
mudar, podendo ser com o uso de substrato cromogênico, ou de equipamentos que revelem a radiação, 
ou, ainda, que detectem a fluorescência.
A metodologia de Western Blotting tem aplicação clínica principalmente no diagnóstico do HIV. Além 
de ser um dos métodos confirmatórios de escolha, ela pode ser utilizada para determinar o sorotipo do 
vírus, diferenciando em HIV-1 e HIV-2.
Já em pesquisa científica, essa metodologia é utilizada sempre que se deseja confirmar a presença 
de uma proteína em uma amostra, podendo ter diversas aplicações. Como visto anteriormente, ela pode 
75
IMUNOLOGIA CLÍNICA
ser utilizada na produção de anticorpos monoclonais e também em clonagem de proteínas, estudos de 
expressão gênica, entre outros.
Agora, as metodologias utilizadas no imunodiagnóstico já foram descritas. Posteriormente, essas 
técnicas serão retomadas ao tratarmos do diagnóstico de doenças virais, congênitas e autoimunes, assim 
como da imuno-hematologia, com a aplicação em banco de sangue. Lembrando que as aplicações se 
estendem para diversas outras patologias. Além disso, os métodos podem ser utilizados com diferentes 
propósitos na pesquisa. Porém, antes de as aplicações na clínica serem descritas, será necessário 
entender como esses métodos são avaliados de acordo com a sua confiabilidade, ou seja, capacidade de 
acertar um resultado, e quanto a sua reprodutibilidade. Por esse motivo, na sequência, estão descritos 
os parâmetros sorológicos.
4 IMPORTÂNCIA DOS MÉTODOS SOROLÓGICOS E PARÂMETROS SOROLÓGICOS
Nas últimas décadas, foi visto um grande progresso tecnológico que permitiu um avanço nos 
métodos confiáveis e capazes de detectar complexos antígenos-anticorpos com alta eficiência. Além 
disso, esses métodos estudados em imunologia clínica permitem a detecção de patógenos através de 
ferramentas imunológicas. Por serem pouco invasivos, são utilizados com frequência como umaforma 
de diagnóstico indireto pela detecção de anticorpos ou até mesmo dos próprios antígenos, usando 
o conhecimento da ligação antígeno com anticorpo, a formação de imunocomplexos. Essas técnicas 
que utilizam a imunologia como ferramenta para o diagnóstico laboratorial são conhecidas como 
imunodiagnóstico, e podem detectar tanto antígenos como anticorpos. Esses métodos são rápidos, 
baratos e podem ser facilmente automatizados.
Para o diagnóstico laboratorial de uma patologia, deve ser demonstrada a presença do agente agressor 
ou do seu produto nos tecidos ou líquidos biológicos. Entretanto, muitas vezes, esse processo pode ser 
dificultado pela ausência do patógeno investigado ou pelo fato de os métodos de detecção serem de 
baixa sensibilidade e passíveis de falhas técnicas. Por esses motivos, o uso do imunodiagnóstico, seja de 
forma indireta, medindo a resposta imune, seja de forma direta, usando o conhecimento de formação 
de complexo imune para detectar o patógeno, é amplamente difundido. As sorologias são os exames 
mais solicitados dentro da medicina e fazem parte do imunodiagnóstico, mas outros exames, como as 
imuno-histoquímicas, também fazem parte das técnicas ditas imunológicas.
Como o nome sugere, as sorologias são técnicas de diagnóstico laboratoriais nas quais a amostra 
biológica deve ser o soro, apesar de poderem ser utilizadas, em alguns casos específicos, outras amostras, 
como urina, esperma, líquido cefalorraquidiano, líquido amniótico, entre outros. Contudo a parte líquida 
do sangue, que é obtida após o processo da coagulação, o soro, é a amostra mais utilizada, pela fácil 
obtenção e por conter as proteínas do sistema imune na sua composição, principalmente os anticorpos.
