Aula 2 - Cinética Enzimática

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Cinética Enzimática
Disciplina: Engenharia Bioquímica
Professora: Carolina Resmini Melo Marques
Objetivos do estudo da cinética enzimática
• Medir as velocidades das transformações que se processam;
• Estudar a influência de condições de trabalho (como, por exemplo,
concentrações dos reagentes e das enzimas, temperatura, pH,
concentrações de ativadores e de inibidores) naquelas velocidades;
• Correlacionar (quer por meio de equações empíricas, quer por meio
de modelos matemáticos) as velocidades das transformações com
alguns dos fatores que as afetam;
• Colaborar na otimização do processo considerado;
• Estabelecer critérios para o controle do processo;
• Projetar o reator mais adequado.
Medida da velocidade 
Suponhamos que seja possível,
no sistema que nos interessa, medir a
concentração do substrato (ou de um
dos produtos) durante o
desenvolvimento da reação a partir
de seu início. Essas medidas
conduzirão a curvas do tipo das
representadas na Figura 1.
Figura 1: Representação esquemática das 
variações das concentrações do substrato e do 
produto. 
• A rigor, portanto, o único instante em que as condições experimentais
são conhecidas é no instante inicial.
• Por este motivo a velocidade da reação enzimática deve ser calculada,
sempre que possível, no instante t=0, obtendo-se assim a velocidade
inicial ou de consumo do substrato, ou de formação do produto.
• Há, porém, casos mais complexos, em
que a velocidade inicial não pode ser
medida.
• A velocidade da reação, nesses casos, é
frequentemente representada por uma
velocidade média de consumo, ou de
produção, de substâncias
convenientemente escolhidas ou, ainda,
de variação de uma propriedade do
sistema (viscosidade, textura,
absorbância, etc.) em um intervalo de
tempo prefixado.
Figura 2: Medida da velocidade média de 
formação do produto no intervalo de tempo Δt. 
Influência das concentrações da enzima e do 
substrato. Lei de Michaelis e Menten. 
Consideremos uma dada reação
enzimática cuja velocidade inicial pode
ser determinada experimentalmente.
Imaginemos vários ensaios diferindo,
um do outro, apenas pela concentração
inicial da enzima.
A experiência mostra que, dentro
de certos limites, a velocidade da
reação é proporcional à concentração
da enzima.
Figura 3: Representação esquemática 
da influência da concentração da 
enzima na velocidade da reação. 
Se, porém, os ensaios realizados diferirem entre si apenas pela
concentração inicial do substrato, a velocidade inicial da reação será
afetada, como indica a Figura 4.
Figura 4: Representação esquemática da influência da concentração do 
substrato na velocidade da reação. 
As hipóteses básicas do modelo cinético de Michaelis e Menten são:
• o substrato e a enzima reagem reversivelmente entre si formando um
composto intermediário denominado complexo enzima-substrato;
• o complexo formado ou se decompõe, ou reage com outra substância,
regenerando a enzima e formando os produtos da reação.
Consideremos o caso mais simples possível, caracterizado pelos
seguintes pontos:
a) a formação do complexo enzima-substrato se dá na proporção de 1
mol de substrato para 1 mol de enzima, produzindo 1 mol do complexo;
b) o complexo formado se decompõe, sem reagir com outras
substâncias existentes no sistema.
• Esquematicamente, teremos, em um dado instante t:
sendo; 
k1 = constante de velocidade de formação do complexo 
k2 = constante de velocidade de dissociação do complexo 
k3 = constante de velocidade de decomposição do complexo formando o produto 
v = velocidade de formação do produto 
s = molaridade inicial do substrato 
e = molaridade inicial da enzima 
x = molaridade do complexo no instante t 
Admitindo que a concentração do substrato é muito maior que a da
enzima e, portanto, muito maior que a do complexo, podemos
desprezar x em relação a s. A equação acima será, então:
Supondo, ainda, que após um regime transiente inicial muito curto, a
concentração do complexo se mantém constante (hipótese de Briggs e
Haldane), isto é, dx/dt = 0, teremos:
sendo:
podemos calcular a velocidade de formação do produto:
O máximo valor da velocidade será alcançado quando toda a
enzima se encontrar na forma de complexo, isto é, quando x = e.
