Tema 4 - Sequenciamento, clonagem e técnicas de hibridização

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02/03/2023, 21:15 Sequenciamento, clonagem e técnicas de hibridização
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Sequenciamento,
clonagem e técnicas
de hibridização
Prof.ª Camila Freze Baez
Descrição
Introdução aos métodos de sequenciamento de material genético, tecnologia do DNA recombinante e técnicas de hibridização de ácidos nucleicos.
Propósito
Compreender as metodologias de estudo e análise da sequência de DNA, uma ação importante para entender a sua manipulação para fins de
biotecnologia, bioinformática, diagnóstico e outras aplicações, como pesquisa.
Objetivos
Módulo 1
Principais métodos de sequenciamento do DNA
Distinguir as características dos principais métodos de sequenciamento do DNA.
Módulo 2
Principais técnicas de clonagem molecular
Reconhecer as principais técnicas de clonagem molecular, suas formas de uso e suas vantagens e desvantagens.
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Módulo 3
Métodos de hibridização de ácidos nucleicos e aplicações
Identificar os métodos de hibridização de ácidos nucleicos, suas diferenças e aplicações na rotina do biologista molecular.
Introdução
As características hereditárias são passadas de geração em geração através do material genético codificado em nosso DNA. Existe um grande
interesse em conhecermos a fundo o nosso DNA, que tem sido alvo de estudos cada vez maiores e mais profundos desde sua descoberta, na
década de 1950.
O conhecimento do DNA humano e de outros organismos trouxe consigo múltiplas aplicações, que vão do conhecimento em si ao entendimento de
doenças genéticas, estudo comparativo entre espécies, ferramentas em biotecnologia e bioinformática, e discussões éticas. Tudo isso foi possível
graças às técnicas em biologia molecular que precederam e inspiraram o desenvolvimento do sequenciamento, como as técnicas de restrição
enzimática, de clonagem molecular e de hibridização. Atualmente, elas são protagonistas e trabalham em conjunto para o avanço da ciência, da
biotecnologia e da saúde humana e animal.
1 - Principais métodos de sequenciamento do DNA
Ao �nal deste módulo, você será capaz de distinguir as características dos principais métodos de
sequenciamento do DNA.
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Princípios do sequenciamento
A quantidade de conhecimento que temos sobre o genoma humano e de outras espécies aumentou extraordinariamente a partir do
desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento do DNA. A maior iniciativa para sequenciamento de genomas foi o Projeto Genoma Humano,
que gerou uma quantidade de informação gigantesca. Atualmente, sabemos que o genoma humano tem mais de 3 bilhões de pares de bases e que
99,9% da população humana compartilha o mesmo DNA. Ainda assim, não sabemos a função de aproximadamente metade dos genes descobertos.
A informação genética está contida no DNA (ácido desoxirribonucleico), uma longa molécula que é formada por nucleotídeos. Para entendermos
como as técnicas a serem exploradas neste conteúdo funcionam, precisamos relembrar alguns conceitos-chave do DNA e da biologia molecular.
DNA: construção complexa
O primeiro deles é a ideia de que o DNA é uma construção complexa, como uma casa luxuosa. Por mais luxuosas que sejam, as casas são feitas de
tijolos, que são as unidades mínimas na nossa metáfora. No DNA, as unidades básicas são os nucleotídeos. Cada nucleotídeo tem três regiões
principais, veja:
Observe os detalhes na imagem a seguir:
Os nucleotídeos.
As bases nitrogenadas são a principal diferença entre os nucleotídeos de DNA e são as responsáveis por codificar a informação genética. Afinal,
precisamos ter pelo menos algumas letras diferentes para codificarmos uma informação no texto complexo que é o nosso genoma. Em uma fita
dupla de DNA, as bases nitrogenadas estão livres e pareiam entre si − purinas (A e G) com pirimidinas (T e C) −, graças ao que chamamos de
complementariedade das fitas de DNA. Isso garante que a informação genética seja estável e permite a replicação (ou duplicação) do DNA com o
mínimo de erros possível.
Um açúcar chamado de desoxirribose (por não conter oxigênio no segundo carbono da ribose). No terceiro carbono da desoxirribose,
temos um álcool orgânico (grupamento hidroxila) importante para a replicação.
No quinto carbono da ribose, temos um grupamento fosfato.
No primeiro carbono da ribose, temos uma base nitrogenada (Adenina, Timina, Citosina, Guanina - A, T, C, G).
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Veja abaixo o esquema mostrando a estrutura do DNA e pareamento das bases por complementariedade. Note as pontes de hidrogênio duplas
(seta azul) entre Adenina e Timina, e triplas (seta preta) entre Citosina e Guanina.
Pareamento das bases nitrogenadas.
Essa junção do nucleotídeo é feita a partir da energia presente no grupamento trifosfato no quinto carbono do nucleotídeo livre e a hidroxila livre do
terceiro carbono da desoxirribose do nucleotídeo que já faz parte da fita em síntese. Essa ligação é chamada de fosfodiéster e é uma ligação
covalente, ou seja, forte e difícil de ser quebrada. Agora que sabemos esses aspectos do DNA e de sua replicação, podemos conhecer as técnicas
para identificação dos nucleotídeos que os formam.
Replicação do DNA
O segundo conceito que precisamos revisar é o da replicação do DNA. A DNA-polimerase é uma enzima capaz de sintetizar uma nova fita de DNA a
partir de um DNA molde. Suas principais funções são reconhecer o nucleotídeo lido na fita molde, pareá-lo com seu nucleotídeo complementar e
fazer a junção desse segundo nucleotídeo à fita que está sendo sintetizada.
Sequenciamento Sanger original
Uma das primeiras técnicas de sequenciamento de DNA a ganhar grande espaço no mundo científico foi desenvolvida na década de 1970 pelo
cientista Frederick Sanger e, até os dias atuais, o chamado Sequenciamento Sanger é uma das técnicas mais robustas e precisas em uso.
Nesse método, Sanger e seus colegas usaram nucleotídeos especiais, com duas grandes diferenças dos nucleotídeos normais que encontramos
nas células: os nucleotídeos que Sanger usava eram marcados com radioisótopos, de forma que eles pudessem identificar qual base nitrogenada
foi adicionada; já as desoxirriboses foram modificadas pela retirada da hidroxila no terceiro carbono, o que impede a adição de nucleotídeos novos
pela polimerase. Por isso, o Sequenciamento Sanger leva o nome oficial de terminação de cadeia, ou dideoxy (pela falta de duas (di-) hidroxilas, no
segundo e terceiro carbonos da ribose – os ddNTP).
Material genético e sequência de nucleotídeos de diversos indivíduos.
Radioisótopos
São átomos que emitem radioatividade detectável por aparelhos especializados.
Veja os detalhes na imagem a seguir:
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Representação esquemática de um Didesoxinucleotideo (ddNTP), sem um OH no carbono 3 (cinza) e um desoxinucleotídeo (dNTP).
Em um Sequenciamento Sanger, precisamos amplificar o DNA-alvo a ser sequenciado. Normalmente, usamos um produto de PCR (reação em
cadeia da polimerase) como amostra, pois precisamos de grande quantidade de DNA-alvo. Mesmo assim, o Sequenciamento Sanger exige uma
reação de amplificação independente e, por isso, é classificado como um sequenciamento por síntese – SpS.
A amplificação feita no Sequenciamento Sanger original contava com uma DNA-polimerase e seu tampão,
iniciadores (oligonucleotídeos curtos que se ligam especificamente ao DNA-alvo a ser amplificado),
desoxirribonucleotídeos trifosfato (dNTPs) e ddNTPs.
Como a marcação radioativa era a mesma para cada nucleotídeo,a identificação de qual ddNTP havia sido adicionado se dava pela separação
física, em tubos diferentes, dos ddNTPs marcados. Assim, o Sanger original tinha quatro tubos diferentes, cada um contendo polimerase,
iniciadores, tampão, os 4 nucleotídeos (dNTPs) e um didesoxinucleotídeos (ddNTP), marcado com radioatividade.
Exemplo
Em um dos quatro tubos, tínhamos dATP (desoxirribonucleotídeo trifosfato de adenina), dCTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato de citosina), dTTP
(desoxirribonucleotídeo trifosfato de timina) e dGTP (desoxirribonucleotídeo trifosfato de guanina) e um didesoxirribonucleotideo trifosfatado de
guanina (ddGTP) marcado com radioisótopo; nos outros, estavam presentes os mesmos dNTPS e em cada um ddNTP diferentes (adenina, tirosina e
citosina).