Quanto às técnicas imunológicas, são utilizadas para o diagnóstico individual, mais especificamente 
para a detecção de anticorpos. Os métodos vão permitir:
76
Unidade I
• elucidar processos patológicos com sintomas e sinais clínicos confundíveis;
• diferenciar a fase da doença, através da quantificação de IgM e IgG;
• diagnosticar doença congênita;
• selecionar doadores de sangue;
• selecionar doadores e receptores de órgãos para transplantes;
• avaliar o prognóstico da doença;
• avaliar a eficácia da terapêutica e a suspensão terapêutica;
• avaliar a imunidade específica naturalmente adquirida ou artificialmente induzida;
• verificar o agravamento da patologia.
Por exemplo, um indivíduo dá entrada em um atendimento de pronto-socorro com sinais e sintomas 
pouco específicos, como febre, mal-estar, vômitos, diarreias, mialgias, comuns a todas as viroses. Por 
serem sintomas associados ao processo inflamatório e semelhantes no início de todas as doenças, não há 
nenhum sintoma diferencial que permita o diagnóstico clínico desse paciente. O uso da sorologia, nesse 
caso, vai permitir a “descoberta” do patógeno causador dos sintomas. Para melhorar o entendimento, 
pensem em pacientes com dengue, Zika, ou chikungunya: todos esses vírus se manifestam de forma 
muito semelhante, contudo, quando é realizada a sorologia, apenas a doença que está em curso vai ser 
capaz de gerar resposta imune, com produção de anticorpos da classe IgM, que poderão ser quantificados, 
fazendo assim o diagnóstico diferencial.
Em alguns testes sorológicos, serão quantificados antígenos em vez dos anticorpos. Nestes, as 
principais aplicações serão:
• como critério de cura;
• na definição da etiologia da doença;
• na seleção de doadores de sangue;
• em inquéritos epidemiológicos.
Outra aplicação dos métodos sorológicos está relacionada com os inquéritos sorológicos, quando 
anticorpos são quantificados com o intuito de estabelecer a prevalência da doença e verificar a 
erradicação da doença ou a reintrodução de novos casos em áreas consolidadas.
77
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Por isso, serão discutidos os parâmetros sorológicos intrínsecos e extrínsecos dos testes laboratoriais, 
principalmente, os associados aos imunoensaios, úteis para a compreensão do real valor de um resultado 
quando for associado a um achado clínico e epidemiológico num indivíduo.
Um resultado de um teste de laboratório é uma probabilidade que vai refletir a situação clínica 
de um indivíduo quando é coletada a amostra biológica. Para que ele seja real, é necessário saber 
interpretar os resultados em relação aos limites do teste utilizado. Por isso, é preciso saber a frequência 
em que o teste acerta ou erra o resultado. Um teste que atinja a causa real da doença, tão diretamente 
quanto possível, que seja definitivo e independente do teste que está sendo avaliado para a obtenção 
dos parâmetros sorológicos, é dito gold standard test ou teste de referência.
Se o teste a ser validado para uso é um ELISA, que detecta anticorpos contra Toxoplasma gondii, 
o teste de referência deve ser de outra metodologia e de outro fabricante. Para definir um teste de 
referência, é preciso conhecer a evolução clínica da doença e os efeitos patológicos gerados pela 
presença do patógeno.
Para a melhor compreensão dos parâmetros imunológicos, é preciso saber que os testes são uma 
probabilidade de que o resultado seja fiel à clínica. É possível que se obtenham resultados positivos ou 
negativos na presença da doença, assim como resultados negativos e positivos na ausência da doença. 
Observe o quadro:
Quadro 3 – Combinação binária de resultados e diagnóstico de doença
Teste
Doença
Presente Ausente
Reagente Verdadeiro positivo (VP) Falso positivo (FP)
Não reagente Falso negativo (FN) Verdadeiro negativo (VN)
Em que:
• Verdadeiro positivo (VP): quando o resultado é positivo na presença da doença.
• Falso positivo (FP): quando o resultado é positivo na ausência da doença.
• Verdadeiro negativo (VN): quando o resultado é negativo na ausência da doença.
• Falso negativo (FN): quando o resultado é negativo na presença da doença.
