ROTEIRO DE MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA BÁSICA

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INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
CURSO BIOMEDICINA
ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS 
DISCIPLINA: 
MICROBIOLOGIA E MICOLOGIA BÁSICA 
	nstituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica
Titulo da Aula: Coloração de Gram 
	AULA 1
ROTEIRO 1
OBJETIVO: A avaliação da morfologia microbiana é muito importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A coloração de Gram também deve ser revisada dada sua grande importância no diagnóstico clínico das amostras microbiológicas.
TÉCNICA COLORAÇÃO DE GRAM
1) Em uma lâmina pingar uma gota de solução salina estéril.
2) Recolher uma colônia pré-cultivada com alça bacteriológica.
3) Colocar a colônia selecionada junto à lâmina e homogenizar.
4) Fixar o esfregaço no calor.
5) Cobrir o esfregaço com cristal de violeta por 1 minuto.
6) Lavar o esfregaço com água corrente removendo o excesso de corante.
7) Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto
8) Repetir passo 6.
9) Descorar com álcool acetona até remover o excesso de corante.
10) Repetir passo 6
11) Cobrir o esfregaço com safranina por 30 segundos.
12) Lavar e secar
13) Examinar ao microscópio (1000x)
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Solução salina
	10 mL (por grupo)
	Corantes para a coloração de Gram
	01 por grupo
	Cristal de Violeta, Lugol, Álcool-Acetona e Safranina
	01 por grupo
	Placas pré cultivadas com S. aureus
	01 por grupo
	Óleo de imersão 
	01 por grupo
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Lâminas
	05 por grupo
	Microscópios
	01 por grupo
	Alças bacteriológicas
	01 por grupo
	Estufa 37°C
	01
Atenção todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e descarte de microrganismos.
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança:
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica 
Título da Aula: Quantificação Bacteriana - Contagem em placa
	AULA 1
ROTEIRO 2
OBJETIVO: Nesta aula prática será utilizado o método de contagem em placa, que se baseia em três princípios: cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma única bactéria; o inoculo original é sempre homogêneo; e não existem agregações de células. Como normalmente as populações bacterianas são muito grandes, devemos fazer diluições decimais seriadas.
PROCEDIMENTO: (Parte 1 – Esta aula será continuada em aula posterior) 
Diluição decimal seriada 
Marcar tubos contendo 9 ml de salina estéril (10- 1, 10- 2, 10- 3, 10- 4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9); 
 Homogeneizar o tubo de cultura de Escherichia coli e, com pipeta estéril, transferir 1 ml para o tubo da salina marcado 10 -1; 
Homogeneizar o conteúdo do tubo 10- 1, transferindo 1 ml para o tubo de salina marcado 10- 2; 
Repetir este procedimento (diluições sucessivas) até o último tubo
Transferir 0,1 ml de cada diluição em uma placa de Agar Mac Conckey (cada) (Como sugestão usar 3 placas promovendo a semeadura de cada tubo em uma meia placa como no esquema a seguir 
																																																																												
Levar as placas para estufa a 37ºC (SOLICITAR AO TÉCNICO QUE RETIRE APÓS PERIODO DE INCUBAÇÃO, EMBALE EM PAPEL FILME E PAPEL KRAFT E MANTENHA EM GELADEIRA PARA VISUALIZAÇÃO POSTERIOR)
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Tubos contendo a cultura de Eschericha coli em caldo nutriente; 
	1 por grupo
	Séries de tubos com 9 ml de salina estéril em cada um;
	6 por grupo 
	Pipetas de 1 ml; ( AUTOMÁTICA )
	1 por grupo 
	*** Placas de Petri com ágar nutriente.
	6 por grupo 
	Ponteiras de 1 mL 
	6 por grupo
*** Se necessário podem ser feitas 3 por grupo e os alunos devem ser orientados a proceder conforme esquema acima 
				EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Alças bacteriológicas
	01 por grupo
	