A cada ciclo de amplificação, os dNTPs são adicionados até que o ddNTP marcado com radioisótopo seja adicionado, o que faz com que a adição
de nucleotídeos à fita nova seja parada apenas para aquela fita. As outras fitas que estão sendo sintetizadas na mesma reação continuam sendo
sintetizadas até que o ddNTP seja adicionado. Dessa forma, temos sequências de DNA de diferentes tamanhos, todas terminando em um ddNTP
marcado com radioisótopo. Assim, sabemos qual ddNTP terminou a cadeia, pois eles estão em tubos separados!
Da mesma forma que revelamos o resultado de uma PCR convencional separando o produto amplificado em um gel de agarose através da
eletroforese e corando-o com um agente intercalante de DNA que seja fluorescente, a revelação do Sequenciamento Sanger também se baseava na
separação por eletroforese e revelação.
Quando o gel de agarose polimeriza, forma uma malha frouxa, que não é estreita o suficiente para separar sequências com diferenças de até um
único nucleotídeo (ou ddNTP, no caso do Sequenciamento Sanger) que precisamos detectar. Então, usamos outro tipo de gel, ou polímero: a
poliacrilamida, feita a partir da polimerização da acrilamida/bisacrilamida, que nos dará uma malha muito mais intricada (forma poros regulares e
de tamanho uniforme) e capaz de distinguir pequenas diferenças no tamanho do DNA.
Preparo de gel de agarase.
Cada um dos quatro tubos de sequenciamento diferentes, contendo os ddNTPs marcados, usará um poço no gel de poliacrilamida para sua
resolução. Esperamos que, em cada tubo, os ddNTPs tenham sido usados mais de uma vez. Então, desejamos ver múltiplas bandas em cada uma
das linhas do gel correspondentes a cada ddNTP utilizado.
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Sequenciamento Sanger manual e imagem real do sequenciamento.
Além disso, como a intenção do gel é a separação dos produtos por tamanho quando submetidas a uma corrente elétrica, as moléculas de DNA
menores migram mais rapidamente pelo gel e, por isso, estão localizadas mais abaixo do que as moléculas maiores. Finalmente, a revelação é feita
através da emissão de radioatividade, que ficava impressa em um filme de raios X, e, em seguida, a sequência é montada a partir dos tamanhos de
DNA obtidos. Na imagem apresentada, vemos que cada ddNTP marcado com radioisótopos foi colocado em tubos separados e, após eletroforese
em gel de poliacrilamida, foram obtidos diferentes tamanhos de DNA.
Após revelação, conforme se observe na imagem apresentada anteriormente, a sequência é montada de forma manual a partir desses tamanhos.
Automação do Sequenciamento Sanger
A técnica original de sequenciamento Sanger era bastante trabalhosa e exigia um nível de complexidade muito grande. Além de serem quatro tubos,
os ddNTPs radioativos precisavam ser manipulados em ambiente controlado por oferecerem risco à saúde dos trabalhadores, e tudo era feito
manualmente, inclusive a interpretação do gel de poliacrilamida para determinação da sequência. Isso trazia imensas limitações ao uso do
sequenciamento. Por isso, os pesquisadores automatizaram o sequenciamento para reduzir custos, riscos e tempo de execução, além de, claro,
aumentar a precisão na determinação das bases em sequência.
Para que a automatização fosse bem-sucedida, entretanto, eles precisaram modificar algo crucial: o uso de radioisótopos. Por serem a maior
limitação da técnica, eles foram substituídos por fluoróforos. O uso deles na marcação dos ddNTPs concedeu outra grande vantagem: além de
serem mais seguros, podem ser utilizados vários fluoróforos que se excitam e emitem fluorescência em comprimentos de onda diferentes ao
mesmo tempo. Isso permite que vários fluoróforos sejam usados na mesma reação, abolindo o uso de quatro tubos.
Fluorófos
São pequenas moléculas que, quando excitadas em determinado comprimento de onda, emitem fluorescência que pode ser facilmente detectada.
Com cada ddNTP marcado com fluoróforo de cor diferente, o sequenciamento é mais seguro e mais barato, pois já
não precisamos lidar com a segurança extra contra a radioatividade e reduzimos a reação a um único tubo.
Com o uso de quatro fluoróforos, um para cada ddNTP e em um único tubo de amplificação, outra limitação ao uso do sequenciamento foi
superada: a forma de leitura.
Na automação
A leitura dos fragmentos com terminação em ddNTPs marcados com fluoróforos passou a ser feita por eletroforese em capilar, ou seja, em um tubo
extremamente fino contendo um polímero semelhante à poliacrilamida pela qual cada fragmento passa, um de cada vez. Veja como acontece o
processo:
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Observe a seguir:
Esquema do Sequenciamento Sanger automatizado.
Sequenciamento de Nova Geração (Next Generation Sequencing)
Enquanto a técnica de Sanger era aperfeiçoada e automatizada, outros esforços para sequenciamento de DNA apareceram. Durante essa época,
surgiu o pirosequenciamento, capaz de detectar a produção de um fosfato livre – ou pirofosfato –, decorrente da adição de um nucleotídeo.
O pirofosfato é produzido quando o trifosfato da extremidade 5’ de um nucleotídeo é clivado e dá energia à ligação fosfodiéster catalisada pela DNA
polimerase. Assim, o pirosequenciamento também é um sequenciamento por síntese (SpS), como o Sanger. Porém, dispensa o uso de ddNTPs
marcados com radioisótopos ou fluoróforos, assim como eletroforese em capilar. O pirofosfato é detectado ao ser convertido em ATP por uma
enzima (ATP sulfurilase). O ATP é, então, usado pela luciferase, uma segunda enzima que oxida a luciferina, um substrato em oxiluciferina, e, durante
essa transformação, ocorre a formação de luz, que pode assim ser quantificada.
No pirosequenciamento, cada dNTP é adicionado separadamente à reação, de forma que se saiba qual foi o nucleotídeo inserido que gerou luz. Os
nucleotídeos que não foram usados são degradados por uma terceira enzima, a apirase. O ciclo se repete com o próximo nucleotídeo. Veja:
Pirosequenciamento
À medida que cada fragmento passa pelo capilar, um laser incide sobre a sequência, e os ddNTPs marcados emitem fluorescências
em comprimentos de onda diferentes que são detectadas por um aparelho.
Os aparelhos mais modernos conseguem sequenciar cerca de 900 pares de base (pb) em uma cadeia, e possuem múltiplos capilares
para a leitura de dezenas de amostras diferentes.
O aparelho também processa e filtra a fluorescência de ruído (ou background) de cada ddNTP lido e nos fornece uma representação
gráfica da sequência e de sua qualidade.
A representação gráfica é o resultado que iremos analisar, e seu nome oficial é eletroferograma. Este consiste em picos coloridos, em
que a altura do pico representa a qualidade da leitura – picos mais altos possuem melhor qualidade e são mais confiáveis (ou seja, a
probabilidade de a fluorescência da detecção estar errada é muito pequena), e cada cor representa uma base nitrogenada diferente
detectada por fluorescências distintas.
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Também conhecido pelo nome comercial Roche 454.
Esquema das etapas da reação de pirosequenciamento.
A partir da imagem, observamos que o DNA genômico é clivado, ligado a adaptadores e imobilizado em microesferas (beads), nas quais acontecerá
a amplificação do DNA por PCR em emulsão (que vamos entender a seguir). No sequenciamento, vemos cada novo nucleotídeo adicionado pela
DNA polimerase e detectado pela emissão de luz decorrente da liberação de um pirofosfato.
Com a criação do pirosequenciamento, surgiu uma nova geração de sequenciamento (NGS – Next Generation Sequencing). Nessas metodologias,
usamos o conceito de formação de bibliotecas de DNA para o sequenciamento. Vamos entender como:
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Esse sistema permite a existência de milhares de microesferas, cada uma com uma sequência de DNA única, amplificada e sequenciada. Assim,
milhões de pares de base podem ser sequenciados muito mais rapidamente do que pelo método de Sanger.
As bibliotecas são formadas por meio da “quebra” do DNA extraído, seja por ele ter sido digerido em pequenos fragmentos usando
enzimas, seja por ter sido clivado usando métodos físicos, como a sonicação (é utilizada a energia de ondas sonoras para quebrar
macromoléculas – nesse caso, o DNA).
O DNA fragmentado é ligado a adaptadores, que são pequenas sequências sintéticas, conhecidas e exógenas (não pertencentes ao
DNA a ser sequenciado), usadas na identificação das amostras. Cada extremidade (5’ e 3’) do DNA fragmentado em uma biblioteca se
liga a um adaptador distinto, com sequências de DNA diferentes. O uso de adaptadores permitiu o sequenciamento de regiões do
DNA que não tínhamos conhecimento suficiente para desenharmos oligonucleotídeos iniciadores, e foi desenvolvido ainda na era
Sanger.