Indicando-se com V essa velocidade máxima, teremos V = k3.e.
Logo, a equação anterior dará:
Equação de Michaelis e 
Menten 𝑣 = 𝑉.
𝑠
𝐾𝑚 + 𝑠
Figura 5: Representação esquemática da equação de Michaelis e 
Menten. 
Tabela 1: Valores da constante de Michaelis. 
Enzima Substrato Km
Invertase Sacarose 0,020 mol/L
Urease Uréia 0,025 mol/L
Catalase H2O2 0,025 mol/L
Amilase Amido 4,0 g/L
Quanto menor for o valor de Km, maior será a afinidade
da enzima pelo substrato.
A determinação de Km e V a partir de valores
experimentais de s e v , pode ser efetuada linearizando-se a
equação de Michaelis-Menten:
Equação de Michaelis 
e Menten 
𝑣 = 𝑉.
𝑠
𝐾𝑚 + 𝑠
Para tanto, um método muito utilizado,
chamado método de Lineweaver-Burk,
consiste em inverter ambos os
membros da equação de Michaelis-
Menten:
Figura 6: Representação esquemática 
da determinação de V e Km pelo 
método de Lineweaver-Burk. 
1
𝑣
=
1
𝑉
+
𝐾𝑚
𝑉
.
1
𝑠
𝑣 = 𝑉.
𝑠
𝐾𝑚 + 𝑠
Existem outros métodos de linearização, tal como o Método
de Hanes, que consiste simplesmente em multiplicar por s
ambos os membros da equação anterior (linearizada):
Neste último método, s/v varia linearmente com s e os
coeficientes linear e angular da reta correspondente são
respectivamente iguais a Km/V e 1/V.
𝑠
𝑣
=
𝐾𝑚
𝑉
+
1
𝑉
. 𝑠
1
𝑣
=
1
𝑉
+
𝐾𝑚
𝑉
.
1
𝑠
X s
Tabela 2: Velocidade inicial de 
formação do produto em função da 
concentração inicial do substrato. 
Figura 7: Representação 
gráfica dos valores da Tabela 2. 
S (g/L) v (g/L.h)
0,25 0,78
0,51 1,25
1,03 1,66
2,52 2,19
4,33 2,35
7,25 2,57
Figura 8: Determinação de V e Km pelo 
método de Lineweaver-Burk aplicado 
aos valores da Tabela 2 (r = coeficiente 
de correlação). 
Figura 9: Determinação de V e Km 
pelo método de Hanes aplicado aos 
valores da Tabela 2 (r = coeficiente 
de correlação). 
Influência da presença de um inibidor 
• Chama-se inibidor da reação enzimática uma substância que acarreta
diminuição da velocidade da reação.
Inibição 
Irreversível:
Quando o inibidor reage 
irreversivelmente com a 
enzima, bloqueando-a 
parcial ou totalmente.
Inibição 
Reversível:
Quando o inibidor reage 
reversivelmente com a 
enzima.
Inibição 
competitiva
Inibição não 
competitiva
• Inibição competitiva:
Diz-se que um inibidor é competitivo quando compete com o
substrato, ocupando o sítio ativo da enzima.
Teremos então, uma vez que, na prática e :
Cumpre destacar que na reação entre a enzima e o inibidor pode não
ocorrer a formação do produto P’, isto é, pode-se ter apenas:
e, consequentemente, k6 = 0. Sendo dx/dt = dy/dt = 0, as equações 
anteriores nos darão: 
sendo 
A velocidade será, então: onde V=k3.e. 
Equação de velocidade para 
inibição competitiva
Aplicando-se na equação anterior, o método de Lineweaver-Burk,
teremos:
Figura 10: Representação esquemática da 
aplicação do método de Lineweaver-Burk ao 
caso de inibição competitiva. 
As equações e nos permitem calcular a
relação entre as velocidades da reação sem inibidor e com inibidor
competitivo:
Essa última equação nos mostra a influência das concentrações
do substrato e do inibidor na relação.
Em particular, se for possível trabalhar com concentrações de
substrato relativamente altas (matematicamente, s →∞), a influência
do inibidor pode se tornar desprezível.