A partir do momento em que se sabe que em alguns testes o resultado não será a real condição do 
paciente, é possível fazer os cálculos dos parâmetros sorológicos que permitem validar o uso do teste, 
assim como garantir a confiabilidade. Dentro desses parâmetros, temos os de validação intrínseca, 
que avaliam as características do teste, e não da população, e cujos resultados independem da prevalência da 
doença. São eles a sensibilidade, a especificidade e a eficiência. Temos também os de validação extrínseca. 
78
Unidade I
Nessa categoria estão os que se relacionam com a ocorrência da doença: os valores preditivos, verdadeiro 
e negativo; e os que avaliam o desempenho do teste: a reprodutibilidade, a acurácia e a precisão.
A sensibilidade é a proporção de todos os pacientes doentes que apresentam resultados positivos, 
ou seja, refere-se à porcentagem de resultados positivos pelo teste na população doente. Será calculada 
dividindo-se o número de pacientes que derem positivo na presença da doença (VP) por todos os 
pacientes que realmente estão doentes (FN + VP). Então:
Sensibilidade = VP
VP + FN
Para expressar o índice em porcentagem (%), basta multiplicar o valor obtido por 100. Essa definição 
é da sensibilidade clínica, diferente da sensibilidade analítica, que é a capacidade da técnica em detectar 
antígenos e anticorpos.
Já a especificidade é a proporção de indivíduos que não estão doentes e que apresentam o resultado 
negativo no teste avaliado, ou seja, é a porcentagem de resultados negativos quando os indivíduos não 
estão doentes. Será calculada dividindo-se o número de pacientes que tiveram resultados negativos na 
ausência da doença (VN) por todos os pacientes que não estão doentes (VN + FP). Então:
Especificidade = VN
VN + FP
Assim como para a sensibilidade, é possível calcular a porcentagem da especificidade multiplicando 
o número por 100, valor que se refere à especificidade clínica, que difere da técnica. A especificidade é 
influenciada por diversos fatores que geram um resultado falso positivo, como, por exemplo, presença 
de anticorpos naturais em alta concentração. Como esses anticorposem sua maioria são da classe 
IgM, é possível degradá-los utilizando 2-mercaptoetanol, mantendo íntegras apenas as IgG na amostra. 
Outra causa de falso positivo são os pacientes poli-infectados com parasitas intestinais, que formam 
anticorpos que reagem com inúmeros antígenos utilizados nos testes. Os antígenos produzidos por 
recombinação genética têm sido utilizados para diminuir as reações inespecíficas e, com isso, melhorar 
a especificidade dos testes.
O último parâmetro de validação intrínseco é a eficiência, que é a relação entre o somatório dos 
verdadeiros resultados positivos e dos verdadeiros resultados negativos com toda a população estudada. 
Pode ser representada pelas somatórias de todos os testes (n). Quanto mais próximo de 1, melhor será o 
teste em estudo, pois seriam necessários pouquíssimos erros para alcançar esse valor.
Eficiência = VP + VN
VP + VN + FP + FN
Além de possuírem boa sensibilidade, especificidade e eficiência, o esperado para um teste do 
mesmo formato é que ele sempre obtenha o mesmo resultado, em uma mesma amostra biológica, 
em diferentes locais, o que é nomeado de reprodutibilidade. A concordância dos resultados pode 
ser influenciada por diversos fatores, desde a qualidade dos reagentes utilizados, equipamentos mal 
calibrados, má conservação de reagentes e amostra e até mesmo por falhas operacionais. Para evitar 
79
IMUNOLOGIA CLÍNICA
que operadores em locais diferentes obtenham resultados não concordantes em uma mesma 
amostra, ou seja, de um mesmo paciente, cada vez mais os laboratórios vêm investindo em 
certificações de qualidade, como a da International Organization for Standardization (ISO), que tem o 
intuito de garantir a boa qualidade da metrologia, padronizando todas as etapas do laboratório, 
desde a obtenção de insumos até a liberação de resultados, incluindo na rotina laboratorial o uso de 
sorotecas-controle com resultados conhecidos, que garantem a eficiência dos testes realizados.
 Saiba mais
Para saber mais sobre os programas de controle de qualidade, acesse:
SBPC. Programas de qualidade. Rio de Janeiro, [s.d.]. Disponível em: 
https://cutt.ly/sn4NLHn. Acesso em: 9 jun. 2021.