Os adaptadores imobilizam o fragmento de DNA e auxiliam o início da síntese, pois se ligam por complementariedade a
oligonucleotídeos iniciadores aderidos a microesferas, de forma que cada microesfera tenha apenas um fragmento de DNA ligado a
ela.
Cada microesfera será depositada em um micropoço (em um microchip), local onde ocorrerá uma PCR diferente, chamada de PCR em
emulsão ou em gotícula de óleo água (nessa emulsão de água, em uma fase oleosa, as gotículas de água contêm os reagentes de
PCR, uma fita de DNA a ser sequenciado e uma bead para sua ancoragem).
Assim, cada microesfera terá várias cópias idênticas do mesmo DNA. Isso é importante para amplificação do sinal emitido pelo
pirofosfato, que precisa ser suficiente para que nossos métodos de detecção disponíveis consigam captar esse sinal.
Em seguida, as fitas duplas ligadas à microesfera são desnaturadas em fitas simples, e estarão prontas para iniciarmos a reação de
sequenciamento.
Na etapa de sequenciamento, um único dNTP é adicionado por vez à reação. Assim, quando o dNTP complementar à sequência-
molde é adicionado pela polimerase, o pirofosfato liberado na formação da ligação fosfodiéster dá energia para a reação luminosa
ocorrer, que é, por sua vez, detectada por um sensor.
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O mesmo princípio de criação de bibliotecas de DNA com o uso de adaptadores, imobilização e sequenciamento por síntese foi aperfeiçoado e
modificado posteriormente. Um dos métodos mais famosos e mais usados é o sequenciamento Illumina/Solexa. Nessa técnica, a biblioteca de DNA
é ligada aos adaptadores. Vamos entender como isso é feito?

Os fragmentos de DNA são anelados a iniciadores aderidos a uma placa (chamada de célula de fluxo ou flowcell) por meio dos adaptadores, e a
síntese por ponte de DNA começa usando dNTPs normais.
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Na síntese por ponte, cada extremidade do DNA contém adaptadores diferentes capazes de se anelar aos primers complementares já aderidos à
placa.
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A DNA polimerase sintetiza todas as fitas complementares, formando agrupamentos (ou clusters, em inglês) de DNA idênticos, que são
desnaturados em fitas simples e usados como molde para a etapa do sequenciamento
Após formação da biblioteca de DNA ligada a adaptadores (rosa e verde), o DNA-alvo é fragmentado e ligado aos iniciadores aderidos na placa
através de complementariedade com os adaptadores, para que a amplificação por ponte aconteça. Veja a representação esquemática da
amplificação por ponte da técnica de sequenciamento Illumina/Solexa:
Esquema da amplificação pela técnica de sequenciamento Illumina/Solexa. Na imagem, os adaptadores estão em verde e rosa.
O sequenciamento em si é efeito de forma semelhante ao Sanger, em que didesoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados com fluoróforos são
adicionados à reação, causando a terminação da polimerização. No caso do sequenciamento Illumina, os nucleotídeos marcados com
fluorescência são terminadores reversíveis da polimerização, ou seja, após uma simples lavagem, o sequenciamento pode continuar com a
incorporação de novos nucleotídeos marcados com fluoróforos feita pela DNA polimerase.
A fluorescência de cada ciclo é obtida em diferentes comprimentos de onda para cada ddNTP e é detectada pelo aparelho sequenciador, que
decodifica o sinal. Cada corrida pode ter milhões de clusters diferentes, o que nos gera uma quantidade gigantesca de dados
Esquema do sequenciamento Illumina.
Talvez esta tenha sido a maior vantagem dos sequenciamentos de nova geração: a introdução de métodos de alto rendimento, o que significa um
sequenciamento de um número gigantesco de bases, de forma muito mais rápida do que o Sequenciamento Sanger.
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Contudo, as NGS possuem desvantagens, como perda de precisão quando as sequências são muito repetitivas em
um único nucleotídeo, pois é difícil para o aparelho saber quantas bases idênticas foram adicionadas em um ciclo
apenas, já que o pico de luz fica bem mais extenso ou mais longo. Nesses casos, podemos usar o Sequenciamento
Sanger, que é mais confiável para determinação de sequências repetitivas por também separar as moléculas de
DNA por tamanho.
Outra desvantagem do NGS é o tamanho máximo das sequências lidas: enquanto no Sequenciamento Sanger lemos cerca de 900 pb, nos primeiros
NGSs, as leituras eram bem mais curtas – inicialmente, apenas 30 a 40 bases eram lidas por fragmento.
Saiba mais
Atualmente, na terceira geração de NGS, existem equipamentos capazes de ler sequências maiores, de 200 a 300 pb. Novas tecnologias capazes de
sequenciar até 50 kbp em uma leitura contínua, assim como técnicas para sequenciamento em tempo real, também foram desenvolvidas e estão
constantemente sendo aprimoradas.
Toda essa capacidade de sequenciamento introduziu outra questão importante: como unir esses pequenos fragmentos e reconstituir a sequência
contínua original de milhões de pares de base, como as que existem nos organismos vivos?
Com o desenvolvimento tecnológico que permitiu os sequenciamentos de alto rendimento, vimos o desenvolvimento de softwares e algoritmos
especializados na resolução do quebra-cabeças gerado ao produzirmos centenas de milhões de sequências. Com o estudo da genômica e da
transcriptômica, um campo novo de intercessão entre biologia e informática cresceu muito: a bioinformática.
Transcriptômica
Estudo do total de genes que estão sendo transcritos em determinada célula, pela síntese da cDNA a partir do RNA mensageiro.
Sequenciamento de nova geração
Conheça um pouco sobre os métodos de NGS de terceira geração.

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?Questão 1
O sequenciamento do DNA permitiu grande quantidade de conhecimento sobre o genoma de diversas espécies. Sobre os métodos de
sequenciamento, é correto afirmar que
A
o método mais antigo, conhecido como pirosequenciamento, utiliza a liberação de um pirofosfato terminador de cadeia para
revelar qual nucleotídeo foi adicionado.
B
um dos métodos mais confiáveis de sequenciamento é o pirosequenciamento, pois consegue identificar regiões com
nucleotídeos repetitivos com alta resolução.
C
os Sequenciamentos de Nova Geração (NGS) não são tão confiáveis quanto o Sequenciamento Sanger, porém produzem
grande quantidade de informação em um intervalo de tempo muito curto.
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Parabéns! A alternativa C está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3EO%20Sequenciamento%20Sanger%20%C3%A9%20muito%20mais%20confi%C3%A1vel%20que%20a%20maioria%20dos%20NGS%2C%2
Parabéns! A alternativa D está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3EO%20Sequenciamento%20Sanger%20automatizado%20usa%20didesoxinucleot%C3%ADdeos%20marcados%20com%20fluor%C3%B3f
D
o sequenciamento Illumina e o pirosequenciamento não fornecem muita informação, pois sequenciam apenas algumas
dezenas de pares de base por corrida.
E
com a chegada de NGS, o Sequenciamento Sanger se tornou obsoleto e não tem mais utilidade para a maioria das aplicações
em ciência, saúde e biotecnologia.
Questão 2
O Sequenciamento Sanger foi um grande avanço tecnológico dentro das análises moleculares e até hoje tem sido aplicado em muitos
trabalhos. Sobre este método, é correto afirmar que
A utiliza a terminação da cadeia em ribonucleotídeos marcados com radioisótopos, o que limita a aplicação do método.
B utiliza didesoxirribonucleotídeos marcados com fluoróforos, que são identificados ao longo da cadeia durante a síntese.
C
parte do princípio de separação das moléculas de DNA em gel de agarose e revelação dos nucleotídeos por emissão de luz
ultravioleta.
D
foi automatizado, de forma que a terminação da cadeia por nucleotídeos modificados e marcados possa ser identificada
mais rapidamente.
E depende da leitura de lasers, que excitam os radioisótopos a emitirem radiotividade no comprimento de onda a ser detectado.
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2 - Principais técnicas de clonagem molecular
Ao �nal deste módulo, você será capaz de reconhecer as principais técnicas de clonagem molecular,
suas formas de uso e suas vantagens e desvantagens.
Tecnologia do DNA recombinante
A tecnologia do DNA recombinante é uma ferramenta com grande aplicação em biotecnologia. É usada para transferir uma informação genética de
um organismo para outro, pela união de duas fitas de DNA de origens diferentes e sua inserção em um organismo hospedeiro. Veja:
A tecnologia do DNA recombinante consiste na união de duas fitas de DNA.
