Aula _HPLC

Prévia do material em texto

CROMATOGRAFIA COM ÊNFASE
EM CLAE:
APLICAÇÕES PRÁTICAS
HISTÓRICO:
	SÉCULO XX: século da cromatografia
♦ Utilização descrita em textos antigos, 
 gregos e egípcios
	♦ Michael Tswett (1872-1919)
	♦ 1903 1906: “cromatografia”
	♦ Martin & Synge cromatografia de partição
CROMATOGRAFIA:
	Técnica de separação (física/química) na qual os componentes a serem separados são distribuídos entre 2 fases: sendo uma fixa e de grande área superficial, denominada “fase estacionária”, e outra, denominada fase móvel, um fluido que percola através da fase estacionária
SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
	Substâncias têm afinidades diferentes com a fase estacionária e com a fase móvel.
	Fase móvel percola a fase estacionária separação
	♦ Fase Estacionária: adsorção do soluto
	♦ Fase Móvel: dessorção do soluto da F.E.
 
 Eluição do analíto
TIPOS DE CROMATOGRAFIA:
Lanças, F.M. Cromatografia em fase gasosa, 1993 (com modificações)
DEFINIÇÕES GERAIS:
	ADSORÇÃO
	Os compostos são retidos na fase estacionária (polaridade) por um período de tempo (tempo de retenção – TR) até que a passagem constante da fase móvel seja capaz de retirar gradativamente, cada um desses compostos.
	PARTIÇÃO
	Os compostos passam por uma distribuição (solubilidade) entre a fase móvel e a estacionária, que é colocada na coluna na forma de um filme em um suporte sólido hidrofílico.
DEFINIÇÕES GERAIS:
	FATOR DE RETENÇÃO (k): razão entre a massa do soluto presente na FM e na FE. 
	♦ Quanto maior o k , maior o tempo de retenção na coluna.
♦ Juntamente com o fluxo, determina o TR do pico.
	SELETIVIDADE (α): relação entre o tempo que 2 solutos passam na fase líquida.
	♦ Mede a capacidade de separação entre 2 picos e é alterada 
 com a troca do solvente da FM, pH, FE e temperatura.
α
DEFINIÇÕES GERAIS:
	EFICIÊNCIA DA COLUNA:
	Número de pratos teóricos (N): número de distribuição de equilíbrio entre a fase móvel e a estacionária.
	♦ Quanto maior o nº de N, mais eficiente a coluna.
	RESOLUÇÃO:
	Medida quantitativa da separação de 2 picos consecutivos, determinada pela distância entre os TRs e a largura da base dos picos.
DEFINIÇÕES GERAIS:
Rs = t
 wb2
N = 16 TR 2 
 wb
α = TR (B)
 TR (A)
A
B
*
HIGH RESOLUTION GAS CHROMATOGRAPHY (HRGC)
	Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CG). 
	Fase móvel é um gás.
	Fase estacionária: sólida ou líquida.
	Mecanismo de separação:
CGS: tubo percolado com um sólido adsorção
CGL: suporte sólido revestido por um líquido partição
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG):
	Vantagens da técnica:
♦ resolução
♦ velocidade em análise
♦ sensibilidade
♦ exatidão (repetibilidade excelente)
	Limitações:
 ♦ amostra deve ser volátil (gás, líquido ou sólido)
 ♦ amostras sujas requerem limpeza
 ♦ uso de outro instrumento para confirmação de identidade
 ♦ treinamento e experiência
CROMATOGRAFIA GASOSA (CG):
	Escolhas para uma boa utilização da técnica: 
 ♦ Detector (seletivo ou universal)
♦ Coluna (recheio, espessura, comprimento)
♦ Gás de arraste
♦ Introdução da amostra
♦ Controle da temperatura (injeção, coluna e detector)
♦ Quantificação
Cilindro do gás de arraste
Controle de fluxo
Injetor
Coluna
Detector
Registrador
Forno
DETECTORES GC:
	CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS:
 ♦ Alta sensibilidade
	♦ Resposta/detecção adequada a amostra
♦ Linearidade
	♦ Ruído baixo
	♦ Quantidade mínima detectada
DETECTORES GC:
	Principais detectores em CG:
	♦ Detector por Condutividade Térmica (TCD): Universal.