A reprodutibilidade é influenciada fortemente por erros humanos. Pode ser avaliada através de 
repetições realizadas no mesmo momento, com os mesmos reagentes, pelo mesmo operador, que faz 
duplicatas ou triplicatas da mesma amostra, os intratestes; ou feita com a mesma amostra e os mesmos 
reagentes, em dias diferentes, os intertestes.
É possível medir a reprodutibilidade pelo índice kappa, que será o cálculo do grau de concordância 
entre o resultado obtido por mais de dois observadores ao realizar o mesmo exame. O índice kappa vai levar 
em consideração as proporções das concordâncias esperadas (PE) e das concordâncias observadas (PO). 
O valor obtido será de negativo até 1. Para calcular o índice kappa, é necessário obter a combinação binária 
de resultados de um mesmo teste ou acontecimento entre dois observadores. Observe a tabela seguinte.
Tabela 1 – Combinação binária de resultados de diferentes 
observadores para um mesmo evento
 Observador 2
Observador 1 
Positivo Negativo Total
Positivo a b a + b
Negativo c d c + d
Total a + c b + d N
Os valores obtidos entre os dois observadores que estão em concordância estão representados na 
tabela anterior como a e c. Já os que não estão em concordância estão representados como b e d. Então 
a + c é a soma das concordâncias, enquanto b + d é a soma dos resultados que não concordarão entre 
os dois observadores. A soma de todos os resultados é N. Com esses dados, é possível calcular a PO e a PE, 
utilizando as fórmulas seguintes:
 
80
Unidade I
PO = (a + d)
N
PE = [(a + b) + (a + c) + (d + c) + (d + b)]
N2
Após o cálculo de PO e de PE, é possível calcular o índice kappa (κ):
κ = (PO - PE)
(1 - PE)
Como dito anteriormente, o resultado obtido de κ vai variar de negativo até 1. Quanto mais próximo 
de 1, melhor foi a concordância entre os resultados obtidos pelos diferentes observadores, ou seja, houve 
reprodutibilidade. Para melhor visualização das concordâncias entre os testes, o κ será classificado de 
ruim até quase perfeito, observe o quadro seguinte.
Quadro 4 – Classificação do índice kappa
Valor do κ Concordância
0,00 – 0,20 Ruim
0,21 – 0,40 Fraca
0,41 – 0,60 Moderada
0,61 – 0,80 Substancial
0,81 – 1,00 Quase perfeita
Para a validação extrínseca, será necessário o conhecimento do número de casos de uma doença em 
uma determinada localidade. Para isso, é obtida a prevalência, que será a representação da porcentagem 
de doentes na população. O cálculo da prevalência é obtido dividindo a somatório de todos os doentes 
da população (VP+FN) pelo número de indivíduos (N).
Prevalência: VP + FN/N
Além disso, o número de soros, amostras, positivos (VP + FP) em uma determinada população dividido 
pela população permite calcular a prevalência sorológica:
Ps: VP + FP/N
A partir daí, é possível calcular a prevalência verdadeira da doença em uma população, que será a 
divisão da prevalência sorológica pela prevalência da doença.
Já os valores preditivos, positivo e negativo, serão definidos como a precisão de um teste em prever a 
condição clínica. O valor preditivo positivo (VPP) vai representar a probabilidade de um teste gerar um 
resultado positivo quando o indivíduo está doente. O valor preditivo negativo (VPN) é a probabilidade 
81
IMUNOLOGIA CLÍNICA
de um teste dar negativo na ausência da doença. Para calcular VPP, é necessário dividir os valores 
positivos dos que estão doentes (VP) pela soma de todos os resultados positivos obtidos em um teste 
(VP + FP). Já o VPN será a divisão dos negativos na ausência de uma doença (VN) por todos os resultados 
negativos obtidos em um teste (VN + FN).