Também é conhecido como clonagem molecular, pois nesse processo temos a expansão de organismos hospedeiros idênticos geneticamente,
ou clones, todos contendo o DNA recombinante. Com o uso da tecnologia do DNA recombinante, conseguimos produzir proteínas humanas em
larga escala, para terapia, diagnóstico e até prevenção de doenças.
Exemplo
A clonagem molecular permite: que bactérias sintetizem insulina humana, usada no tratamento de diabetes mellitus tipo I; usar genes inseridos em
plasmídeos como forma de amplificarmos o gene e usá-los como curva de quantificação em uma qPCR; fabricar vacinas contra o papilomavírus
humano (HPV) usando apenas a proteína externa do vírus produzida em levedura.
Além disso, podemos alterar geneticamente organismos complexos, como plantas e animais, ao introduzirmos genes de outras origens –
os transgenes, gerando os organismos transgênicos – ou modificando genes que já existem em determinado organismo. Criamos, assim, os
chamados organismos modificados geneticamente (GMO, genetically modified organisms). Entretanto, com essa capacidade, vieram muito
questionamentos éticos sobre o que podemos e devemos modificar nos organismos.
Para dominarmos essa poderosa ferramenta, precisamos conhecer alguns pontos-chave sobre a informação que queremos transferir, sobre as
formas de transferência e sobre o sistema para onde estamos transferindo a informação genética.
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A informação que queremos transferir, nesse caso, é uma sequência de DNA de interesse, que pode ser tanto um
gene, uma região regulatória, ou pequenas sequências que determinam epítopos antigênicos (regiões que causam
uma resposta imunológica que podemos detectar) que não serão expressos, que chamamos de inserto. A forma de
transferência dessa sequência é o que chamamos de vetor.
Assim como uma encomenda precisa ser transportada por caminhão, moto, navio ou avião para chegar até seu destino, a sequência genética
precisa de uma forma de transporte até o organismo-alvo. O sistema de utilização é o nosso organismo final, que apresente a capacidade de
expressar determinado gene ou seja modificado geneticamente, o qual chamamos de hospedeiro. Veja:
Esquema das partes essenciais da clonagem molecular: sequência de interesse (ou inserto), vetor (plasmídeo) e hospedeiro (bactéria).
Vamos conhecer cada etapa da clonagem molecular passo a passo.
Isolamento do fragmento de interesse
O primeiro passo para clonagem molecular é a identificação do gene ou da sequência de DNA que queremos clonar, que, como já aprendemos, é
chamada de inserto.
Para isso, podemos partir de uma sequência já conhecida. Nas últimas duas décadas, uma quantidade gigantesca de informação genética foi
produzida, e existem diversas ferramentas de informática disponíveis na internet para conhecermos a sequência exata de genes e regiões não
codificantes de diversos organismos. A maior plataforma pública e gratuita que armazena sequências de DNA (e cDNA, caso estejamos
interessados em RNA) e mais conhecida é o GenBank (ou banco de genes, em tradução livre), do Instituto Nacional de Saúde dos Estados Unidos da
América (NIH – National Health Institute). Mas cuidado:

Caso seu gene de interesse não esteja entre as sequências armazenadas e disponíveis ao público, você poderá sequenciar a região. Nesse caso,
basta amplificarmos a sequência ou a região próxima que a flanqueie (ou seja, as regiões que estão antes e depois de determinada sequência) por
PCR. Após a amplificação, iremos separar as sequências obtidas na PCR por eletroforese em gel de agarose e observar se existem vários produtos
ou apenas um.

Caso tenhamos apenas um produto, podemos purificar a PCR e extrair apenas o DNA amplificado – ou seja, remover todo tampão, enzima Taq e os
iniciadores, que poderiam interferir no sequenciamento. Caso mais de uma banda esteja visível no gel de agarose, precisaremos cortar a banda de
tamanho desejado e purificá-la a partir do gel. Assim, eliminamos produtos de PCR inespecíficos e impedimos que eles influenciem nosso
Sequenciamento Sanger, o que será feito a seguir.
Mas o que fazer caso não haja informação suficiente sobre o organismo estudado sequer para desenhar iniciadores para a PCR? Nesse caso, pode-
se usar novas tecnologias de sequenciamento, conhecidas como sequenciamento de nova geração, que usam adaptadores para amplificar o
genoma. Uma vez que tenhamos nosso inserto amplificado e sua sequência conhecida, podemos colocá-lo (ou inseri-lo) no nosso vetor.
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Escolha do vetor e estratégia de inserção
Uma vez determinadacom exatidão a composição da sequência, precisamos observar seu tamanho. Assim como usamos meios de transporte
diversos para diferentes tamanhos de encomendas, precisamos escolher qual o melhor vetor para transportar a sequência.
Os vetores são pequenos DNAs autorreplicantes e circulares que conseguem ser transferidos para dentro das células. Existem diversos tipos de
vetores, baseados em seu tamanho total, no tamanho da sequência de DNA recombinante que pode transportar e organismos em que podem ser
usados.
Os vetores mais conhecidos são os plasmídeos, que são pequenos DNAs circulares autorreplicantes, de origem bacteriana, que podem ser
transportados para dentro e para fora da célula. Eles ocorrem na natureza e acredita-se que sejam originados de restos de genomas bacterianos que
mantêm todos os elementos necessários à sua própria replicação e que foram absorvidos por outra bactéria. Assim, os plasmídeos são
considerados elementos genéticos móveis, ou seja, eles podem ser transferidos (ou transportados) de uma célula a outra, ou adquiridos a partir do
ambiente.
Bactéria da peste Yersinia pestis, mostrando estrutura da célula com DNA, plasmídeos e ribossomos.
Normalmente, as bactérias conseguem sobreviver sem plasmídeos – por isso, são considerados como extracromossomais –, mas, por vezes, a
informação codificada neles oferece vantagem em ambientes seletivos.
Exemplo
Um plasmídeo pode ter uma sequência de DNA que codifique uma proteína de canal, que, por sua vez, confere resistência a certo antibiótico. Ao
entrar em uma célula que esteja sob pressão seletiva pelo tal antibiótico – ou seja, uma célula que esteja lutando para sobreviver ao antibiótico –, a
aquisição desse plasmídeo conferirá resistência, e a bactéria poderá sobreviver facilmente.
Como comentamos anteriormente, os plasmídeos são autônomos em sua replicação e, por isso, precisam ter determinados elementos que
permitam sua duplicação e expressão independentemente do momento em que a célula se encontre. Um plasmídeo criado em laboratório com o
mínimo de informação necessária para ser funcional contém três regiões:
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Observe a imagem do plasmídeo a seguir:
Representação esquemática de um vetor comum, o plasmídeo.
Lembre-se de que essas são as regiões mínimas à replicação em uma bactéria e que seu organismo hospedeiro pode ser um eucarioto (leveduras,
células animais e vegetais), que pode requerer outras regiões para replicação do plasmídeo e sua expressão.
Exemplo
Devemos sempre priorizar o uso de promotores gênicos derivados de leveduras, caso nosso sistema hospedeiro seja a levedura, e de usar
promotores e potenciadores preferencialmente virais para células de mamífero, em adição à origem de replicação e um marcador de seleção de
eucariotos.
Os plasmídeos são amplamente usados em biotecnologia e em clonagem molecular, por serem resistentes ao ambiente, facilmente inseridos dentro
de células procarióticas (bactérias) e eucarióticas (como leveduras, células animais e vegetais) e de fácil manipulação. Os plasmídeos podem ter
tamanho total entre alguns milhares a dezenas de milhares de pares de base e podem conter insertos de tamanhos variados, desde que o tamanho
total do plasmídeo permaneça inferior a 10 mil pares de base (10 kb), muito embora alguns plasmídeos permitam insertos de até 15 kb.
Existem situações em que pode ser necessário usar insertos maiores, e, nesses casos, outros sistemas podem ser usados. Por exemplo, o sistema
de cosmídeos permite insertos de até 50 kb, pois sua composição genética é uma mistura entre plasmídeos e bacteriófagos. Entretanto, cosmídeos
exigem que seu genoma seja empacotado, ou seja, que uma camada de proteína chamada capsídeo viral recubra o DNA do cosmídeo, para protegê-
lo e para que haja infecção de novas células. Outras opções são os cromossomos artificiais bacterianos (Bacterial Artificial Chromosome – BAC) ou
de levedura (Yeast Artificial Chromosome – YAC), para insertos de tamanho superior a 100 kb.