	♦ Detector por Ionização de Chama (FID): Orgânicos.
	♦ Detector por Captura de Elétrons (ECD): Orgânicos com 
 capacidade de capturar elétrons.
COLUNAS GC:
	Empacotadas: maior quantidade de amostra injetada; menor resolução e pratos teóricos.
	Capilares: menor quantidade de amostra; maior resolução e pratos
teóricos.
	Quanto maior o comprimento, maior a resolução e eficiência (mas também, o custo, o TR, a pressão...).
	Quanto menor o diâmetro, maior a eficiência.
	Uso adequado de temperatura.
COLUNAS GC:
	Gás-sólido: (recheio de sílica gel, carvão ativado, aluminosilicato sintético): Adsorção interação entre o analíto e FE, na interface com o gás de arraste (FM); quanto maior a afinidade da amostra pela FE, maior o tempo de adsorção.
	Gás-líquido: (recheio é um sólido recoberto com um líquido de alto ponto de ebulição) Partição quanto mais similares forem a fase líquida e a amostra, mais simples e eficiente será a separação. 
GÁS DE ARRASTE:
	Fase móvel.
	Não interagir com a fase estacionária ou com a amostra.
	Baixo custo.
	Elevado grau de pureza.
	Ser adequado ao detector utilizado.
	Fluxo do gás de arraste irá influenciar na eficiência da coluna. 
INTRODUÇÃO DA AMOSTRA:
	Uma introdução ou injeção de amostra eficiente deve permitir que quantidades controladas cheguem até a coluna, constituindo uma composição idêntica ou pelo menos representativa da amostra. 
	Não existe uma forma universal de injeção que atenda a todas as demandas. 
	A escolha depende da coluna utilizada, das condições operacionais, da T°C e das características da amostra.
INTRODUÇÃO DA AMOSTRA:
	SPLIT: amostra vaporiza no pórtico de injeção e uma porção é introduzida na coluna.
	SPLITLESS: sem divisão da amostra.
	ON COLUMN: diretamente na coluna
	♦ Cold on column: amostra depositada à frio na coluna dentro 
 do forno.
	♦ PTV (Programação de Temperatura Variável): permite a
 injeção de amostras líquidas em colunas capilares 
ANÁLISE QUALITIVA:
	Tempo de retenção: característico do composto, mas não exclusivo dele.
	TR varia com a coluna, fluxo do gás de arraste, fase líquida, temperatura da coluna.
	Identificação por fortificação.
	Sistemas acoplados “on-line” ou “off-line” (Ex: GC-MS).
ANÁLISE QUANTITATIVA:
	Normalização da área simples
	Normalização da área corrigida
	Padrão externo: curva de calibração
	Padrão interno: curva de calibração com adição de padrão interno a cada ponto da curva.
Massa A (%) = área A x 100
 área total
Massa A (%) = área A / FC x 100
 área total / FC
Fator de correção: massa / área
SHIMADZU - LANA:
SHIMADZU - LANA:
CROMATOGRAMA:
Lanças, F.M. Cromatografia em fase gasosa, 1993
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)
	Cromatografia em camada delgada (CCD)
-	Aplicação da amostra em papel recoberto por sílica;
-	Aplicação de concentrações de padrões analíticos;
-	Desenvolvimento da placa em sistemas de solvente;
-	Comparação visual entre o desenvolvimento dos padrões e da amostra (distância e intensidade).
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
(TLC)
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)
	Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
	CLAE: Separação de substâncias em uma mistura, proporcionada pela impulsão de um solvente a fluxo constante e elevada pressão, através de uma coluna na qual essa mistura é seletivamente separada. 