VPP = VP
VP + FP
VPN = VN
VN + FN
As características de um teste, como sensibilidade e especificidade, não fazem os valores preditivos 
inalteráveis. Eles podem mudar dependendo do limiar de reatividade ou ponto cut off (figura 
seguinte), estabelecido pelos fabricantes. Para o ensaio realizado, esse ponto ou limiar de reatividade é 
o valor obtido no qual o teste, a partir do resultado da população testada, será considerado positivo. Em 
geral, quanto maior a sensibilidade, menor será a especificidade, e vice-versa. Por isso, dependendo da 
finalidade do uso do teste em questão, o limiar de reatividade poderá ser alterado.
10
Fr
eq
uê
nc
ia
100%
20 40 80 160 320 640 1.280 2.560
Corte em:
α = Máxima sensibilidade
β = Máxima especificidade
γ = Máximas sensibilidade e especificidade
Título
γβα
Figura 47 – Distribuição hipotética dos resultados encontrados nos grupos de indivíduos sadios e doentes. No limiar 
de reatividade, estão a sensibilidade e a especificidade intermediárias. Se o limiar for deslocado para a direita, não 
existirá nenhum falso positivo, sendo o máximo de especificidade; já o deslocamento para a esquerda permite que 
não haja nenhum resultado falso negativo, sendo o máximo da sensibilidade
Fonte: Casseb (2021, p. 16).
Mas o que a sensibilidade e a especificidade vão representar na prática? Quando se diz que um 
teste é 98% específico e 93% sensível, significa que esse teste tem uma probabilidade de 2% de gerar 
resultados falsos positivos e de 7% de falsos negativos, respectivamente. Infelizmente, nenhum teste 
consegue ser 100% sensível e específico. Com isso, a escolha vai depender da aplicação. Por exemplo, 
se o teste será utilizado em banco de sangue para a triagem de doadores, será eleito um teste de alta 
sensibilidade, com baixo limiar de reatividade, o que impede que ocorram resultados falsos negativos, 
para que não haja doação de sangue contaminado, mas, se o teste será utilizado para um diagnóstico 
clínico, é esperado o contrário, que não existam resultados falsos positivos, então, os testes de escolha 
serão aqueles com um alto limiar de reatividade, ou seja, alta especificidade.
82
Unidade I
Para aplicar esse ponto decorte, é utilizada a curva ROC (Receiver Operating Characteristic), que 
tem como função minimizar ao máximo os resultados falsos. A curva ROC é uma representação gráfica 
do desempenho de um teste e vai apresentar a relação entre a sensibilidade (taxa de falsos negativos) 
e a especificidade (taxa de falsos positivos). Com esse gráfico, será possível visualizar a região em que 
ocorre a sobreposição entre os pacientes doentes e sadios, a precisão intrínseca de um teste. É uma 
ótima ferramenta quando se quer comparar dois testes.
Os resultados encontrados em um estudo de um teste mostram na maioria dados de indivíduos 
saudáveis, considerados normais. São determinados a partir do cálculo da média da população, 
acrescentando dois desvios-padrão. Mesmo esse valor dito normal deve considerar as variações que 
podem existir por causa de idade, gênero, ciclo circadiano, entre outras. Por esses motivos, pode 
ocorrer variação de resultados entre dois estudos, o que permite que existam diferentes pontos de 
corte. Esses diferentes pontos de corte fazem com que seja possível calcular o valor limiar ideal 
de um teste.
Com isso, podem ser construídas curvas ROC (figura seguinte) utilizando diferentes gráficos 
(PRATES, 2020), de diferentes índices de sensibilidade e especificidade, obtidos com diferentes valores 
de cut off. Serão colocados os índices que representam a sensibilidade (VP) no eixo das ordenadas, e 
no eixo das abscissas, os índices da especificidade (FP), mostrando ponto a ponto os cut off obtidos. 
Um teste com 100% de acurácia teria a sobreposição da curva ROC com o eixo Y, ou seja, 100% de 
verdadeiro positivo. A acurácia global de um teste será descrita pela área sob a curva ROC. Quando a 
área da curva ROC for próxima de 1,0, o teste estará o mais perfeito possível; quanto mais próximo 
de 0,5, os resultados estão sendo randômicos, sendo a probabilidade de acerto do teste, nesses 
casos, um acaso.