	
	Estufa
	01
										
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica 
Título da Aula: Controle da população Microbiana 
	AULA 1 
ROTEIRO 3
OBJETIVO: A pesquisa da microbiota das mãos deve ser feita periodicamente em médicos, enfermeiros, dentistas e outros profissionais da saúde que cuidam de pacientes queimados, com feridas cirúrgicas ou de recém-nascidos. Não é raro, profissionais que possuem bactérias patogênicas na microbiota residente das mãos, como Pseudomonas e o Staphylococcus aureus, o que apresenta um grande risco de contaminação externa para os pacientes. Portanto importante para o aluno identificar o risco que representa uma falta de assepsia no cuidar com o paciente ou com material biológico 
PROCEDIMENTO : (Parte 1 – Esta aula será continuada em aula posterior) 
Com o uso de caneta de marcação permanente, dividir a parte externa do fundo de uma placa de Petri com ágar simples em 3 setores marcando: I, II e III;
Sem lavar as mãos, abrir a placa próximo à chama do bico de Bunsen e tocar o dedo indicador no setor I e fechar a placa; 
Lavar as mãos demoradamente (3 a 5 minutos) com água e sabão neutro. 
Retirar o excesso de agua das mãos ou enxugar com toalha estéril e tocar com o mesmo dedo indicador no setor II; 
Passar a solução antisséptica nas mãos (álcool iodado ou um antisséptico comercial), 
Tocar com o dedo indicador no setor III; 
Identificar o material e incubar a placa a 37º C.
(SOLICITAR AO TÉCNICO QUE RETIRE APÓS PERIODO DE INCUBAÇÃO, EMBALE EM PAPEL FILME E PAPEL KRAFT E MANTENHA EM GELADEIRA PARA VISUALIZAÇÃO POSTERIOR)
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Estufa
	01
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica 
Título da Aula: Susceptibilidade a Antimicrobianos Naturais e Antibióticos 
	AULA 2 
ROTEIRO 1
OBJETIVO: Verificar a Susceptibilidade bactérias frente a antimicrobianos naturais e antibióticos
PROCEDIMENTO : (Parte 1 – Esta aula será continuada em aula posterior) 
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Placas de Agar Mueller Hunton 
	2 (por grupo)
	Suspensão de Escheríchia coli ( suspensão preparada pelo técnico contendo colônias de Escherichia coli em meio liquido de caldo BHI )
	01 Tubo por grupo
	Pimenta do reino em pó
	5-10 g por bancada
	Cravo da India em pó
	5-10 g por bancada
	Açafrão em pó 
	5-10 g por bancada
	Óregano triturado
	5-10 g por bancada
	Alho Triturado
	5-10 g por bancada
	Canela em pó
	5-10 g por bancada
	Discos de Antibióticos ( o que tiver disponível ) ao menos 4 diferentes 
	1 disco de cada antibiótico por grupo
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Lâminas
	06 por grupo
	Microscópios
	01 por grupo
	Alças bacteriológicas
	01 por grupo
PROCEDIMENTO : (Parte 1 – Semeadura e Inoculação)
Semear a suspensão de escherichia coli por técnica de varredura ( em todos os sentidos ) utilizando de swab estéril , nas duas placas de agar MH
Identificar as placas como A e B
Dividir a placa A em 6 áreas como no esquema seguir distribuir nas áreas da placa A ( uma pitada do condimento) um condimento diferente por área tentando não espalhar
Na placa B (dividida em 4 partes) adicionar um disco de antibiótico em cada uma das áreas 
Ver esquema a seguir : 																																																																																																																																			
				
		 Placa A 				 Placa B 
 
Placa A (Representando Condimentos) e Placa B (Representando a distribuição dos discos de Antibiótico)
(SOLICITAR AO TÉCNICO QUE RETIRE APÓS PERIODO DE INCUBAÇÃO, EMBALE EM PAPEL FILME E PAPEL KRAFT E MANTENHA EM GELADEIRA PARA VISUALIZAÇÃO POSTERIOR)
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Estufa
	01
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica 
Titulo da Aula: Semeadura bacteriana 
	AULA 2 
ROTEIRO 2
OBJETIVO: O procedimento de semeadura bacteriana é importante paraa execução da maior parte dos exames microbiológicos. A aula também deve abordar a questão da seletividade dos meios de cultura.
 PROCEDIMENTO: Semeadura por esgotamento
1) Flambar a alça bacteriológica 
2) Recolher de uma placa pré-cultivada uma colônia de bacteriana.
3) Semear por esgotamento em placa de ágar chocolate, sangue e MacConkey. 
4) Encubar por 48horas.
5) Verificar o crescimento e isolamento das colônias.
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Solução salina
	10 ml(por grupo)
	Placa com S. aureus pré isolados para a aula
	01 por grupo
	Placa ágar sangue
	1 por grupo
	Placa ágar Chocolate
	1 por grupo
	Placa ágar Mac Conkey
	1 por grupo
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Alças bacteriológicas
	01 por grupo
	
