TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

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TDR: TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE 
1° - O gene de interesse é chamado de inserto, ele é ligado ao vetor (outra molécula de 
DNA) para formar o DNA recombinante. (Inserto + vetor = DNA recombinante) 
2° - Transformação, processo no qual o DNA recombinante é introduzido em uma célula 
hospedeira compatível, essa célula que adquiriu o DNA recombinante e chamada de 
transformante. 
3° - Expressa o gene de interesse. 
INSERTO 
É a amostra de DNA (gene) de interesse a ser inserido no hospedeiro. 
E necessário fazer a: 
EXTRAÇÃO > PURIFICAÇÃO > CORTE COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO = INSERTO 
E depois faz a amplificação desse inserto. 
VETORES DE CLONAGEM 
Para a clonagem molecular é necessário a extração do inserto e fazer a sua inserção em 
uma célula hospedeira. 
Para isso utiliza-se vetores de clonagem, que são pequenas moléculas de DNA que tem 
a capacidade fazer auto replicação dentro de uma célula hospedeira. Os vetores mais 
usados são: Plasmídeos, Bacteriófagos e Cosmídios. 
Características de um vetor de clonagem: 
- Baixo peso molecular 
- Auto replicação (ORI) 
- DNA duplex 
- Sítios de restrição 
- Sistemas de seleção (taxa de sucesso do DNA recombinante). 
PLASMÍDEOS 
São moléculas de DNA circular, dupla fita, extracromossômico 
Não é encontrado em todas as bactérias 
Novas características são devido a mutações nele, sendo ele um dos grandes fatores que 
confere resistência a antibióticos 
 
ORI – Permite a autorreplicação do 
plasmídeo. Ele seria como um 
iniciador da replicação sendo que a 
perca desse sitio não possibilita que 
o plasmídeo não faça a 
autorreplicação. 
 
 
Sitios de restrição (Polylinker): são multiplos sitios de clonagem (MSC), é o local de 
clivage e inserção do inserto. Ele permite a escolha do plasmídeo de acordo com o tipo 
de inserto e enzima de restrição. 
pBR322 (4361pb) 
 
ORI Ndel Pst I Eco RI ORI 
Inserto de 500pb 
EX – 1: Sal I + Eco RV 
 651pb – 185pb = 466pb – 4361pb = 3895pb 
 3895pb + 500pb = 4395pb (inviável lise ) 
Esse fragmento se torna inviável pois não se pode alterar o n° de pb do vetor para isso 
retira-se um fragmento com tamanho semelhante ao que vai ser inserido. 
EX – 2: Sal I – Hind III 
 651pb – 29pb = 622pb – 4361pb = 3739pb 
 3739pb + 500pb = 4239pb (sucesso) 
MARCADORES DE SELETIVIDADE 
Permite reconhecer a bactéria que houve a inserção do DNA no plasmídeo. 
Marcadores de resistência: resistência a antibiótico, no meio de cultivo (placa), o 
antibiótico mata as que não receberão o sitio de resistência ai fica só as recombinantes. 
Fatores de virulência: ex.: a bactéria produz toxinas que mata as que não receberam o 
fragmento de produção 
Metabólicos: permitem às bactérias degradar compostos que irão diferenciar bactérias 
recombinantes de não recombinantes. 
 
 
Um dos marcadores de seleção e o Gene lac Z, ele codifica a enzima beta-galactosidase, 
que e responsável pela clivagem da galactose, o gene lacZ, que codifica a enzima β -
galactosidase, responsável por clivar a galactose (ou, neste caso, o reagente X-gal, um 
análogo da galactose). O sítio reconhecido pelas enzimas de restrição, onde será 
inserido o fragmento de DNA, encontra-se inserido no gene lacZ, o que permite dividi-
lo em duas partes. Quando não há inserção do inserto (DNA de interesse) no vetor, essas 
duas partes estão ligadas, reconstruindo o gene lacZ, então a enzima β -galactosidase 
é produzida, de modo que o X-gal é por ela metabolizado, tornando a colônia azul. Se 
as partes do gene lacZ fossem separadas pela inserção do DNA de interesse, a enzima β-
galactosidase não seria produzida, então o X-gal não seria metabolizado e a colônia 
permaneceria branca. Para esse processo funcionar, é necessário adicionar IPTG ao 
meio, juntamente com X-gal. Esse composto mimetiza a lactose e é indutor do sistema, 
pois liga-se ao repressor do gene lacZ, possibilitando a tradução da β-galactosidase, além 
de não ser metabolizado. 
 
BACTERIÓFAGO 
É um vírus parasita intracelular obrigatório de bactérias, apresenta geralmente dupla 
fita filamentar com extremidades complementar chamado de sitio COS. 
O capsídeo e um envelope proteico, é uma estrutura de proteínas que protege o 
material genético 
O bacteriófago usa a estrutura de uma célula parasitaria para se replicar 
VANTAGENS: 
- Possui um sistema de reconhecimento próprio, ele é reconhecido por um receptor e 
abre uma proteína trans membrana, que faz com que ele injete o material genético e 
apenas ele entra. 
- Sua eficiência de transformação é de 800cel por micrograma. 
A única desvantagem e que o fragmento não pode passar de 15kb 
COSMÍDIOS 
São plasmídeos com fragmento de DNA fago que inclui o sitio COS 
Vantagem suporta fragmentos de DNA de 35 a 40kb, inclui genes humanos em bactérias 
para a produção de substancias. 
Um dos seus fatores limitantes e fazer o empacotamento in vitro 
Sitio: sempre deve-se cortar com a mesma enzima para criar a complementariedade; 
Ligação: usa-se a DNA ligase, que faz ligação fosfodiester em frag de DNA. 
TRANSFORMAÇÃO 
Inserção do DNA recombinante dentro de uma célula. 
TIPOS 
Procariotas: 
Transformação/Competência 
Eletroporação ou transfecção com bacteriófagos ou cosmídeos. 
Eucariontes: 
Vesículas de lipossomos, biobalística, vírus cromossomos artificiais 
TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA 
INDUÇÃO DE COMPETENCIA 
Retira-se a polaridade da molécula, retirando a impermeabilidade desta ela deixa de ser 
seletiva. Trata-se com Cloreto de cálcio 
Desestabiliza a carga da bactéria, capacitando ela de absorver o DNA recombinante 
 
 
 
ELETROPORAÇÃO