Bacteriófagos
São vírus capazes de infectar bactérias, injetando o material genético viral através da parede celular até o citoplasma da bactéria.
A origem de replicação, que a DNA-polimerase da sua célula-hospedeira bacteriana reconhece e onde todos os fatores necessários à
abertura da forquilha de replicação se ligam.
Um gene de resistência a antibiótico, que auxilia na seleção das bactérias que contêm o plasmídeo.
O sítio múltiplo de clonagem (multiple cloning site – MCS), que deve incluir um promotor gênico (promotor gênico é uma sequência
curta no DNA que precede o gene e sinaliza à maquinaria celular de transcrição de RNA o local a que ela deve se ligar para encontrar o
início do gene), diversos sítios de restrição por diferentes enzimas e um terminador (é uma sequência curta que define o sitio de
finalização da transcrição para liberar a maquinaria de transcrição).
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Estratégias de clonagem
Uma vez que conheçamos a sequência do nosso inserto e tenhamos escolhido o vetor que melhor se adeque às nossas necessidades, podemos
começar a clonagem. Para isso, vamos explorar duas estratégias principais. A primeira baseia-se na digestão do DNA e utiliza as
chamadas enzimas de restrição. A segunda, mais recente, utiliza apenas PCR. Vamos explorá-las com detalhes a seguir.
Clonagem por restrição
As enzimas de restrição são capazes de reconhecer sequências internas e muito especificas do DNA fita dupla e cortá-lo ao clivarem a ligação
fosfodiéster entre dois nucleotídeos, e, por isso, são classificadas como endonucleases − endo = interno; nucle = núcleo (relativo ao DNA); ase =
enzimas. Elas são encontradas na natureza em bactérias e funcionam como um sistema de defesa bacteriano contra DNA invasores
potencialmente perigosos, como o DNA de bacteriófagos (vírus que infectam e matam as bactérias).
Existem dois tipos de enzimas de restrição, baseado em como o corte, ou clivagem, do DNA é feito, veja:
Blunt end (em tradução livre “fim abrupto”): A endonuclease pode reconhecer o seu sítio de clivagem e cortar as duas fitas de DNA no mesmo
ponto.
Sticky end (em tradução livre “extremidade grudenta” ou “pegajosa”): A enzima pode cortar o DNA fita dupla com uma diferença de poucos
nucleotídeos entre as fitas complementares, deixando esses poucos nucleotídeos em fita simples, o que torna muito mais fácil o pareamento por
complementariedade entre as bases nitrogenadas. Esse método é preferível ao primeiro.
Observe os detalhes na imagem a seguir:
Ilustração representando clivagem por enzima de restrição “sticky” ou “pegajoso” e clivagem “blunt”, ou “plano”.
Para usar o método de clonagem por enzimas de restrição, tanto nosso inserto quanto nosso vetor precisam ter sítios de clivagem pela enzima de
restrição de nossa escolha. É de extrema importância que o sítio de restrição (ou clivagem) no vetor seja único, caso contrário ele será digerido em
diversos fragmentos não funcionais, e nossa clonagem não funcionará, conforme é demonstrado na imagem a seguir:
Ilustração exemplificando sítio de clivagem para enzimas de restrição “sticky” (esquerda) e “blunt” (direita). Na imagem, são exemplificadas enzimas de restrição.
Caso nosso inserto não possua o sítio de restrição naturalmente em suas extremidades, podemos colocar a sequência que a enzima reconhece nas
extremidades durante a amplificação por PCR. Para isso, basta acrescentarmos o sítio de restrição às extremidades dos iniciadores. Em seguida,
faremos a digestão do inserto e do vetor pela mesma enzima de restrição em microtubos separados. A reação de digestão é normalmente feita a
37°C por uma hora, embora a reação possa ser deixada de um dia para o outro para aumentar a digestão.
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Uma vez que a restrição tenha acontecido, veremos se o vetor foi linearizado – lembre-se de que ele era circular –
pela eletroforese em gel de agarose. Esperamos ver apenas uma banda, mais abaixo que a banda do plasmídeo não
digerido, pois o DNA linear migra mais rapidamente que o circular. Se virmos mais de uma banda no gel, será
porque nossa enzima de restrição encontrou mais de um sítio de clivagem no vetor. Isso pode ser o que você
deseja, caso queira remover uma sequência primeiro e depois, colocar seu inserto no local.
Para evitar que o vetor digerido volte a ser um círculo (já que as extremidades digeridas são complementares entre si, especialmente se uma única
enzima de restrição para as duas extremidades estiver sendo usada), devemos usar fosfatases, para remover o fosfato nas extremidades 5’, o que
impede a circularização espontânea.
Atenção!
Lembre-se de usar a fosfatase apenas no tubo do vetor, e não no do inserto. Essa é uma boa forma de controle de qualidade da nossa digestão e
para assegurar que nossa clonagem será bem-sucedida.
Em seguida, precisamos fazer a ligação entre as extremidades do nosso inserto e as do vetor linearizado, ou seja, precisamos colocar o inserto no
vetor. As “pontas grudentas”, em que há alguns poucos nucleotídeos com bases nitrogenadas livres, conseguem parear por complementariedade.
Assim, a extremidade 5’ do inserto pareará com a extremidade 3’ do vetor e a extremidade 3’ do inserto com a 5’ do vetor.
No entanto, o pareamento das bases não será suficiente para que uma ligação estável aconteça, pois a complementariedade das bases se dá por
pontes de hidrogênio facilmente desfeitas pelo calor. Para termos uma ligação estável, precisamos que ela seja covalente, o que significa que
precisamos fazer a ligação fosfodiéster entre as extremidades 5’ e 3’ das duas fitas pareadas. Para isso, usamos uma enzima chamada DNA ligase.
Veja:
DNA ligase que forma ligação fosfdiéster entre as fitas complementares do vetor e do inserto, após digestão por enzimas de restrição.
Clonagem livre de restrição
A segunda estratégia que podemos usar é chamada de clonagem livre de restrição (restriction free cloning – RFC). Na primeira parte do processo,
não precisamos de enzimas de restrição. Nela, amplificamos o DNA do inserto em uma PCR especial, que utiliza oligonucleotídeos iniciadores com
duas regiões: a região 3’ é usada para amplificar o inserto, pois o reconhecem e se anelam a ele; e a região 5’ é uma região complementar ao vetor,
que será usada na segunda etapa da RFC. Por isso, os primers para RFC são maiores que os iniciadores convencionais, com comprimento médio de
50 pb, sendo que 25 pb devem se anelar ao inserto e os 25 pb restantes ao vetor.
Na prática, é importante que as duas regiões dos iniciadores senso e antissenso tenham aproximadamente a
mesma temperatura de anelamento para que a PCR funcione. Usaremos esses oligonucleotídeos para amplificar o
inserto e, ao mesmo tempo, adicionar a ele uma região de complementariedade ao vetor. Existe ainda a
possibilidade de seu inserto ser pequeno o suficiente para estar contido dentro de iniciadores um pouco mais
longos, o que reduz a RFC a apenas uma PCR.
A ciclagem da PCR em si é praticamente a mesma que qualquer outra, com temperaturas de desnaturação, anelamento e extensão padrões –
lembrando que o tempo de extensão depende do tamanho do amplicon (produto formado ao final do PCR) a ser gerado.
Como queremos amplificar um vetor de clonagem com milhares de pares de base, cada extensão deverá ter 1 minuto por kb – ou seja, para um
plasmídeo de 7 kb, serão 7 minutos de extensão por ciclo. Como em uma PCR convencional, validaremos a reação vendo o amplicon de tamanho
desejado na eletroforese em gel de agarose.
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Veja o passo a passo a seguir:
A partir da a ilustração a seguir, podemos ver que os iniciadores usados na primeira PCR (amplificação de inserto) possuem regiões sobrepostas
para posterior anelamento ao vetor (2º PCR). Observe:
Representação esquemática da clonagem livre de restrição.
Uma vez que tenhamos inserido nossa sequência de interesse em um vetor, quer usando enzimas de restrição, quer não, precisamos verificar se
nosso inserto está presente. Para isso, fazemos uma PCR com um iniciador senso que se anele próximo ao sítio de clonagem e um iniciador
antissenso que se anele à sequência do inserto.
Esperamos que essa PCR de detecção do DNA recombinante funcione e nos dê uma banda única, do tamanho esperado para o intervalo entre os
primers. Esse é o controle de qualidade da clonagem, que vamos repetir mais à frente. Estamos prontos, então, para colocar esse vetor
recombinante dentro de uma bactéria. Essa etapa é necessária para que mais vetores sejam produzidos, mesmo que nosso hospedeiro final não
seja a bactéria. Assim, conseguiremos quantidade de vetores suficientes para outros hospedeiros.