	
	Estufa
	01
Atenção todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e descarte de microrganismos.
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica 
Titulo da Aula: Preparo de meio de cultura 
	AULA 2
ROTEIRO 3
OBJETIVO: O procedimento de preparo de meio(s) de cultura bacteriana é importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A aula também deve abordar a questão da seletividade dos meios de cultura.
PROCEDIMENTO: Preparo de meios de cultura
1) Leitura de rótulo do meio de cultura
2) Pesagem do meio de cultura em papel manteiga
	Ágar sangue
	
	Ágar Mac Conkey
	Ágar Chocalate
3) Passar o pó para erlenmeyer
4) Dissolver o meio com água destilada, agitar lentamente
5) Autoclavar
6) Distribuir o meio na placa 
Observação: solicitar ao técnico para ligar a autoclave 30 minutos antes do início da aula. 
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Água destilada
	
	Placa para preparar ágar sangue
	2 por grupo
	Placa para preparar ágar Chocolate
	2 por grupo
	Placa para preparar ágar Mac Conkey
	2 por grupo
	Erlenmeyer de 200mL
	3 por grupo
	Proveta de 100 mL
	1 por grupo
	Papel manteiga
	
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Balança analítica
	
	Autoclave 
	
	Bico de Bunsen
	
Atenção todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e descarte de microrganismos.
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica 
Título da Aula: Quantificação Bacteriana - Contagem em placa (CONTINUAÇÃO – PARTE 2)
	AULA 3 
ROTEIRO 1
OBJETIVO: Nesta aula prática será utilizado o método de contagem em placa, que se baseia em três princípios: cada colônia é originada do crescimento e da multiplicação de uma única bactéria; o inoculo original é sempre homogêneo; e não existem agregações de células. Como normalmente as populações bacterianas são muito grandes, devemos fazer diluições decimais seriadas.
PROCEDIMENTO: (Parte 2 – CONTAGEM EM PLACA) 
Retirar as placas da estufa, 
fazer a contagem das unidades formadoras de colônias em cada placa.
O resultado é expresso como número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por ml, de acordo com a seguinte fórmula
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica 
Título da Aula: Controle da população Microbiana (CONTINUAÇÃO -PARTE 2) 
	AULA 3 
ROTEIRO 2
OBJETIVO: Verificação de crescimento bacteriano e identificação do microorganimos isolado por técnica de Gram 
PROCEDIMENTO : (Parte 2 – Verificação e Identificação do Microorganismo isolado) 
Retirar as placas de ágar simples da estufa e observar o crescimento bacteriano nas diferentes áreas da placa caracterizando os tipos morfológicos das colônias e o seu número em cada um dos setores marcados. 
O crescimento na área I qualifica a microbiota transitória ou flutuante, principalmente. O crescimento na área II qualifica a microbiota residente ou permanente. O crescimento na área III qualifica a microbiota resistente ao antisséptico usado. 
∙ Escolher uma colônia isolada em cada setor da placa, realizar 03 esfregaços em lâmina de vidro.
· Após secagem e fixação em chama; 
∙ Submeter as lâminas à coloração pelo método de Gram; 
∙ Observar arranjo, morfologia celular e aspecto tintorial em microscopia óptica com objetiva de imersão (aumento 1000x)
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Solução salina
	10 mL (por grupo)
	Corantes para a coloração de Gram
	01 por bancada
	Placas pré cultivadas e guardadas da aula anterior 
	01 por grupo
	Óleo de imersão 
	01 por grupo
	
	
	
	
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Lâminas
	06 por grupo
	Microscópios
	01 por grupo
	Alças bacteriológicas
	01 por grupo
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica 
Título da Aula: Susceptibilidade a Antimicrobianos Naturais e Antibióticos 
	AULA 3 
ROTEIRO 3
OBJETIVO: Verificar a Susceptibilidade bactérias frente a antimicrobianos naturais e antibióticos
PROCEDIMENTO : (Parte 2 – Verificação da Sensibilidade aos antimicrobianos naturais e sintéticos ) 
Verificar se houve formação de halos ou zonas de inibição de microrganismos aos antimicrobianos naturais e antibióticos utilizados 
Discutir os conceitos de sensibilidade antimicrobiana
Discutir os mecanismos de resistência bacterianos frente aos antimicrobianos
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica 
Título da Aula: Introdução a Micologia (Micélios Aéreos e Micélios Reprodutivos ) 
	AULA 4 
ROTEIRO 1
OBJETIVO: Reconhecer as estruturas fúngicas , hifas, conídeos e esporos 
PROCEDIMENTO : 
Solicitar ao técnico com pelo menos uma semana de antecedência que umedeça fatias de pão de forma e as mantenha dentro de sacos plásticos para embolorar com pelo menos uma semana de antecedência; ou solicitar aos alunos que tragam pão ou fruta embolorada para a aula 
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Fatia de Pão ou fruta com bolor 
	01 por grupo 
	Bisturi estéril para corte 
	01 por grupo
	Corante de Azul de Algodão- lactofenol 
	01 por bancada 
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Lâminas
	06 por grupo
	Lamínulas 
	06 por grupo
	Microscópios
	01 por grupo
	Alças bacteriológicas
	01 por grupo
Com o auxílio do bisturi retirar partes do material embolorado da fruta ou da fatia de pão, o mais fina possível
Depositar sobre uma lâmina de vidro
Cobrir com corante azul de algodão – lactofenol e prensar com o auxílio de uma lamínula 
Observar em microscópio nos aumentos de 10X e 40 X
Desenhar o que vc observou 
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	Instituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica 
Título da Aula: Fermentação Biológica 
	AULA 4 
ROTEIRO 2
OBJETIVO: Observar a evidência da atuação de leveduras sobre uma mistura de água com açúcar
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	
Tubos de Ensaio de 10 ml 
	
