Ascorbato total e reduzido

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Metodologia para projetos e 
execução 
 
 
Protocolo: Ascorbato (ácido ascórbico ou vitamina C forma não ionizada) _ Okamura (1980) modificado 
 
Determinação do ascorbato (reduzido e total) [ASCT = ASC + MDHA + DHA] 
1. Princípio do método 
Baseia-se na redução do Fe3+ a Fe2+ pelo ascorbato reduzido, em meio ácido. O Fe2+ forma um 
complexo com o Bipiridil, resultando em uma coloração rosada, que tem absorbância máxima no comprimento 
de onda de 525 nm. Para a determinação do ascorbato total, o agente redutor DTT reduz todo o 
desidroascorbato a ascorbato. 
 
2. Material 
 Espectrofotômetro (visível); cubeta de 1 mL ou placa, centrífuga refrigerada; almofariz e pistilo; 
balança analítica; becker; provetas; balões volumétricos; tubos de ensaio comuns; bastão de vidro; massa 
magnética; agitadores magnético e de tubos de ensaio. 
 
3. Reagentes 
• TCA 5%; (5 mL TCA 100% completar para 100 mL com água) 
• Tampão fosfato de potássio 150 mM, pH=7,4 + EDTA 6,3 mM; 
• TCA 10%; (5 mL TCA 100% completar para 50 mL com água) 
• H2PO4 44%; (51,76 mL de H2PO4 85% completar para 100 mL com água) 
• Bipiridil 4%; (2 g completar para 50 mL etanol 70%) – fazer na hora 
• FeCl3 3%; (1,5 g completar para 50 mL com água) – fazer na hora 
• DTT 10 mM; (0,0154 g completar para 10 mL com tampão Tampão fosfato de potássio 150 mM, 
pH=7,4 + EDTA 6,3 mM) – fazer na hora 
• N-etilmaleimida 0,5% (NEM); (0,05 g completar para 10 mL com água) – fazer na hora 
• Ácido L-ascórbico 1 mM; (manter refrigerado) 
 
4. Marcha analítica 
Extração 
a) Proceder a extração mediante a homogeneização de 0,5 mg do material vegetal fresco (obter 
umidade para o tratamento) ou liofilizado com nitrogênio líquido, seguida pela homogeneização 
com 5 mL solução de TCA a 5%, a 4 °C. Em seguida, centrifugar a 12.000 × g, por 15 min, e 
coletar o sobrenadante. 
Ascorbato reduzido 
b) A reação para ascorbato reduzido é feita em um tubo de ensaio (Placa) adicionando-se 100 (20) 
μL de extrato (usar água para o branco); 100 (20) μL de solução-tampão fosfato de potássio a 
150 mM, pH 7,4 + EDTA 6,3 mM; 100 (20) μL de água destilada; 200 (40) μL de TCA a 10%; 
 
Metodologia para projetos e 
execução 
 
 
Protocolo: Ascorbato (ácido ascórbico ou vitamina C forma não ionizada) _ Okamura (1980) modificado 
 
200 (40) μL de H2PO4 a 44%; 200 (40) μL de bipiridil a 4%, em etanol a 70%, e 100 (20) μL de 
FeCl3 a 3%. 
c) A mistura deve ser agitada por 10 min a 37 °C e depois ficar em repouso por 50 min na mesma 
temperatura antes de proceder com a leitura espectrofotométrica 525 nm. 
Ascorbato Total 
d) A reação para ascorbato total é feita em um tubo de ensaio (Placa) adicionando-se 100 (20) μL 
de extrato (usar água para o branco); 100 (20) μL de solução-tampão fosfato de potássio a 150 
mM, pH 7,4 + EDTA 6,3 mM e 50 (10) μL de ditiotreitol (DTT) 10 mM (preparado em solução 
tampão fosfato de potássio a 150 mM (pH 7,4) com EDTA 6,3 mM); 
e) A mistura deve deixada em repouso por 10 min, em temperatura ambiente, antes de ser acrescida 
de: 50 (10) μL de N-etilmaleimida (NEM) 0,5%. Após 30 segundos adicionar 200 (40) μL de 
TCA 10%, 200 (40) μL de H2PO4 44%, 200 (40) μL bipiridil 4% e 100 (20) μL FeCl3 3%. A 
mistura é agitada por 10 min a 37 °C e depois fica em repouso por 50 min na mesma temperatura 
antes de proceder com a leitura espectrofotométrica a 525 nm. 
f) Calcular os teores de ascorbato reduzido e total foram realizados mediante a curva de padrão de 
ácido L-ascórbico. 
5. Curva-padrão 
Preparar uma solução estoque de ácido L-ascórbico a 1 mM e em seguida preparar os padrões de 
trabalho conforme descrito na tabela a seguir, leitura em triplicata: 
Tubo Ácido L-ascórbico 1 mM (µL) H2Odd (µL) Ácido ascórbico (mM) 
1 0 1000 0 
2 100 900 0,1 
3 200 800 0,2 
4 300 700 0,3 
5 500 500 0,5 
6 700 300 0,7 
7 800 200 0,8 
9 1000 0 1,0 
Proceder a marcha analítica, adicionando o padrão diluído ao invés do extrato vegetal, em triplicata. 
 Ácido L-
ascórbico diluído 
(µL) 
H2Odd 
(µL) 
Tampão fosfato 150 
mM + EDTA 6,3 
mM (µL) 
TCA 
10% 
H2PO4 
44% (µL) 
Bipiridil 
4% 
FeCl3 
3% 
Cubeta 1 
mL 
100 100 100 200 200 200 
100 
Placa 200 
uL 
20 20 20 40 40 40 
20 
Cálculo 
▪ Leitura – branco da amostra -> aplicar a equação da reta que passa pela origem. 
▪ Valor de ascorbato (mM) * 5000/100 (vol. Extrato) * 1/0,5 -> mM g-1 de MF 
▪ Valor de ascorbato (mM g-1 de MF ) * (100 – Umidade %)/100 = mM g-1 de MS 
Referências 
 
Metodologia para projetos e 
execução 
 
 
Protocolo: Ascorbato (ácido ascórbico ou vitamina C forma não ionizada) _ Okamura (1980) modificado 
 
Law, M. Y., Charles, S. A., & Halliwell, B. (1983). Glutathione and ascorbic acid in spinach (Spinacia 
oleracea) chloroplasts. The effect of hydrogen peroxide and of paraquat. Biochemical Journal, 210(3), 899-
903. 
Okamura, M. (1980) Clin. Chim. Acta 103, 259-268