A ciclagem será um pouco diferente da PCR convencional, pois usamos menos ciclos, uma vez que a longa fita consumirá os
reagentes rapidamente. Em seguida, purificaremos esse produto de PCR para eliminar os reagentes de PCR e usá-lo em uma segunda
reação, como o megaprimer: as extremidades do nosso inserto irão anelar com as extremidades complementares do vetor.
Além disso, podemos fazer a RFC-PCR sem temperatura de anelamento, usando apenas uma extensão a 72°C. Para essa segunda
PCR, precisamos usar o megaprimer; o vetor da nossa escolha; Taq polimerase, de preferência uma adequada para polimerização de
longas fitas; e dNTPs.
Como os iniciadores são maiores, sua temperatura de anelamento também será maior e mais próxima à de extensão.
Finalmente, o vetor parental deverá ser digerido por uma enzima chamada Dpn1, uma endonuclease que apenas reconhece e cliva o
DNA metilado (DNA com adição de grupamentos metil, decorrentes da replicação in vivo) – como o DNA amplificado por PCR não
contém grupamento metil, nosso DNA recombinante fica intacto, enquanto o vetor parental, que havia sido purificado depois de
replicado na bactéria, é digerido.
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Transformação, seleção dos clones recombinantes e multiplicação
Para colocar nosso vetor recombinante dentro de uma célula, usamos uma técnica chamada de transformação − processo de aquisição horizontal
de DNA exógeno do meio ambiente que algumas bactérias possuem. A principal bactéria usada em clonagem molecular é a ], um bacilo Gram-
negativo com fácil multiplicação e manutenção em cultura, alta eficiência de transformação e que possui cepas usadas em laboratório que não são
patogênicas. No entanto, a E. coli não é naturalmente capaz de adquirir DNA a partir do meio.
Para ser passível de transformação, precisamos fazer como que a E. coli seja competente. Conseguimos isso ao
congelarmos instantaneamente as células, usando nitrogênio líquido e na presença de tampão rico em cálcio, que
fará com que a parede celular da E. coli fique permeável e apresente pequenos orifícios para a entrada do DNA
durante a transformação.
Após tornarmos a E. coli competente para a entrada do DNA exógeno na célula, podemos transformar nosso vetor recombinante. A transformação
bacteriana mais comumente usada é a de choque térmico. As células que estão congeladas serão descongeladas e misturadas com o DNA do vetor
plasmidial. Tudo isso deve ser feito em gelo; caso contrário, a célula perderá sua competência.
Após curta incubação em gelo, fazemos o choque térmico ao colocarmos as bactérias na temperatura de 42°C por menos de 1 minuto, seguido de
banho de gelo por mais uns poucos minutos. Então, fazemos a semeadura das bactérias transformadas em placa de cultivobacteriano seletivo. No
dia seguinte, após deixarmos nossa placa em incubadora de 37°C, veremos o surgimento de colônias, cada uma correspondendo à expansão clonal
de um único transformante − bactéria que foi transformada. Veja:
Representação da transformação bacteriana.
Ao analisarmos a imagem apresentada anteriormente, vemos que:
Assim, a transformação é diretamente proporcional à quantidade de DNA plasmidial: quanto mais DNA, maior o número de colônias no final. Por
isso, tenha em mente que DNA em excesso pode ser tão prejudicial quanto em escassez, pois pode não ser possível diferenciar as colônias
bacterianas no final nem separar seus clones.
Após congelamento instantâneo de bactéria sensível a antibiótico, a parede celular fica permeável.
O plasmídeo é incubado com a bactéria e pode entrar mediante o choque térmico.
Os clones que tiveram uma transformação bem-sucedida são capazes de crescer sob seleção, ou seja, tornam-se resistentes ao
antibiótico presente na placa pela aquisição do plasmídeo.
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Entretanto, é importante sabermos que a transformação para clonagem tem eficiência muito mais baixa do que a
transformação apenas para expansão do vetor (ou seja, apenas para aumentarmos a quantidade que temos de
determinado plasmídeo). Por isso, normalmente tentamos obter e usar o máximo de DNA para a transformação
durante a clonagem.
A entrada do vetor na E. coli competente precisa distinguir a célula na qual a transformação foi bem-sucedida da que não foi. Portanto, usamos
alguns marcadores de seleção que estão presentes nos vetores e que farão a distinção entre as bactérias. O marcador de seleção mais usado é
o antibiótico ampicilina. A ampicilina é um antibiótico derivado da penicilina, capaz de matar bactérias e usado em infecções bacterianas comuns.
As espécies de E. coli são sensíveis à ampicilina, o que significa que essas bactérias morrem na presença do antibiótico. Vamos aprender mais
sobre esse assunto a seguir:
Para entender como isso funciona, vamos conhecer alguns detalhes:
A bactéria E. coli possui uma enzima chamada beta-galactosidase, codificada por um dos genes presente em uma estrutura de genes expressos
contiguamente em um único mRNA chamado operon lac.
A expressão desse operon é induzida pela presença de lactose no meio e expressa a enzima beta-galactosidade; é reprimida por um composto
chamado IPTG (isopropil-beta-D-1-tiogalactopiranosideo).
Quando a beta-galactosidase é expressa, ela cliva (quebra) um composto, chamado x-gal, em galactose e em um corante azul insolúvel.
A beta-galactosidase contém um segmento, chamado peptídeo-alfa, para ser funcional e clivar o x-gal.
No plasmídeo usado nesse sistema, a beta-galactosidase não contém esse segmento, mas ele está presente em outra região, no sítio de
clonagem múltipla (MCS). Esse é o sítio no qual o nosso DNA-alvo deve ser inserido.
Caso o inserto seja adicionado com sucesso, ele o fará no meio da sequência do peptídeo-alfa, impedindo que este último seja expresso.
Portanto, a beta-galactosidase não será capaz de clivar x-gal, e o corante azul não será feito. Nesse caso, o inserto é detectado pela falta do
corante azul, o que torna a colônia de clones branca.
Caso o inserto não tenha sido inserido com sucesso, o gene do peptídeo-alfa permanece intacto, e a beta-galactosidase poderá usá-lo e clivar x-
gal, produzindo o composto azul. Dessa forma, as colônias negativas, em que a clonagem não ocorreu, serão azuis.
Veja no esquema a seguir:
Esquema simplificado da seleção azul-branca. As colônias cujo inserto foi integrado ao plasmídeo crescem na cor branca.
A purificação do plasmídeo recombinante poderá ser feita e, apesar de não ser absolutamente necessária, é recomendável fazer o sequenciamento
do inserto.
Seleção por antibiótico 
Seleção azul-branca 

02/03/2023, 21:15 Sequenciamento, clonagem e técnicas de hibridização
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Clonagem molecular
Conheça agora um pouco sobre a clonagem molecular.
Falta pouco para atingir seus objetivos.
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Vamos praticar alguns conceitos?
Parabéns! A alternativa D está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3EUma%20das%20maiores%20e%20mais%20lucrativas%20aplica%C3%A7%C3%B5es%20da%20tecnologia%20do%20DNA%20recombina
Questão 1
A tecnologia do DNA recombinante possui muitas aplicações em medicina, agronegócios e biotecnologia. Com relação ao DNA recombinante,
analise as afirmativas abaixo e assinale a alternativa correta.
I – As bactérias podem ser usadas como fábricas para proteínas de origens exógenas.
II – O DNA recombinante consiste na união de sequências de DNA de duas ou mais origens diferentes.
III – Podemos produzir vacinas seguras e eficazes a partir de leveduras, por meio da recombinação de DNA.
IV – A diabetes mellitus do tipo I pode ser controlada pelo uso de insulina produzida por tecnologia do DNA recombinante.
V – A clonagem molecular não é útil na modificação de organismos pluricelulares, pois não gera organismos estáveis.
A Apenas as afirmativas II e III estão corretas.
B Somente a afirmativa I está correta.
C Apenas as afirmativas III e IV estão corretas.
D Apenas as afirmativas I, II, III, IV estão corretas.
E Apenas as afirmativas IV e V estão corretas.
Questão 2
Para a clonagem molecular, precisamos de um inserto, um vetor e um hospedeiro. Sobre a clonagem molecular, é correto afirmar que
A os plasmídeos são vetores autorreplicativos nos quais inserimos um DNA exógeno a ser clonado.
