P1-Proteínas

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1)    Explicar a importância da água como solvente biológico para estrutura e atividade de proteínas.
A água como solvente polar interage química e fisicamente com a molécula protéica em suas regiões laterais. As cadeias laterais dos aminoácidos podem ser hidrofílicas ou hidrofóbicas e as interações das diferentes cadeias laterais da proteína com o meio aquoso tem grande participação no processo de dobramento em suas estruturas secundárias, terciárias e quaternárias. Então, o dobramento de uma proteína é reflexo do equilíbrio entre as ligações de H da água com as cadeias laterais hidrofílicas e da repulsão ao meio aquoso pelas cadeias laterais hidrofóbicas que ocorrem pelas interações hidrofóbicas onde as moléculas apolares vão reagir entre elas em vez de com o meio aquoso, aumentando sua compactação. Quando as interações hidrofóbicas estão maximizadas a proteína está em sua estrutura nativa, a qual está apta a exercer suas funções.
2)   Fazer o gráfico de titulação dos aminoácidos ácido aspártico e lisina, calculando o valor do ponto isoelétrico destes aminoácidos e sua localização no gráfico. Em pH = 4, qual a carga formal da espécie majoritária de cada um destes aminoácidos? E em pH = 10? Quais as faixas de pH que estes aminoácidos atuam como tampões?
3)   Explicar porque a ligação peptídica possui caráter parcialmente duplo. Faça desenhos da estrutura para justificar a explicação. Qual o impacto desta característica para o dobramento da proteína?
Ligação peptídica é a ligação entre os aminoácidos (grupo carboxila com grupo amina) liberando uma molécula de água para formar a estrutura primária da proteína. O caráter parcialmente duplo da ligação peptídica é relacionado com a sua deslocalização de elétrons entre o nitrogênio da amida e sua carbonila, dando 40% de caráter duplo a essa ligação, fazendo com que a livre rotação em torno da ligação peptídica não seja possível. O impedimento estérico faz com que a conformação trans seja mais estável e os carbonos beta juntamente com a carbonila e o nitrogênio estão em um plano rígido. Por ser plano, o dobramento da proteína final é afetado.
4)  Explicar porque proteínas podem ser quantificadas utilizando a absorbância em comprimento de onda de 280 nm. Qual a limitação desta abordagem de quantificação?
Porque alguns aminoácidos são aromáticos, portanto tem duplas ligações conjugadas que conseguem absorver luz em comprimento de onda máximo de 280 nm. A limitação é a ausência desses aminoácidos o que pode fazer com que o comprimento de onda de absorção do polipeptídeo mude gerando uma quantificação incorreta. 
5)   Explicar qual o impacto para estrutura de proteínas fibrosas da modificação de prolina para hidroxiprolina?
 As proteínas fibrosas são formadas por um único tipo de estrutura secundária. A proteína é um aminoácido cujo átomo de nitrogênio faz parte de um anel onde a rígida rotação sobre a ligação N-Ca não é possível, gerando torção que desestabiliza a hélice. A prolina primeiramente é incluída depois modificada e, ao ser modificada para hidroxiprolina pelo acréscimo de uma hidroxila, formam-se mais ligações de H e os ângulos característicos formados são mais rígidos, gerando maior estabilidade na cadeia pelo aumento das interações de hidrogênio entre as cadeias.
6)     Explicar como o aminoácido não convencional selenocisteína é incorporado em uma sequência polipeptídica.
Esse aminoácido é inserido durante a tradução e isso é feito por ação do fator de elongação SELB. É preciso que seja formada uma alça (steam-loop) derivada de sequências complementares de ribonucleotídeos denominada SECIS seguida do códon de terminação UGA na sequência do mRNA possibilitando uma ligação mais eficiente da proteína SELB-selenocisteil-tRNA à fita de mRNA e ao ribossomo. Então, a selenocisteína é codificada por um código de parada UGA e uma sequência SECIS (sequência de inserção) localizada após o códon UGA que indica a inserção da selenocisteína. A SECIS forma um loop reconhecido pela proteína SeIB que posiciona o tRNA sec no sítio UGA.
7)   Desenhe a estrutura do peptídeo alanil-fenilalanil-lisil-prolina, marcando as regiões amino terminais e carboxi terminais e circulando as ligações peptídicas. Fazer o gráfico de titulação deste peptídeo, calculando o valor de ponto isoelétrico e indicando este ponto no gráfico. Se submetido a uma diferença de campo elétrico, este peptídeo em pH = 9 se deslocaria para o polo positivo ou negativo? Justifique sua resposta com a estrutura da espécie mais abundante neste pH.