CLASSIFICAÇÃO:
	Quantidade de Amostra
	Mecanismo de separação
	Fase Estacionária
Quantidade de amostra:
	Cromatografia em escala preparativa (>1g)
	Cromatografia em escala semi-preparativa (µg – g)
	Cromatografia analítica (pg - µg)
Mecanismo de Separação:
	Cromatografia líquida de adsorção (Líquido-sólido): adsorção sobre superfície polar.
	Cromatografia de partição líquido-líquido
	Líquido-líquido em Fase ligada: partição (FE e FM).
	Troca iônica: adsorção reversível de íons.
	Exclusão: poros internos separam partículas por tamanho.
Fase Estacionária:
	Fase Normal: FE polar, FM apolar.
	Fase Reversa: FE apolar, FM polar.
ELUIÇÃO
	4 PASSOS:
	- Introdução da amostra
	- Interação entre a amostra, FE e FM
	- Remoção de interferentes
	- Eluição do analíto
TIPOS DE ELUIÇÃO:
	ISOCRÁTICA
 - proporção entre os solventes utilizados na fase
 móvel é constantedurante a eluição.
	GRADIENTE
 - a proporção entre os solventes utilizados varia 
 gradualmente durante a eluição.
PRIMEIROS PASSOS
 ANALÍTO????
	Escolha do tipo de coluna
	Modo de detecção
	Escolha da Fase Móvel
	Otimização de parâmetros para cromatografia
	Validar o método
ANALÍTO: Colunas
	As características do analíto determinam quais as escolhas acertadas quanto ao tipo de equipamento utilizado e suas configurações RESULTADOS
AMOSTRA APOLAR
AMOSTRA POLAR
COLUNA DE FASE NORMAL
COLUNA DE FASE REVERSA
Recheio é polar
Recheio é apolar
ANALÍTO: Detecção
DETECÇÃO:
	O analíto apresenta fluorescência natural ou pode ser derivatizado?
DETECTOR DE FLUORESCÊNCIA
	O analíto absorve a luz branca? 
DETECTOR UV, UV-VIS ou PDA UV-Vis
OUTROS DETECTORES:
	Detector de índice de refração: diferença de refração entre o solvente e o soluto.
	Detector eletroquímico: oxidação ou redução de um composto.
	Espectrometria de massas: combinação de processos de ionização, fragmentação e separação iônica.
DETECTORES:
	Seletivos: UV fixo e variável, fluorescência
	Universais: IR e MS
	UV, fluorescência e MS podem utilizar eluição gradiente, o IR não.
	Quantidade Mínima Detectada:
♦ UV: ng
♦ IR: µg
♦ Fluorescência: pg
♦ MS: ng-pg
ESCOLHA DA FASE MÓVEL
	CONSIDERAÇÕES GERAIS:
	Alto grau de pureza
	Força do solvente
	Polaridade
	Seletividade
	Polaridade ou Força: determina por quanto tempo os eluentes são retidos (TR)
	Seletividade: retenção relativa pode afetar o formato dos picos
ESCOLHA DA FASE MÓVEL
	Modo de eluição?
	Tempo de retenção?
	Presença de interferentes?
	Resolução de picos.
	Linha de base.
	Repetibilidade.
FASE MÓVEL
	Nem todos os solventes podem ser utilizados em conjunto!
	- Podem interagir quimicamente;
	- Viscosidade (pressão);
	- Alta pressão de vapor (bolhas);
	- Interferir na detecção do analíto;
	- Filtrados e degaseificados.
COMPONENTES HPLC:
SHIMADZU
INICIANDO:
	Purga
	Acionar a bomba / subir fluxo
OPERANDO:
AGILENT 1100 - LANA:
SOFTWARE:
MÉTODO:
	A amostra é solúvel?
	É possível analisá-la por HPLC?
	Se sim, qual o detector?
	Qual o modo da coluna?