04 por grupo 
	
Bexiga pequena 
	
04 por grupo
	
Fermento em pó
	4 colheres de chá por grupo
	
Açúcar refinado comum 
	3 colheres de chá por grupo
	
Farinha de trigo comum (SEM FERMENTO) 
	3 colheres de chá por grupo
	
Água Morna 
	
Bancada 
	
Elástico ou Barbante para fixação das bexigas nos tubos de ensaio 
	
Qsp
PROCEDIMENTO : Cada Grupo deverá montar os seguintes sistemas, abaixo uma representação de como cada tubo deverá ser preparado 
Sistema 1 – 5 mL de água morna e 1 colher chá de fermento.
Sistema 2 – 5 mL de água morna e 1 colher chá de açúcar.
Sistema 3 – 5 mL de água morna, 1 colher chá de fermento e 1 colher chá de açúcar.
Sistema 4 – 5 mL de água morna, 1 colher chá de fermento e 1 colher chá defarinha de trigo.
Fonte: https://labecologiaanimal.wixsite.com/labecologiaanimal/paisagens
Cada grupo deverá depois discutir os resultados observados com o docente.
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança
	nstituto de Ciências da Saúde
	Curso: BIOMEDICINA
Disciplina: Microbiologia e Micologia Básica
Titulo da Aula: Coloração de Gram (BACILOS GRAM NEGATIVOS e LEVEDURAS )
	AULA 4
ROTEIRO 3
OBJETIVO: A avaliação da morfologia microbiana é muito importante para a execução da maior parte dos exames microbiológicos. A coloração de Gram também deve ser revisada dada sua grande importância no diagnóstico clínico das amostras microbiológicas.
TÉCNICA COLORAÇÃO DE GRAM
Realizar o procedimento duas vezes fazendo uma lâmina a partir da cultura de bactéria e outra do tubo contendo fermento da aula de fermentação biológica 
1) Em uma lâmina pingar uma gota de solução salina estéril.
2) Recolher uma colônia pré-cultivada com alça bacteriológica. E /ou 1 gota compipeta pasteur do tubo com fermento biológico 
3) Colocar a colônia selecionada junto à lâmina e homogenizar.
4) Fixar o esfregaço no calor.
5) Cobrir o esfregaço com cristal de violeta por 1 minuto.
6) Lavar o esfregaço com água corrente removendo o excesso de corante.
7) Cobrir o esfregaço com lugol por 1 minuto
8) Repetir passo 6.
9) Descorar com álcool acetona até remover o excesso de corante.
10) Repetir passo 6
11) Cobrir o esfregaço com Fucsina por 30 segundos.
12) Lavar e secar
13) Examinar ao microscópio (1000x)
	MATERIAIS
	QUANTIDADE
	Solução salina
	10 mL (por grupo)
	Corantes para a coloração de Gram
	01 por bancada
	Placas pré cultivadas com Escheríchia coli 
	01 por grupo
	1 dos tubos de ensaio contendo fermento da aula de Fermentação biológica 
	01 por grupo 
	Óleo de imersão 
	01 por grupo
	Pipeta pasteur 
	02 por grupo
	EQUIPAMENTOS
	QUANTIDADE
	Lâminas
	05 por grupo
	Microscópios
	01 por grupo
	Alças bacteriológicas
	01 por grupo
	Estufa 37°C
	01
Atenção todas as práticas da presente disciplina devem ser executadas seguindo as boas práticas em microbiologia no que diz respeito à manipulação e descarte de microrganismos.
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de Segurança: