GABARITO-AD1-BIOCEL I-2004-2

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1a. Avaliação a Distância – 2004/2- Disciplina: Biologia Celular I 
 
1) Você tem uma amostra de células infectadas por vírus para analisar, com o objetivo de 
responder várias perguntas. Como ferramentas, você dispõe de uma amostra de células do 
mesmo tipo, porém não infectadas, além de anticorpos contra os vírus produzidos em 
coelho. Explique como você faria para responder as seguintes perguntas, indicando os 
principais reagentes necessários e que equipamentos usaria para mostrar o resultado. (6 
pontos) 
a) Os vírus se localizam no citoplasma ou dentro de algum compartimento celular 
envolvido por membrana? 
R – As células infectadas devem ser processadas para microscopia eletrônica de 
transmissão, onde os vírus podem ser diretamente observados em cortes ultrafinos que 
mostrem o citoplasma, o retículo, o núcleo, a membrana plasmática, os compartimentos 
endocíticos, etc. 
Uma resposta preliminar poderia ser obtida por imunofluorescência porque, apesar de não 
ser possível observar vírus em microscópio óptico, é possível observar a fluorescência 
emitida por anticorpos ligados a ele. Para tanto seria necessário fixar as células, 
permeabilizá-las com detergente e incubar com os anticorpos (primários) que reconhecem 
os vírus seguidos de um anticorpo anti- IgG de coelho (secundário) conjugado a um 
fluorocromo. Assim, seria possível distinguir entre uma localização no núcleo ou no 
citoplasma, mas neste último caso seria impossível afirmar se os vírus estão livres no 
citossol ou dentro de compartimentos envolvidos por membrana. 
Outra possibilidade é o fracionamento celular, mas seria necessário conseguir um grande 
número de células infectadas para ter frações em quantidade suficiente para serem 
analisadas por eletroforese e western blot, usando o anticorpo que reconhece o vírus e um 
anticorpo secundário conjugado a fosfatase alcalina ou peroxidase. 
b) A célula infectada tem alguma alteração na superfície? 
R – Para isso seria necessário processar as células infectadas para microscopia eletrônica 
de varredura, o que exige fixação, pós-fixação, desidratação, secagem pelo ponto crítico, e 
metalização com ouro. Células não infectadas também devem ser processadas para 
comparação. 
c) As células normais formam uma monocamada aderida ao fundo da garrafinha de 
cultura. As células infectadas continuam formando monocamada? 
R- Para saber se as células infectadas continuam formando monocamada, será necessário 
cultivar tais células em garrafas de cultura e observá-las sob microscopia óptica. A técnica 
de microscopia óptica utilizada será alguma que permita a observação de células vivas, tais 
como contraste de fase ou contraste interferencial. 
d) Todas as células daquela cultura estão infectadas ou só algumas apresentam o 
vírus? 
R - Após fixação e permeabilização com detergente, seria feita incubação das células com 
anticorpos primários que reconhecem os vírus seguidos de anticorpos conjugados com 
fluorocromos. Uma opção seria fazer imunoflurescência. Se comparássemos as imagens da 
microscopia de fluorescência com as de contraste de fase ou interferencial poderíamos 
visualizar se todas as células contêm vírus em seu interior ou não. 
Uma resposta mais precisa, porque daria uma quantificação, seria levar o preparado para o 
citômetro de fluxo (FACS). Este aparelho irá colocar cargas negativas nas células 
fluorescentes (infectadas) e positiva nas células normais, colocando-as em recipientes 
diferentes, o que nos permitirá avaliar se há ou não células não infectadas. 
e) Quantas são e qual o peso molecular das proteínas virais reconhecidas pelo 
anticorpo? 
R - Será necessário realizar uma extração das proteínas totais das células infectadas pelo 
vírus e submeter à eletroforese. O gel deverá então ser eletrotransferido para uma 
membrana de nitrocelulose; as proteínas ficarão assim expostas para a marcação com o 
anticorpo primário produzido em coelho seguido do secundário conjugado a fosfatase 
alcalina ou peroxidase que, depois de reveladas, nos permitirão contar quantas são as 
proteínas virais e, comparando com a migração eletroforética do padrão, determinar seu 
peso molecular. Outra possibilidade é a imunoprecipitação, onde misturaremos o anticorpo 
contra o vírus acoplado a uma resina e com o extrato total das células infectadas. Após 
algum tempo de incubação, a mistura é centrifugada em baixa velocidade e no fundo do tubo 
nós teremos a resina acoplada as proteínas virais. Para soltar estas proteínas virais da 
resina, poderemos ferver na presença de SDS e mercaptoetanol; a preparação novamente 
será centrifugada e descartaremos o pellets (resina) e ficaremos somente com o 
sobrenadante (proteínas virais). Esta solução contendo as proteínas virais será submetida a 
uma eletroforese, onde as proteínas serão separadas de acordo com o seu tamanho e massa 
molecular. 
 
2) Qual (is) a(s) possível(is) explicação (ões) para encontrarmos todas as cópias de uma 
molécula apenas numa pequena região da membrana de uma célula? (2 pontos) 
R – Quando todas as cópias de uma molécula estão em uma região da membrana, elas estão 
formando um domínio. Provavelmente estas cópias de moléculas executam alguma função em 
conjunto naquela região da membrana onde estejam localizadas. Certas proteínas não podem se 
difundir pela membrana de uma célula, sendo importante que elas fiquem somente em um 
domínio (exemplos: a) em células responsáveis por absorver nutrientes no trato gastrintestinal, 
é preciso que as proteínas que fazem a absorção estejam voltadas para a luz do órgão; b) (em 
células aderidas é necessário que as proteínas de adesão estejam voltadas para a superfície 
basal). Estas proteínas podem formar complexos, que só podem movimentar em conjunto; 
podem estar associadas ao citoesqueleto ou à matriz extracelular ou podem estar ligadas entre 
si (no caso de proteínas de duas células diferentes ou de uma célula com um substrato), 
limitando desta forma a mobilidade de ambas, ou ainda podem estar limitadas por barreiras, 
que são formadas por arranjos de outras proteínas que também impedem a livre difusão destas 
moléculas. 
As membranas biológicas também apresentam domínios lipídicos (ou plataformas lipídicas, lipid 
rafts), que são regiões lipídicas de baixa fluidez, ricas em colesterol e esfingomielina. As 
plataformas lipídicas por sua vez, também restringem a mobilidade de proteínas no plano da 
membrana. 
 
3) Que recursos tem um protozoário de vida livre que é submetido a um súbito 
abaixamento da temperatura ambiente para que sua membrana plasmática não se 
“quebre”? (2 pontos) 
R - Quanto maior a quantidade de fosfolipídeos com cadeias insaturadas maior será a fluidez da 
membrana. Organismos simples são capazes de modular a síntese de fosfolipídeos com mais 
duplas ligações quando a temperatura cai. Outra estratégia é a presença de colesterol entre as 
moléculas de fosfolipídeos, dificultando a cristalização destas em temperaturas baixas. Alguns 
microorganismos variam a composição lipídica de suas membranas de acordo com a 
temperatura do ambiente.