	Qual a coluna? FE, comprimento, diâmetro, etc.
	FM? Polaridade, pH, força iônica.
A amostra é solúvel?
	Desejável: 1% solução em solvente fraco. Tente hexano, 
MeOH ou água.
	Ácido ou básico (sal?)?
0,01 N HAc – pH ~ 3,4
0,5 N NH4OH – pH ~ 10,6
	Alguns polímeros precisam ser aquecidos.
Ex: polietileno-tolueno (120°C) 
Qual detector?
	Se a amostra pode ser analisada por HPLC (consulte a literatura, busque informações sobre a amostra), o próximo passo é definir qual o detector.
	UV-Vis é a primeira escolha.
	LC/MS – é a melhor escolha.
	Fluorescência – apenas se houver o conhecimento prévio de que é apropriado para a amostra.
	IR – quando não houver informação suficiente sobre a amostra universal, mas pouco sensível.
Que tipo de coluna?
Lanças, F.M. Cromatografia líquida moderna, 2009 – com modificações
Qual a coluna?
	Se solúvel em hexano, a amostra não é polar:
- Sílica gel
- Alumina
- Ciano
	Se solúvel em MeOH:
- RP-18 ou ODS
- RP-8
- Fenil
Qual a coluna?
	Comprimento:
- Começar com 15 cm, 5mm 
- Maior comprimento, maior TR
	Diâmetro da partícula:
- 10 e 5 µm
	Diâmetro interno:
- 4 mm ~ 1mL/min.
- 2 mm ~ 250µL/min.
Fase Móvel:
	Começar com solvente forte, fluxo rápido.
- Obtenha os picos;
- Reduza a força do solvente, se necessário.
	Meça os picos eluídos e otimize a seletividade.
	Aumente o N: fluxo mais lento, menos amostra, maior T°C, comprimento maior, partículas menores.
TROUBLESHOOTING
DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
	ALARGAMENTO DOS PICOS:
	- TR alto
- Viscosidade da FM muito alta
- Eficiência pobre da coluna
- Eluição de analítos de injeções anteriores
- Dispersão do pico na válvula de injeção 
- Coluna com grande volume extra
- Volume da cela do detector muito grande
DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
	PICOS FANTASMAS:
	- Contaminação
- Eluição posterior de analítos retidos
- Água contaminada em FR
- Interferentes desconhecidos na amostra
Branco?
Padrão?
DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
	Formação de cauda frontal:
	- Formação de caminhos preferenciais
- Sobrecarga da coluna
- Cauda lateral: TR elevado, degradação coluna, volume morto
DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
	Sobreposição de picos:
	- Frit entupido
- Co-eluição de interferentes (corrida atual ou anterior)
- Sobrecarga da coluna (uso ou volume)
DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
	Mudanças no tempo de retenção:
	- Contaminantes
- Tempo de condicionamento insuficiente
- Poucas injeções anteriores (sítios ativos)
- Mistura inadequada da FM ou evaporação seletiva
- Temperatura variável da coluna
- Sobrecarga da coluna com amostra
- Fluxo instável
- Degradação da coluna
DIAGNÓSTICO DE PROBLEMAS:
	Pressão alta:
	- Entupimento
- Viscosidade muito alta da FM
- Crescimento de microorganismos
- Precipitação de sais
- Adsorção irreversível na coluna
	Pressão baixa:
	- Vazamentos
- Válvula de purga aberta ou com vazamento
ANÁLISE QUALITIVA:
	Tempo de retenção: característico do composto, mas não exclusivo dele.
	TR varia com a coluna, fase móvel e temperatura.
	Identificação por fortificação.
	PDA: mais informações sobre o composto.
	Sistemas acoplados “on-line” ou “off-line” (Ex: LC-MS).
ANÁLISE QUANTITATIVA:
	Normalização da área simples
	Normalização da área corrigida
	Padrão externo: curva de calibração
	Padrão interno: curva de calibração com adição de padrão interno a cada ponto da curva.