02/03/2023, 21:15 Sequenciamento, clonagem e técnicas de hibridização
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Parabéns! A alternativa A está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3EVetores%20de%20clonagem%20molecular%20s%C3%A3o%20DNAs%20circulares%20extracromossomais%2C%20dispens%C3%A1veis
3 - Métodos de hibridização de ácidos nucleicos e aplicações
Ao �nal deste módulo, você será capaz de identi�car os métodos de hibridização de ácidos nucleicos,
suas diferenças e aplicações na rotina do biologista molecular.
Técnicas de hibridização
As técnicas de hibridização consistem na identificação de sequências de DNA fita simples ou RNA específicas por meio de seu pareamento por
complementariedade – ou hibridização – com sequências sintéticas. O termo hibridização pode ser, por vezes, equivalente ao pareamento por
complementariedade. Assim, pode-se dizer que os oligonucleotídeos iniciadores hibridizam com o DNA-alvo em uma PCR. Para definirmos melhor o
conteúdo a ser abordado neste módulo, vamos falar de técnicas de hibridização que não se baseiam na amplificação do DNA pela Taq polimerase.
B chamamos de transformação o processo de transformar organismo selvagem em geneticamente modificado.
C bactérias não são bons organismos hospedeiros, pois são incapazes de fazer transformação.
D as enzimas de restrição são usadas na clonagem para sintetizar novas sequências de DNA, pela sua capacidade sintetase.
E os clones são selecionados baseados em sua semelhança fenotípica em microscopia ótica.
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Para detectar o DNA fita simples ou RNA nesse grupo de técnicas, usamos oligonucleotídeos marcados, chamados de sondas. Na maioria das
aplicações de técnicas de hibridização, desenhamos sondas que cubram a maior extensão possível de nosso gene, sequência ou mensageiro de
interesse.
Tais sondas podem ser curtas ou longas, e são normalmente marcadas com isótopos radioativos, enzimas,
anticorpos,substratos ou com fluoróforos, dependendo da técnica em questão.
Dessa forma, podemos classificar os métodos de revelação em dois tipos de métodos:
Diretos
As sondas são marcadas diretamente com o emissor de sinal (por exemplo, radioisótopos ou fluoróforos) e são, portanto, proporcionais à
quantidade de moléculas existentes na amostra analisada.
Indiretos
As sondas estão marcadas com agentes intermediários que são usados para aumentar o sinal emitido (como enzimas, substratos e
anticorpos).
Técnicas de transferência (blottings)
Existe um grupo de três técnicas de hibridização chamadas blots (manchas, em inglês), que são baseadas na separação das macromoléculas alvo
(DNA, RNA ou proteínas), desnaturação e transferência para uma membrana porosa que permitirá a hibridização com as sondas para revelação.
Vamos conhecer cada uma dessas técnicas em detalhes a seguir.
Southern blotting
Criada pelo bioquímico britânico Edwin Southern, em 1975, recebe o seu nome. Nessa técnica, identificamos sequências específicas de DNA. Para
isso, precisamos, primeiro, extrair o DNA total da nossa célula ou do tecido e digeri-lo usando enzimas de restrição. Uma vez que o DNA tenha sido
fragmentado, podemos separá-lo usando eletroforese, que pode ser feita em gel de agarose ou em poliacrilamida, dependendo da resolução que se
queira. Em suma, a eletroforese é feita da mesma forma que a usada para ler o produto da amplificação de uma PCR, e podemos ler seu resultado
ao adicionarmos brometo de etídio ao gel.
Atenção!
Lembre-se de que a eletroforese separa as moléculas de DNA de acordo com o tamanho através da sua migração pelo gel em direção ao polo
positivo (ou cátodo), que acontece quando ele é submetido à corrente elétrica em tampão aquoso.
Após a separação por eletroforese e leitura em transiluminador ultravioleta, o DNA é desnaturado (em fitas simples) em solução alcalina por cerca
de meia hora, e então é neutralizado de volta a pH 7. Então, podemos proceder para a transferência do DNA do gel para a membrana porosa, feita de
nitrocelulose ou nylon.
Para isso, precisamos montar uma espécie de sanduíche, no qual as duas “fatias de pão” são placas de vidro, cada uma acompanhada por papel
absorvente do lado de dentro, e o gel em contato com a membrana porosa como “recheio”. O sanduíche deve sempre ser montado dentro de uma
cuba contendo o tampão de transferência, de forma que todos os componentes fiquem encharcados e nenhuma bolha de ar fique presa. Isso

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porque as bolhas de ar impedem a transferência, formadas quando o tampão aquoso é submetido a corrente elétrica – por isso, usamos papel
absorvente para manter a membrana e o gel em contato com o tampão durante todo o período de transferência, que pode levar mais de três horas
dependendo do tamanho dos fragmentos digeridos. Após a transferência, o DNA fica fixado na membrana, que pode ter seus sítios de ligação
inespecífica bloqueados e pode ser armazenada por longos períodos em geladeira.
Para a etapa de hibridização propriamente dita, usamos sequências conhecidas, as sondas. As sondas são
complementares às sequências-alvo e se anelam a elas, fazendo parte do sistema de detecção do sinal. Tanto as
sequências-alvo quanto as sondas podem ser feitas de DNA ou de RNA.
Originalmente, eram usadas sequências de RNA produzidas em células a partir de DNA recombinante e tratadas momentaneamente com
radioisótopos – por isso, a técnica era chamada de hibridização, pelo uso de híbridos de DNA-RNA. Com o uso de oligonucleotídeos sintéticos, as
sondas de DNA têm substituído as de RNA, pois são mais estáveis que as últimas.
A membrana deve ficar imersa em solução contendo a sonda, em agitação, por pelo menos uma hora. Após essa incubação, a membrana é lavada, e
todas as sondas que não se ligaram por complementariedade ao DNA desnaturado em fita simples serão removidas do sistema, restando apenas
aquelas que se anelaram ao DNA.
Etapas de separação, transferência e hibridização doSouthern blotting, para identificação de DNA.
A leitura da hibridização dependerá da forma como as sondas foram marcadas. Caso tenhamos usado radioisótopos, precisamos revelar usando
filmes de raios X, em que a radioatividade marcará uma impressão.
Atenção!
Caso decidamos usar sondas fluorescentes, colorimétricas ou quimioluminescentes, precisamos revelá-las de acordo. Essas últimas opções são
preferíveis à primeira, por serem mais seguras para o manipulador e o meio ambiente.
Na revelação colorimétrica, a sonda está marcada com um substrato que é usado por uma enzima, em uma etapa adicional, para produção de um
composto colorido. Assim, a posição da sonda pode ser visualizada a olho nu. As sondas fluorescentes precisarão de leitura em aparelho
especializado, que excitará o fluoróforo e permitirá a identificação do local onde a sonda está.
No método quimioluminescente, temos uma enzima que catalisa uma reação, cujo produto emite luz em determinado comprimento de onda
(dependendo de qual enzima reveladora for usada) e, por isso, também precisamos de aparelho para leitura da reação.
Northern blotting
Northern blotting é uma técnica de hibridização para identificação de sequências específicas de RNA, dentre uma mistura complexa de ácidos
nucleicos, cujo nome é derivado da técnica desenvolvida para DNA (Southern blotting).
O Northern blotting pode ser usado para avaliar a presença e a quantidade da expressão de determinado gene, assim como avaliar se o mRNA está
associado a proteínas, após a purificação das últimas. Os mesmos princípios da técnica de Southern blotting são usados para o Northern blotting.
Conheça:
02/03/2023, 21:15 Sequenciamento, clonagem e técnicas de hibridização
https://stecine.azureedge.net/repositorio/00212sa/00945/index.html# 28/34
Observe os detalhes na imagem a seguir:
Esquema ilustrando a técnica de Northern blot.
Hibridização in situ
A hibridização in situ (in situ hybridization – ISH) foi uma das primeiras técnicas de biologia molecular a ser aplicada ao diagnóstico clínico de
doenças. Ela permite a detecção e a quantificação de ácidos nucleicos em cortes histológicos especiais e cultivos celulares e nos informa onde o
ácido nucleico investigado está localizado dentro da célula e do tecido.
A ISH tem sido usada para diagnóstico citogenético e de doenças infecciosas, como no caso da infecção pelo papilomavírus humano (HPV),
causador do câncer do colo do útero, em cérvice uterina. Outros exemplos de aplicação da ISH incluem a detecção de cromossomos aberrantes,
com alterações como duplicações, deleções e inserções genômicas que não deveriam existir e que podem causar doenças, como ocorre na
distrofia muscular de Duchenne, na fibrose cística e em alguns tipos de câncer.
Hibridização in situ de RNA - Melanoma Humano em Seção de Tecido fixado em formalina e embebido em parafina.