 
8)  Explicar as diferenças de uma proteína com síntese ribossomal e uma proteína com síntese não ribossomal.
A maior parte das proteínas é sintetizada através da tradução ribossomal em que a atividade catalítica de formação de ligações peptídicas é intrínseca aos RNAs 23S e 28S das subunidades maiores dos ribossomos de procariotos e eucariotos. A síntese não ribossomal é feita por bactérias e fungos através de enzimas multifuncionais chamadas de peptídeo-sintase.
A diferença está no mecanismo de síntese da proteína. As proteínas com síntese ribossomal são sintetizadas no processo de tradução no sentido 5’-3’ do mRNA com a ligação peptídica sempre entre o grupo de um aminoácido com o grupo carboxila ligado ao carbono alfa de outro aminoácido. As proteínas com síntese não ribossomal tem mais liberdade na forma como a ligação amida vai ser formada porque não há um modelo único a ser seguido já que o processo é feito por enzimas.
9)   Explicar as principais forças moleculares responsáveis pela estrutura primária, secundária, terciária e quaternária, indicando os principais átomos que participam destas interações.
Primária: tem as ligações covalentes do arcabouço proteico, as ligações peptídicas (entre os aminoácidos) e as pontes dissulfeto (ligam resíduos de aminoácidos em uma cadeia polipeptídica).
Secundária: arranjos estáveis de resíduos de aminoácidos promovidos pelas ligações dissulfeto (covalentes) e interações fracas (não covalentes) que as ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e interações iônicas. Há interação do meio aquoso com a proteína promovendo aumento do efeito hidrofóbico que contribui para a estabilidade da estrutura da proteína em sua forma nativa. As interações iônicas favorecem o dobramento dos aminoácidos em alfa-hélice e folha-beta pelas interações dos seus grupos carregados.
Terciária: Interação de aminoácidos que estão distantes na sequência peptídica. A direção, curvatura e ângulo são definidos pela sequência de aminoácidos onde cada um está localizado e como interagem entre si. São mantidos por interações fracas e ligação dissulfeto.
Quaternária: Arranjo de subunidades proteicas em complexos tridimensionais como se duas cadeias polipeptídicas se agrupassem uma em relação à outra. São mantidas pelas interações não covalentes (ligação de H, interações iônicas e hidrofóbicas), as mesmas que mantém as subunidades de aminoácidos unidas. Além disso, ligações dissulfeto também participam.
10)  O que é diagrama de Ramachandran e como ele pode ser utilizado para avaliar a qualidade de uma estrutura de proteínas?
Esse diagrama prediz a probabilidade de ocorrência de ângulos φ e ψ de cada aminoácido de uma proteína e é útil para avaliar a qualidade de uma estrutura de proteínas porque mostra em suas regiões coloridas de forma mais escura ângulos possíveis sem impedimento estérico; se essas regiões forem grandes, a estrutura está estável, se for pequena a estrutura é instável portanto tem baixa qualidade de proteína.
11)  Quais as diferenças de uma estrutura secundária do tipo alfa hélice e beta folha com base nos ângulos das ligações, átomos envolvidos nas interações de estabilização da estrutura e frequência de aminoácidos?
Alfa-hélice: arranjo simples da cadeia polipeptídica maximizando a ocorrência de ligações de hidrogênio internas. É uma estrutura helicoidal enrolada em torno de um eixo imaginário. Os grupos R estão para fora do esqueleto e cada volta tem 3,6 resíduos de aminoácidos.
Folha-beta: a cadeia polipeptídica está emforma de zigue-zague e são formadas ligações de H entre segmentos adjacentes na cadeia polipeptídica dentro da folha. Os grupos R se projetam em direções opostas e as cadeias adjacentes podem se estender em um mesmo sentido (folha beta paralela) ou em sentidos opostos (folha beta antiparalela).
12)  O que são estruturas supra-secundárias?
Uma estrutura supra-secundária é o arranjo local que envolve duas ou mais estruturas secundárias adjacentes e a conexão entre elas. Por exemplo, a unidade beta-alfa-beta em que uma alfa-hélice está entre duas folhas beta é uma estrutura suprasecundária, como se ela fosse intermediária entre estruturas secundárias e terciárias.
13)  Quais as funções biológicas de proteínas ou regiões intrinsecamente desordenadas?
Proteínas intrinsecamente desordenadas são proteínas que têm características que fazem com que sejam ótimas reguladoras na sinalização celular. Além disso, estão ligadas a processos como catálise enzimática, regulação alostérica e transcrição, entre outros.
14)  Explique como uma proteína pode se dobrar tornando uma estrutura mais ordenada e ainda respeitar a segunda lei da termodinâmica que indica que a entropia do universo está aumentando?
