Relatório final para a disciplina de Planejamento Experimental e Análise de Dados em Ciências Biomédicas (ICB5773)

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO 
 
 
 
 
 
 
Relatório final para a disciplina de Planejamento Experimental 
e Análise de Dados em Ciências Biomédicas (ICB5773) 
 
 
 
 
Mairon Oliveira de Lima 
Docente: Marcus Vinicius Chrysostomo Baldo 
 
 
 
 
 
 
 
São Paulo 
2023 
PERGUNTA DO PROJETO 
 O projeto em questão, desenvolvido no Laboratório de Farmacologia 
Comportamental do Departamento de Farmacologia do Instituto de Ciências 
Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB/USP), tem como principal 
propósito verificar se mudanças no ambiente podem afetar a reversão da 
sensibilização comportamental em camundongos tratados com etanol durante 
15 dias (D1-D15), o que contribuiria para o aprimoramento dos modelos animais 
de transtorno por uso de substâncias. A hipótese principal, nessa situação, é que 
o fator ambiental – mais especificamente, a presença de uma roda para atividade 
física voluntária ou de brinquedos na caixa durante o período de extinção do 
comportamento (D16-D22) – seria capaz de reverter a sensibilização 
comportamental induzida pelo etanol. 
 Uma explicação para a reversão da sensibilização comportamental 
baseia-se na proposição de que animais em ambiente enriquecido, seja com 
brinquedos ou com a roda para atividade física, estariam protegidos do efeito 
estressor causado pelo desafio com etanol no D22. Por esse motivo, uma 
hipótese secundária do projeto é que o nível de corticosterona plasmática nos 
grupos nos quais foi possível reverter a sensibilização comportamental seria 
diferente. Além disso, propõe-se que essa mudança não seja causada por uma 
indução ou inibição da enzima álcool desidrogenase – responsável pela 
biotransformação do etanol em acetaldeído – durante o período de 15 dias de 
tratamento com etanol. Dessa forma, outra hipótese secundária é de que não 
haveria diferença na concentração plasmática de etanol entre os animais que 
foram tratados com etanol por 15 dias e os animais-controle que apenas 
receberam etanol no D22. 
 
NATUREZA DO PROJETO 
 O projeto tem caráter confirmatório, uma vez que se parte de uma 
predição a priori com o intuito de verificá-la por meio de um teste de hipóteses 
estatístico previamente concebido. Isso se observa tanto para a hipótese 
principal – em que se propõe haver uma diferença na reversão da sensibilização 
comportamental com base no ambiente no qual o camundongo foi mantido – 
quanto para as duas hipóteses secundárias, pois espera-se que a concentração 
plasmática de corticosterona esteja relacionada à reversão da sensibilização 
comportamental e, por outro lado, que a concentração plasmática de etanol não 
esteja relacionada à reversão. 
 
CARACTERIZAÇÃO DO PROJETO 
 O estudo aqui descrito é experimental, pois são utilizadas diferentes 
intervenções no ambiente para verificar relações causais entre as variáveis 
mencionadas anteriormente. Por outro lado, o experimento do estudo não pode 
ser considerado experimental verdadeiro, pois, apesar de haver grupos-controle 
respectivos a cada um dos níveis, o processo de randomização do tratamento 
(salina ou etanol entre D1-D15) não envolve cada um dos camundongos, mas 
apenas os grupos nos quais os animais foram separados no biotério de criação 
durante o desmame. Isso ocorre pois o processo de reagrupamento dos 
camundongos resulta-lhes estressante, o que aumenta a agressividade dos 
animais e, por consequência, enviesaria o fenômeno de sensibilização 
comportamental, uma vez que este é fortemente influenciado pelo estresse 
sofrido pelo animal. Assim, embora o tratamento ao qual cada grupo em uma 
caixa será submetido seja atribuído aleatoriamente, não há randomização dos 
animais que pertencerão a uma caixa, o que é definido previamente durante o 
processo de desmame. 
 