A ISH originalmente usava isótopos radioativos para marcação das sondas. Porém, com o desenvolvimento de marcadores fluorescentes mais
seguros, a ISH evoluiu para FISH (fluorescent in situ hybridization, ou hibridização in situ fluorescente). As outras abordagens de leitura do sinal
Primeiro, vamos desnaturar e separar o RNA total extraído por eletroforese em gel de agarose contendo formaldeído − um composto
químico que usamos para fixação e preservação da amostra, que é especialmente útil quando trabalhamos com RNA.
Em seguida, vamos transferi-lo do gel para a membrana de nitrocelulose ou nylon. Para isso, montamos o mesmo sanduíche,
contendo a membrana e o gel no meio, dentro de folhas de papel absorvente e com as placas de vidro como “pão”.
Após a transferência ocorrer e fixarmos o RNA, passamos à etapa de hibridização das sondas e revelação do resultado, de acordo
com a marcação das sondas usadas
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vistas nos blottings, como quimioluminescência e colorimetria, também podem ser usadas em ISH, porém são menos difundidas que a FISH.
Já que trabalhamos com tecidos ou células em cultivo, a leitura dos resultados normalmente é feita em microscopia. Para isso, precisamos ter um
microscópio de fluorescência, capaz de excitar os fluoróforos e detectar o local de emissão da fluorescência com a precisão necessária ao sistema.
Nesse caso, podemos usar microscópio com precisão na casa de nanômetros, ou seja, na casa de bilionésimo de um metro, algo em torno de
0,000000001 metro, observe os detalhes na imagem:
Representação esquemática das etapas da hibridização in situ fluorescente.
O primeiro ponto que avaliamos em uma IHS ou FISH é o desenho da sonda. Caso queiramos identificar uma sequência, um gene ou um mRNA
longo, podemos usar dezenas de sondas curtas, de cerca de 20 pb cada uma, que se anelem ao longo da sequência-alvo. Isso dá grande
especificidade ao método, além da ótima sensibilidade dada pelo aumento do sinal emitido, já que todas estarão marcadas.
Caso desejemos detectar uma região muito curta, na qual não poderemos sintetizar e anelar dezenas de sondas diferentes, podemos usar uma
técnica chamada de branched-FISH (ou FISH ramificado). Nessa técnica, usamos oligonucleotídeos que tenham duas regiões:
Primeira região
É complementar à sequência-alvo, presente no tecido ou na célula.
Segunda região
É usada como alvo para as sondas marcadas se anelarem, essa é mais longa.
Com isso, conseguimos aumentar o sinal de detecção da sequência-alvo.
Como em outras técnicas de hibridização, na ISH ou FISH, precisamos desnaturar o DNA fita dupla em fitas simples. Como agora estamos
trabalhando com tecidos ou células fixados e aderidos a uma lamínula de microscopia, não podemos usar agentes que destruam o tecido, como
acontece se tratarmos ele com tampões extremamente alcalinos.
Atenção!
Por isso, a desnaturação do DNA normalmente é feita por calor controlado, de forma a não destruirmos a célula ou o tecido. Se nosso ácido
nucleico-alvo for RNA, não poderemos usar calor, então utilizamos um composto químico chamado de formamida para desnaturação de proteínas
que possam estar ligadas ao RNA, liberando-o para a hibridização.
Precisamos ainda considerar como as sondas entrarão nas células, e isso depende diretamente do material que estamos usando e da natureza das
células. Se estivermos fazendo FISH para células ou tecidos de mamíferos, permeabilizamos as membranas plasmáticas usando álcool (etanol) e
detergentes suaves (Triton 0.1%). Caso trabalhemos com leveduras, precisamos permeabilizar uma estrutura mais resistente, a parede celular, o que
fazemos usando digestão enzimática da parede.
Finalmente, podemos fazer a hibridização, ao incubar nossa amostra fixada, desnaturada e permeabilizada com as sondas marcadas. Após
lavagens para remover o excesso de sondas, podemos montar nossa lâmina de microscópio e observar a presença de nosso DNA ou RNA-alvo ao
excitarmos os fluoróforos das sondas e detectarmos o sinal emitido por eles. Em muitos casos, vamos querer obter imagens e salvá-las, para não
somente detectar a presença ou ausência do sequência-alvo, mas também quantificar o sinal e sua intensidade, determinar sua localização, analisar
os dados e emitir os resultados, conforme demonstrado na imagem a seguir.
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Esquema ilustrando a FISH usando como agente desnaturante a formamida e um sistema de revelação pelo método indireto (com a utilização de um anticorpo).
Técnicas de hibridização
Conheça um pouco mais sobre as técnicas de hibridização.

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Falta pouco para atingir seus objetivos.
Vamos praticar alguns conceitos?
Parabéns! A alternativa E está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3EAs%20t%C3%A9cnicas%20de%20hibridiza%C3%A7%C3%A3o%20baseiam-
se%20na%20capacidade%20de%20bases%20nitrogenadas%20em%20uma%20fita%20simples%20formarem%20pontes%20de%20hidrog%C3%AAnio%
Questão 1
As técnicas de hibridização de DNA e RNA foram umas das primeiras a serem usadas e aplicadas em biologia molecular. Sobre hibridização,
selecione a opção correta.
A
As técnicas de blotting baseiam-se na separação de DNA ou RNA amplificados in vitro e na transferência para membranas de
nitrocelulose.
B
O northern blot foi desenvolvido para separação e identificação de proteínas, DNA e RNA, podendo ser usado igualmente para
as três moléculas.
C As amostras usadas em técnicas de hibridização devem estar frescas e as células, vivas, senão a técnica não irá funcionar.
D
As moléculas-alvo de hibridização precisam estar fixadas em suporte de vidro, encharcadas em tampão, para que a
hibridização aconteça.
E
A hibridização corresponde ao anelamento por complementariedade entre uma sonda marcada e o ácido nucleico da
amostra.
Questão 2
A hibridização in situ (ISH) é usada no diagnóstico de diversas doenças genéticas e infecciosas. A respeito da ISH e suas variações, leia as
afirmativas abaixo e assinale a alternativa correta.
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Parabéns! A alternativa B está correta.
%0A%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%20%3Cp%20class%3D'c-
paragraph'%3EAs%20sondas%20usadas%20em%20ISH%20s%C3%A3o%20sequ%C3%AAncias%20de%20DNA%20curtas%20e%20marcadas.%20Para%
alvo%20%E2%80%93%20e%20sensibilidade%20%E2%80%93%20dada%20pela%20capacidade%20de%20detec%C3%A7%C3%A3o%20do%20sinal%20%
Considerações �nais
Neste conteúdo, aprendemos como as grandes contribuições do conhecimento do genoma humano e de outros organismos foram feitas pelas
técnicas moleculares. Vimos também o sequenciamento, um conjunto de diferentes técnicas que visam descobrir a sequência de nucleotídeos
presentes no DNA. Dentre esse conjunto de técnicas, exploramos o sequenciamento Sanger e o sequenciamento de nova geração.
Visitamos também a tecnologia do DNA recombinante, aprendendo todas as etapas da clonagem molecular, a escolha do segmento de interesse, do
vetor, da estratégia de inserção e de clonagem (por restrição ou livre de restrição), a transformação, seleção dos clones recombinantes e sua
multiplicação. Por fim, entendemos as técnicas de hibridização, que consistem na identificação de sequências de DNA fita simples ou RNA
I. As sondas são desenhadas de forma a cobrirem a menor área possível do gene ou sequência-alvo.
II. As sondas são marcadas com radioisótopos, enzimas, substratos ou fluoróforos para posterior identificação.
III. As ISH são úteis para a detecção, localização e quantificação da sequência-alvo.
IV. A hibridização in situ fluorescente (FISH) exige leitura em microscópio de fluorescência para obtenção dos resultados.
V. Na FISH, usamos agentes desnaturantes dos ácidos nucleicos, como o calor, e fixadores, como o formaldeído.
A Somente as afirmativas I, II e III estão corretas.
B Somente as afirmativas II, III, IV e V estão corretas.
C Somente as afirmativas II e III estão corretas.
D Somente as afirmativas III e IV estão corretas.
E Somente as afirmativas IV e V estão corretas.
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específicas pelo pareamento por complementariedade com sequências sintéticas, abordando as técnicas de transferências, Southern
blotting e Northern blotting. Além disso, conhecemos a técnica de hibridização in situ.
O sequenciamento, a clonagem e a hibridização de ácidos nucleicos permitiram avanços importantes na ciência e como esses conhecimentos são
aplicados em saúde, agropecuáriae biotecnologia.
Podcast
Ouça agora os principais aspectos do assunto que você acabou de estudar.
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