Massa A (%) = área A x 100
 área total
Massa A (%) = área A / FC x 100
 área total / FC
Fator de correção: massa / área
VALIDAÇÃO:
	Instrumento
- Check-list do aparelho
- Testes nos módulos
	Método
- Definir os parâmetros da validação objetivo da análise
- Exatidão e precisão
- Sensibilidade
- LD e LQ
- Linearidade
- Recuperação
- ...
ALGUMAS APLICAÇÕES PRÁTICAS:
	AFLATOXINAS
	DERIVADOS DE PURINAS
	ÉSTERES DE FORBOL
AFM1 EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:
AFM1 EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:
	Parâmetros cromatográficos:
	- CLAE (Shimadzu)
- Extração com colunas de imunoafinidade
- Fase reversa, C18, 250 x 4,6mm, 3 µm (Phenomenex)
- Fase móvel: ACN:H2O (75:25, v/v), isocrática
- Detector de fluorescência
- Volume de Injeção de 100 µL (manual)
- Quantificação em ppt
- Tempo de retenção e derivatização para qualificação
AFM1 EM FLUIDOS BIOLÓGICOS:
AFM1 em urina
Amostra derivatizada – confirmação AFM1
DERIVADOS DE PURINAS:
	Parâmetros cromatográficos:
	- CLAE (Agilent 1100)
- Alantoína, creatinina, ácido úrico, hipoxantina e xantina
- Diluição / centrifugação
- Fase reversa, C18, 250 x 4,6mm (Zorbax)
- FM - tampão A: NH4H2PO4 0,0025 M e tampão B (tampão A:MeOH,
 19:1)
- Detector: Arranjo de fotodiodos
- Volume de Injeção de 20uL (automática)
- Quantificação em ppb
- Qualificação por comparação espectral
DERIVADOS DE PURINAS:
ALANTOÍNA
CREATININA
ÃC. ÚRICO
HIPOXANTINA
XANTINA
OXIPURINOL
ÉSTERES DE FORBOL:
	Parâmetros cromatográficos:
	- CLAE (Agilent 1100)
- Extração por solvente / centrifugação
- Fase reversa, C18, 250 x 4,6mm (Zorbax)
- FM – ACN, tampão B (1,75mL de ácido ortofosfórico, 85%) e 
 THF (eluição gradiente)
- Detector: Arranjo de fotodiodos
- Volume de Injeção de 20uL (automática)
- Quantificação em ppb
- Qualificação por comparação espectral
ÉSTERES DE FORBOL:
FORBOL - TPA
Considerações Finais:
	SÉCULO XXI:
	UPLC ou U-HPLC
LC-MS
Cromatografia Multidimensional (LC-LC ou LC/LC, idem CG)
Cromatografia Abrangente (LCxLC ou CGxCG)
min
0
5
10
15
20
25
mAU
0
50
100
150
200
250
 DAD1 E, Sig=284,8 Ref=360,100 (LANA\CURVA TPA 1\250PPM 22ABRIL 2 F_OTIMIZADO.D)
 3.048
 17.789
 21.528
 21.713
 21.785
 24.143
 26.775
 26.850
 26.904
nm
225
250
275
300
325
350
mAU
0
10
20
30
40
50
*DAD1, 17.787(63.9 mAU, - ) Ref=17.600 & 18.067 of 250PPM 22ABRIL 2 F_OTIMIZADO.D
nm
225
250
275
300
325
350
mAU
0
10
20
30
40
50
 DAD1, 17.600 (4.4 mAU, - ) of 250PPM 22ABRIL 2 F_OTIMIZADO.D
 DAD1, 18.067 (4.6 mAU, - ) of 250PPM 22ABRIL 2 F_OTIMIZADO.D
 DAD1, 17.787 (67.2 mAU, - ) of 250PPM 22ABRIL 2 F_OTIMIZADO.D