POPULAÇÃO-ALVO E UNIDADES 
 A população-alvo do projeto são camundongos da linhagem Swiss-
Webster com 70 dias de idade. A unidade observacional aqui poderia ser 
considerada os próprios camundongos, uma vez que são eles quem definem o 
tamanho da amostra. No entanto, o mais correto é, nessa situação, considerar a 
caixa-moradia como a unidade experimental, pois o processo de randomização 
do tratamento em cada caixa foi feito sem que os animais tivessem sido 
distribuídos aleatoriamente. 
 Para a hipótese inicial, a unidade observacional são os próprios 
camundongos, pois o fenômeno de sensibilização é descrito pelo 
comportamento do animal. Por outro lado, as duas hipóteses secundárias têm 
como unidade observacional o plasma separado do sangue dos animais, no qual 
são mensuradas as concentrações de corticosterona e etanol. 
 Os procedimentos experimentais utilizados estão em conformidade com 
preceitos estritamente éticos, tendo sido previamente aprovados pela Comissão 
de Ética no Uso dos Animais (CEUA) do ICB/USP (Nº 6543161221), um órgão 
que visa fazer cumprir os procedimentos éticos no uso científico de animais 
dispostos na Lei Federal 11.794 e na Lei Estadual 11.977. 
 
VARIÁVEIS DEPENDENTES E ESCALAS DE MEDIDA 
 Para a confirmação da hipótese principal, a variável dependente de 
interesse é a locomoção em centímetros durante o teste de campo aberto, uma 
variável quantitativa contínua com escala em razão. 
 Com respeito às hipóteses secundárias, as concentrações plasmáticas de 
corticosterona e etanol, respectivamente, serão dadas em pg/mL e mg/dL, sendo 
ambas variáveis quantitativas contínuas com escala em razão. 
 
ANÁLISE DESCRITIVA DOS DADOS 
 Com base em resultados prévios publicados na literatura, as três variáveis 
de interesse costumam se distribuir de acordo com uma normal. Dessa forma, a 
medida de tendência central escolhida é a média (que nessa situação deve ser 
igual à mediana e à moda), enquanto a medida de dispersão escolhida é o 
desvio-padrão. 
 Como recurso gráfico para a análise descritiva, opta-se pelo gráfico de 
barras, onde a altura da barra corresponde à média de cada grupo experimental, 
com uma linha na extremidade para representar o desvio-padrão. 
 
DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 
 Tanto para a hipótese principal quanto para as secundárias, os fatores 
correspondem ao ambiente no qual o animal ficará no período de extinção (caixa-
padrão, caixa grande com brinquedos, caixa grande com roda ativa) e ao 
tratamento que o animal recebe durante o período de indução (etanol 1,8 mg/kg 
por via intraperitoneal, salina isovolumétrica por via intraperitoneal). 
 
ANÁLISE ESTATÍSTICA INFERENCIAL 
 Resultados prévios da literatura mostram que, para as variáveis de 
interesse, as medidas são normalmente distribuídas e possuem variância 
semelhante entre os grupos, sendo conveniente que se utilize ANOVA de dois 
fatores nessa situação. No entanto, na situação em que os dados possuam 
assimetria positiva ou negativa, poder-se-ia utilizar um método de transformação 
de dados seguido do método paramétrico citado. A transformação dos dados em 
postos para a realização do teste de Kruskal-Wallis poderia ser uma alternativa 
na situação em que demais transformações não resultarem em uma distribuição 
normal. No entanto, esse procedimento deve ser conduzido antes de se realizar 
os testes em si, caso contrário a prática caracterizaria um exemplo de p-hacking. 
Para a ANOVA de duas vias, na hipótese nula do teste em questão 
assume-se que não há diferença significativa entre as médias para nenhum dos 
fatores e que não há interação entre os fatores. O nível de significância adotado 
é α = 0,05, por ser o valor usual em estudos desse gênero. O teste é unicaudal, 
uma vez que a ANOVA utiliza o teste F para verificar se a variância entre as 
médias do grupo é maior que a das observações dentro dos grupos. Como na 
ANOVA é apenas possível dizer que há diferença entre um dos grupos, é 
necessário utilizar um teste post-hoc para comparar os grupos dois a dois. Nessa 
situação, pode-se utilizar o teste de Tukey, o que minimiza os erros de tipo I 
devidoao grande número de comparações entre grupos. 
Uma vez que se optou pela ANOVA como teste de hipóteses, é necessário 
verificar tanto a normalidade dos dados quanto a homogeneidade das variâncias. 
Para isso, empregam-se os testes de Shapiro-Wilk e Levene, respectivamente. 
 O processo de coleta dos dados e análise estatística no projeto possui 
pouca influência de vieses inconscientes do experimentador. A estimativa da 
locomoção é feita por um software de análise automatizada de vídeo, que calcula 
a distância percorrida na filmagem com base em uma referência de tamanho 
estabelecida no vídeo. Para a estimativa das concentrações de corticosterona e 
etanol, são feitos testes colorimétricos com anticorpos e enzimas, 
respectivamente, cujos resultados são processados por um espectrofotômetro. 
Assim, seria necessário que o pesquisador agisse de má-fé para que sua 
influência fosse significativa nos resultados, seja por manipulação dos dados ou 
por modificação não justificável das análises estatísticas empregadas. 
 A exclusão de um outlier seria feita apenas na situação em que houver 
segurança de que se trata de um erro de coleta, pois, como o aspecto ético 
requer que o tamanho da amostra seja tão pequeno quanto possível, a exclusão 
descriteriosa de animais levaria a uma perda significativa da confiabilidade dos 
resultados. 
 
AMOSTRA EXPERIMENTAL 
 A amostra experimental tem como origem o Biotério de Criação de 
Camundongos do Departamento de Farmacologia do ICB/USP. Após o 
desmame, os animais são alocados em caixas com 4 a 5 indivíduos pelo 
bioterista responsável. Antes do início do experimento, sorteia-se qual 
tratamento cada caixa irá receber durante o período de indução (D1-D15) e qual 
será o ambiente durante o período de extinção. Conforme mencionado 
anteriormente, os animais não são distribuídos aleatoriamente durante a escolha 
do tratamento, pois agrupar animais de caixas diferentes geraria um estresse 
que poderia afetar a reversão da sensibilização e, por consequência, aumentar 
os erros do tipo II. Ademais, como são todos animais de uma mesma linhagem 
originados de um mesmo biotério e criados em condições padronizadas, 
assume-se que a variância entre os indivíduos esteja bem-controlada. 
 O tamanho das amostras baseia-se no número de indivíduos 
normalmente utilizados em experimentos do próprio grupo e em estudos 
relatados em artigos publicados em revistas indexadas. Por tratar-se de um 
protocolo experimental comumente empregado em estudos farmacológicos 
sobre transtorno por uso de substâncias, não é necessário um estudo-piloto para 
a estimação do tamanho amostral. Pelo software G*Power 3.1.9.7, utilizando-se 
α = 0,05, 1 – β = 0,8 e f = 0,25, o tamanho da amostra total foi 158, o que daria 
aproximadamente 26 animais por grupo. Este tamanho, no entanto, certamente 
não seria aprovado pela CEUA, por ser quase 2 vezes maior que o número de 
animais comumente utilizado em experimentos comportamentais. 
 
RESULTADOS NEGATIVOS 
 Ainda que haja resultados que não estejam de acordo com a hipótese 
principal por não terem alcançado significância estatística, estes ainda devem 
ser publicados, uma vez que o contrário seria um exemplo de cherry-picking, 
levando ao problema de viés de publicação. 
 
FINALIZAÇÃO DA COLETA DE DADOS 
 Idealmente, não se deveria realizar uma análise interina para verificar se 
a significância estatística já foi validada ou não, o que também trata-se de um 
caso de p-hacking. Conforme mencionado anteriormente, na situação em que 
não se encontrou resultado significativo com o tamanho de amostra previamente 
estabelecido, o procedimento correto seria submeter os dados para publicação 
ainda assim. 
 
GERAÇÃO DE HIPÓTESES 
 Por se tratar de um estudo confirmatório, não é indicado que seu 
delineamento experimental seja alterado no curso do experimento, o que poderia 
caracterizar a prática de HARKing, levando ao aumento de erros do tipo I, 
diminuindo a refutabilidade do estudo e aumentando a taxa de falsas 
descobertas. Assim, hipóteses que surgirem durante o experimento deverão ser 
tratadas em um estudo posterior.