 Observação
Acurácia é um parâmetro que determina a capacidade do teste 
em fornecer resultados muito próximos ao verdadeiro do valor que 
se está medindo.
83
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Não 
doentes
Não 
doentes
Não 
doentes
Doentes
Doentes
Probabilidade estimada 1
Taxa de falso positivo
Ta
xa
 d
e 
ve
rd
ad
ei
ro
 p
os
iti
vo
Doentes
Curva 3
Curva 3
Curva 1
Curva 1
Curva 2
Curva 2
C
B
A
Figura 48 – Diferentes tipos de curva ROC. Na curva 1, não vão existir resultados falsos. Na curva 2, 
temos o limiar de reatividade, em que se tem especificidade e sensibilidade intermediárias. 
Na curva 3, os dados serão randômicos
O conhecimento dos parâmetros sorológicos, assim como dos métodos diagnósticos existentes e 
utilizados na rotina laboratorial, permite que se saibam as vantagens e limitações, o que vai auxiliar na 
interpretação dos resultados obtidos. Essa capacidade de interpretação vai ser essencial para um bom 
analista clínico.
84
Unidade I
 Resumo
Foi feita uma revisão dos componentes da resposta imunológica, assim 
como a descrição dos principais mecanismos efetores da resposta.
Foram apresentadas as células, as moléculas e as formas de ativação 
da resposta imunológica e, ainda, os mecanismos de imunidade passiva e 
ativa. Depois, foram descritas as características estruturais e funcionais da 
molécula de anticorpo, e as funções efetoras foram diferenciadas entre as 
cinco classes de anticorpos, IgA, IgD, IgE, IgM e IgG.
A forma em que ocorre a ativação dos linfócitos B foi abordada, 
discriminando a T-independente de T-dependente. A secreção de anticorpos 
em relação ao curso de uma doença foi estabelecida, sendo que a classe IgM 
é a primeira a ser produzida e, por isso, considerada a fase inicial ou aguda 
de doença. Em contrapartida, a classe IgG é de fase crônica ou doença 
pregressa, relacionada também com memória imunológica, além de ser a 
imunoglobulina que pode ser transmitida para o feto durante a gestação, 
ou seja, ultrapassa a barreira placentária. Os antígenos também foram 
apresentados e classificados em imunógenos e haptenos. Finalmente, foi 
descrita a produção de anticorpos monoclonais e sua importância, tanto 
nos métodos diagnósticos como em tratamento de doenças.
Após a descrição dos conceitos de imunologia básica, foi iniciado 
o estudo dos métodos sorológicos, suas aplicações na rotina médica e 
em estudos epidemiológicos. Para garantir a confiabilidade dos métodos 
da imunologia clínica, é preciso conhecer e saber avaliar os parâmetros 
sorológicos, tanto os de validação intrínseca como os de validação 
extrínseca. Por isso foram definidos os parâmetros sensibilidade, 
especificidade, prevalência, valores preditivos positivos e negativos e como 
usar esse conhecimento na determinação e interpretação dos resultados 
pelo limiar de reatividade e a curva ROC, além de ter sido explanada a 
avaliação de reprodutibilidade dos testes, através do índice kappa.
Já os métodos sorológicos foram separados em não marcados e 
marcados. Os não marcados são precipitação, aglutinação e ensaios líticos; 
já os marcados são baseados na ligação de um conjugado que pode ser 
um fluorocromo, nas imunofluorescências IFAS, uma enzima, nos ELISA, 
um radioisótopo, nos RIA ou IRMA, ou até mesmo um luminol em um 
dos componentes do ensaio. O uso do conjugado permitiu o aumento da 
sensibilidade dos métodos, além da automação. Hoje os métodos sorológicos 
mais utilizados são os imunoenzimáticos e os testes imunocromatográficos, 
os testes rápidos.
85
IMUNOLOGIA CLÍNICA
 Exercícios
Questão 1. Os testes sorológicos baseiam-se na reação entre antígenos e anticorpos e são 
utilizados no diagnóstico de doenças de diferentes etiologias. Alguns exemplos são o ensaio de 
imunoabsorção enzimática (ELISA, do inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), o Western Blotting, 
a imunoprecipitação, a imunofluorescência e o radioimunoensaio.
Com relação aos principais testes sorológicos, avalie as afirmativas.
I – De acordo com o tipo de ELISA, podemos detectar antígenos específicos no soro do paciente ou 
verificar o estabelecimento de imunidade humoral contra determinado patógeno.
II – Nos ensaios de Western Blotting, o anticorpo primário apresenta afinidade pelo antígeno 
específico que se deseja detectar, e o anticorpo secundário apresenta afinidade pelo anticorpo primário.
III – Nos ensaios de imunoprecipitação, a formação de imunocomplexos é máxima quando se usa 
excesso de anticorpos em relação à quantidade de antígenos.
IV – Nos radioimunoensaios e nos ensaios de imunofluorescência, o uso de anticorpos policlonais 
garante maior especificidade da interação antígeno-anticorpo.
É correto o que se afirma apenas em:
A) I e II.
B) II e III.
C) III e IV.
D) I e III.
E) II e IV.
Resposta correta: alternativa A.
Análise das afirmativas
I – Afirmativa correta.
Justificativa: os métodos de ELISA direto, indireto, por competição e “sanduíche” utilizam anticorpos 
para detectar antígenos específicos na amostra biológica. No âmbito do diagnóstico clínico, a presença 
desses antígenos indica doença.
86
Unidade I
Os métodos de captura de imunoglobulinas, por sua vez, utilizam antígenos para detectar anticorpos 
específicos no soro do paciente. Nesse segundo caso, é possível verificar se houve o estabelecimento de 
resposta imune contra o agente causador da doença.
II – Afirmativa correta.
Justificativa: os ensaios de Western Blotting são realizados de acordo com as etapas descritas a seguir.
• É realizada a extração da fração proteica da amostra de interesse.
• As proteínas extraídas são submetidas a uma corrida eletroforética para separação de acordo com 
seu peso molecular, e transferidas para a membrana de nitrocelulose.
• À membrana de nitrocelulose previamente tratada é adicionado o anticorpo primário, que 
apresenta afinidade pelo antígeno que se deseja identificar.
• É adicionado o anticorpo secundário, que se liga de maneira específica ao anticorpo primário.
• O anticorpo secundário é conjugado a moléculas radioativas ou fluorescentesou a enzimas, o que 
permite a detecção da ligação a partir do desenvolvimento de sinal específico.
III – Afirmativa incorreta.
Justificativa: os ensaios de imunoprecipitação baseiam-se na adição de anticorpos específicos a uma 
amostra biológica na qual se deseja detectar determinado antígeno. A ligação do anticorpo ao antígeno 
resulta na formação de imunocomplexo insolúvel, que precipita.
Quando há excesso de anticorpos ou de antígenos, não são formados imunocomplexos suficientes 
para que ocorra precipitação. No entanto, quando a concentração de antígenos e a concentração de 
anticorpos na amostra são equivalentes, há a formação dos imunocomplexos e a máxima precipitação.
IV – Afirmativa incorreta.
Justificativa: os anticorpos policlonais reconhecem mais de um epítopo antigênico e, por esse 
motivo, são menos específicos do que os anticorpos monoclonais.
87
IMUNOLOGIA CLÍNICA
Questão 2. Um novo ensaio de imunocromatografia, desenhado para o diagnóstico sorológico rápido 
da COVID-19 e muito mais barato do que os testes já disponíveis comercialmente, foi desenvolvido 
com o objetivo de se reduzirem os custos associados a esse tipo de exame. Antes da comercialização 
desse teste, foi necessário validá-lo a partir da testagem do soro de 502 indivíduos comprovadamente 
positivos e de 479 indivíduos comprovadamente negativos para o vírus. A tabela a seguir mostra os 
resultados obtidos com a aplicação do novo ensaio.
Tabela 2 – Validação do ensaio de imunocromatografia 
para o diagnóstico rápido da COVID-19
 Doença
Resultado
Presente Ausente Total
Reagente 453 121 574
Não reagente 49 358 407
Total 502 479 981
Com relação aos resultados apresentados na tabela, avalie as afirmativas.
I – A especificidade é maior do que a sensibilidade, o que significa que o teste é capaz de detectar a 
doença mesmo quando a viremia está muito baixa.
II – Os resultados falsos positivos são proporcionalmente mais frequentes do que os falsos negativos, 
o que é uma observação comum nos testes rápidos.
III – A eficiência do teste é de aproximadamente 0,8, o que significa que os resultados correspondem 
à realidade em cerca de 80% dos casos.
É correto o que se afirma em:
A) I e II, apenas.
B) II e III, apenas.
C) I e III, apenas.
D) III, apenas.
E) I, II e III.
Resposta correta: alternativa B.
88
Unidade I
Análise das afirmativas
I – Afirmativa incorreta.
Justificativa: a sensibilidade refere-se à proporção de resultados positivos (reagentes) nos pacientes 
que estão doentes, ou seja, é a relação entre os verdadeiros positivos (VP) e o total de doentes. Lembre-se 
de que, nos casos em que o total de doentes não é indicado claramente na questão, ele pode ser 
calculado somando-se os resultados verdadeiros positivos (VP) e os resultados falsos negativos (FN).
Do exposto, conclui-se que a sensibilidade pode ser obtida dividindo-se 453 (VP) por 502 (total de 
doentes). Ao se multiplicar o resultado (0,902) por 100, obtém-se o percentual, que é de 90,2%. Assim, 
a sensibilidade é igual a 90,2%.
VP
Sensibilidade
total de doentes
=
453
Sensibilidade
502
=
Sensibilidade = 0,902, ou 90,2%
A especificidade é a proporção de resultados negativos (não reagentes) nos indivíduos que não 
estão doentes, ou seja, é a relação entre os resultados verdadeiros negativos (VN) e o total de pacientes 
sem a doença. Lembre-se de que, nos casos em que o total de indivíduos sem a doença não é indicado 
claramente na questão, ele pode ser calculado somando-se os resultados verdadeiros negativos (VN) e 
resultados falsos positivos (FP).
Do exposto, conclui-se que a especificidade pode ser obtida dividindo-se 358 (VN) por 479 (total de 
indivíduos sem a doença). Ao se multiplicar o resultado (0,747) por 100, obtém-se o percentual, que é 
de 74,7%. Assim, a especificidade é igual a 74,7%.
VN
Especificidade
total de não doentes
=
358
Sensibilidade
479
=
Especificidade = 0,747, ou 74,7%
Portanto, a sensibilidade do teste é maior do que a especificidade, e esse dado não significa, 
necessariamente, que a doença será detectada mesmo quando a viremia estiver muito baixa.
89
IMUNOLOGIA CLÍNICA
II – Afirmativa correta.
Justificativa: os falsos negativos (FN) correspondem às amostras de indivíduos doentes que obtiveram 
resultado negativo (não reagente) no novo teste. Da análise da tabela, concluímos que 49 amostras, de 
um total de 502, obtiveram resultados FN (9,7%).
Os falsos positivos (FP), por sua vez, correspondem às amostras de indivíduos que não apresentam 
a doença, mas obtiveram resultado positivo (reagente) no novo teste. Da análise da tabela, concluímos 
que 121 amostras, de um total de 479, obtiveram resultado FP (25,2%).
Portanto, os FP são proporcionalmente mais frequentes do que os FN no novo teste. Isso é, de 
fato, normalmente observado nos testes rápidos, que apresentam, via de regra, maior sensibilidade 
do que especificidade (note que, se o número de FN é proporcionalmente menor, o de VP é 
proporcionalmente maior).
III – Afirmativa correta.
Justificativa: a eficiência é calculada dividindo-se o número de amostras com resultados corretos 
(VP e VN) pelo número total de amostras (doentes e não doentes), que corresponde à somatória de todos 
os resultados (VN+VP+FN+FP).
Uma vez que VP é igual a 453, VN é igual a 358, e o total de amostras é igual a 981, temos que:
( )
( )
VP VN
E
doentes não doentes
+
=
+
( )453 358
E
981
+
=
811
E
981
=
E = 0,827, ou 82,7%
Ou seja, o teste “acerta” em aproximadamente 82,7% das vezes.