Essa tendência pode ser também observada no exemplo numérico representado
na Figura 13, no qual V = 6,10 mg/L.min, Km = 2,50 mg/L e Ki = 1,60 mg/L.
Figura 13: Exemplo numérico da influência das concentrações do 
substrato e do inibidor competitivo na velocidade da reação. 
• Inibição não competitiva:
Nesse tipo de inibição, o inibidor não compete como substrato pelo
sítio ativo, mas vai ocupar outro sítio da enzima (sítio regulativo ou de
inibição) como indicado, esquematicamente, a seguir:
formando-se, além dos complexos ES e EI, um terceiro complexo,
enzima-inibidor-substrato (EIS). A velocidade da reação enzimática
será, neste caso:
Equação de velocidade para inibição 
não competitiva
• Na inibição competitiva a velocidade máxima (V) não é afetada e a
constante de Michaelis (Km) é multiplicada por um fator maior que 1.
• Na inibição não-competitiva a constante de Michaelis (Km) não é
afetada e a velocidade máxima (V) é menor do que V.
COMPARAÇÃO ENTRE AS INIBIÇÕES
• Inibição Competitiva: • Inibição Não Competitiva:
COMPARAÇÃO ENTRE AS INIBIÇÕES
• Inibição Competitiva: • Inibição Não Competitiva:
𝑣 =
𝑉. 𝑠
𝐾𝑚. 1 +
𝐼
𝐾𝑖
+ 𝑠
𝑣 = 𝑉.
𝑠
𝐾𝑚,𝑎𝑝 + 𝑠
𝐾𝑚,𝑎𝑝 = 𝐾𝑚. 1 +
𝐼
𝐾𝑖
𝑣 = 𝑉𝑎𝑝.
𝑠
𝐾𝑚 + 𝑠
𝑉𝑎𝑝 =
𝑉
1 +
𝐼
𝐾𝑖
1
𝑣
=
𝐾𝑚
𝑉
. 1 +
𝐼
𝐾𝑖
.
1
𝑠
+
1
𝑉
. 1 +
𝐼
𝐾𝑖
Influência da temperatura 
Na reação enzimática:
a constante de velocidade k, dentro de certos limites, é função crescente da
temperatura do sistema.
A experiência mostra que a influência da temperatura na constante de
velocidade k obedece à lei de Arrhenius:
Onde:
α = energia de ativação
R = constante dos gases perfeitos
T = temperatura absoluta do sistema
Figura 16: Representação esquemática da variação da constante de 
velocidade (k) com a temperatura absoluta (T). 
Lembrando, porém, que as enzimas são termolábeis, ao mesmo tempo que
ocorre a reação enzimática que nos interessa, desenvolve-se também a
reação de inativação térmica da enzima que atua no sistema:
e a constante de velocidade desta reação (k’) também é afetada pela
temperatura de acordo com a lei de Arrhenius:
sendo β a correspondente energia de ativação. 
A experiência mostra que, enquanto o valor de α se situa no intervalo 4 a 20 
kcal/mol, o de β é consideravelmente maior, atingindo 40 a 200 kcal/mol. 
Figura 17: Representação esquemática da influência da temperatura 
absoluta (T) na velocidade de formação do produto (v). 
Influência do pH 
O pH do meio aquoso em que se desenvolve uma reação enzimática
afeta tanto o estado de ionização da enzima quanto a velocidade da reação.
Pode-se supor que a atividade catalítica da enzima depende de seu estado
de ionização.
Imaginemos, então, o seguinte sistema relativamente simples:
1) A enzima se encontra em três estados de ionização, representados por,
E(0), E(-1) e E(-2);
2) Somente E(-1) apresenta atividade catalítica;
3) Os seguintes equilíbrios coexistem no sistema
e as respectivas constantes de equilíbrio são k1 e k2;
4) As molaridades de E(0), E(-1) , E(-2) e H + são, respectivamente, e0, e1, e2 e h;
5) A molaridade total da enzima presente no sistema é e.
Podemos, então, escrever: 
que nos permitem calcular e1 (concentração da fração da enzima que
apresenta atividade catalítica) em função de e (concentração total da
enzima no sistema) e de h (e, consequentemente, do pH). O valor de e1 vai
determinar a velocidade na equação
Exemplo:
Uma enzima catalisa a reação de transformação de um substrato A em
um produto B, de acordo com a reação A→B. Foram realizados testes
com o inibidor Y e sem inibidor, sendo que as concentrações de enzima
foram constantes em todos os experimentos. Os valores experimentais
estão na tabela abaixo:
[A]
(mol/L)
Velocidades iniciais (mol/s)
Sem inibidor Com 0,6mol/L de Y
0,5 2,2 1,8
0,8 3,4 3,1
1,2 4,4 3,8
1,5 5,6 4,5
2 7 5,1
Determine:
a) A velocidade máxima (V) e a constante de Michaelis-Menten para
os dois casos.
b) Classifique o tipo de inibidor, se é competitivo ou não competitivo.
c) Determine o valor da constante de inibição (Ki).
Resolução do exemplo:
a) Equação de Michaelis-Menten linearizada pelo método de
Lineweaver-Burk:
1
𝑣
=
1
𝑉
+
𝐾𝑚
𝑉
.
1
𝑠
𝑦 = 𝐴 + 𝐵. 𝑥
O primeiro passo é achar todos os valores para 1/v e 1/s e depois
montar o gráfico.
𝑣 = 𝑉.
𝑠
𝐾𝑚 + 𝑠
1/[A]
1/v
Sem inibidor Com 0,6mol/L de Y
2 0,454545455 0,555555556
1,25 0,294117647 0,322580645
0,833333 0,227272727 0,263157895
0,666667 0,178571429 0,222222222
0,5 0,142857143 0,196078431
y = 0,2046x + 0,0447
R² = 0,9965
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
-0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5
1
/v
1/S
Sem inibidor
-0,2
0,05
Sem inibidor:
- Pelo gráfico: 
1
𝑉
= 0,05 → 𝑉 = 20𝑚𝑜𝑙/𝑠
−
1
𝐾𝑚
= −0,2 → 𝐾𝑚 = 5𝑚𝑜𝑙/𝐿
- Pela HP ou excel:
𝑦 = 0,0447 + 0,2046. 𝑥
𝐴 =
1
𝑉
0,0447 =
1
𝑉
→ 𝑉 = 22,37 𝑚𝑜𝑙/𝑠
𝐵 =
𝐾𝑚
𝑉
0,2046=
𝐾𝑚
22,37
→ 𝐾𝑚 = 4,58𝑚𝑜𝑙/𝐿
1/[A]
1/v
Sem inibidor Com 0,6mol/L de Y
2 0,454545455 0,555555556
1,25 0,294117647 0,322580645
0,833333 0,227272727 0,263157895
0,666667 0,178571429 0,222222222
0,5 0,142857143 0,196078431
-0,25
0,06
Com inibidor Y:
- Pelo gráfico: 
1
𝑉
= 0,06 → 𝑉 = 16,7𝑚𝑜𝑙/𝑠
−
1
𝐾𝑚
= −0,25 → 𝐾𝑚 = 4𝑚𝑜𝑙/𝐿
- Pela HP ou excel:
𝑦 = 0,0622 + 0,2379. 𝑥
𝐴 =
1
𝑉
0,0622 =
1
𝑉
→ 𝑉 = 16,08 𝑚𝑜𝑙/𝑠
𝐵 =
𝐾𝑚
𝑉
0,2379=
𝐾𝑚
16,08
→ 𝐾𝑚 = 3,82𝑚𝑜𝑙/𝐿
y = 0,2379x + 0,0622
R² = 0,9771
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
-0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5
1
/v
1/S
Com 0,6 mol/L de Y
1/[A]
1/v
Sem inibidor Com 0,6mol/L de Y
2 0,454545455 0,555555556
1,25 0,294117647 0,322580645
0,833333 0,227272727 0,263157895
0,666667 0,178571429 0,222222222
0,5 0,142857143 0,196078431
b) O inibidor Y é “não competitivo”, pois a velocidade máxima (V) é
diferente da velocidade máxima sem inibidor, e o valor de Km é muito
parecido.
c) Para inibição não competitiva:
𝑉𝑎𝑝 =
𝑉
1+
𝐼
𝑘𝑖
→ 16,08 =
22,37
1+
0,6
𝑘𝑖
𝐾𝑖= 1,53 𝑚𝑜𝑙/𝐿