 A entropia de uma proteína diminui à medida que ela se enovela porque o objetivo é reduzir ao máximo a energia potencial que a estrutura possui. As interações intermoleculares mais favoráveis que vão se formando à medida que a proteína é dobrada liberam energia (aumenta a entalpia) o que reduz a energia potencial da proteína (ela desce no funil de energia). Porém tudo isso gera aumento da entropia; se o dobramento libera energia ela vai para algum lugar, que no caso é a água que passa a ter mais liberdade de movimentação e agitação, representando o aumento da desordem gerado pelo aumento da entropia. Como o ganho de entropia da vizinhança é maior que a perda de entropia da proteína, no balanço energético a entropia aumenta.
15)  O que é uma reação endergônica e exergônica?
Uma reação endergônica é quando o sistema ganha energia (∆G é positivo) e uma reação exergônica e quando há liberação de energia no sistema (∆G negativo).
16)  Explique a contribuição de cada tipo de interação no dobramento de proteínas: eletrostática, ligação de hidrogênio, força de van der Waals, efeito hidrofóbico e ligações covalentes.
Ligação de hidrogênio: Sua contribuição no dobramento é que elas são formadas entre a proteína e o meio aquoso aumentando as interações hidrofóbicas das cadeias das proteínas adjacentes, contribuindo então para o enovelamento da proteína.
Força de van der Waals: As forças de van der Waals se iniciam com interações eletrostáticas entre dipolos permanentes ou induzidos. As interações dipolo são importantes na estrutura de proteínas porque os grupamentos amina e carboxila da cadeia peptídica tem momentos dipolo estáveis, então os dipolos permanentes dos grupos NH2 e C=O produzem dipolos induzidos nos grupos vizinho formando então uma interação de atração forte pelo grande número delas.
Efeito hidrofóbico: O efeito hidrofóbico é o que faz as proteínas minimizarem o contato com a água formando micelas intramoleculares. A agregação dos grupos não polares diminui a área de superfície ocupada por eles gerando ganho de entropia, favorecendo o dobramento da proteína.
Ligações covalentes: São as ligações mais fortes. Uma delas é a ponte dissulfeto que oxida grupos -SH da cisteína para serem formadas, aumentando a estabilidade da proteína principalmente em extremos de pH e temperatura já que não é uma ligação facilmente quebrada. A ligação peptídica também é uma ligação covalente essencial no dobramento de proteínas porque é ela que promove a junção dos aminoácidos, gerando a cadeia que vai ser enovelada.
17)	Explique o modelo do colapso hidrofóbico no contexto do dobramento de proteínas, relacionando com o gráfico de funil de energia que estabiliza a conformação nativa de proteínas.
O modelo do colapso hidrofóbico implica que uma proteína colapsa rapidamente em torno de suas cadeias laterais hidrofóbicas e se rearranja a partir de glóbulos amorfos. No colapso inicial a entropia da proteína diminui e a do sistema aumenta, depois o glóbulo amorfo formado é rearranjado para alcançar o estado nativo da proteína então a entropia da proteína aumenta. O gráfico de funil de energia mostra que a proteína passa por vários estados energéticos até chegar em sua forma nativa de menor energia.
18)  Compare as metodologias experimentais de estudo de dobramento de proteína utilizando as técnicas de dicroísmo circular e troca pulsada de hidrogênio e deutério, destacando as vantagens e desvantagens de cada método.
O dicroísmo circular é útil na observação da formação de estruturas secundárias que têm espectros de DC característicos porque resíduos aromáticos absorvem luz UV e cada aminoácido tem um valor de absorbância molar próprio e proteínas têm valores diferentes de lambda levógiro e dextrógiro, sendo a diferença entre a absorbância molar de L e D o dicroísmo circular. Os polipeptídeos têm espectros de DC diferentes para cada forma de estrutura secundária e regiões de dobra. Sua vantagem é a simplicidade da análise, ela é feita rapidamente.
A troca pulsada de H/D é a troca de H (aminas e grupamentos hidroxila) por deutério (isótopo de H1) com a proteína sendo exposta a solução de guanidina ou ureia em D2O, então os hidrogênios ácidos (expostos ao solvente) são substituídos por deutério. O dobramento é iniciado em stopped flow, diluindo a solução desnaturante em H2O e reduzindo o pH para parar a troca de hidrogênio. Em seguida, o pH é aumentado para reiniciar a troca, então os átomos de D do peptídeo que não formaram ligação de H estão livres para troca com o H1 enquanto os que já formaram ligação permanecem deuterados. A troca é novamente interrompida com redução de pH e o dobramento é concluído. Como o hidrogênio e o deutério têm espectros de RMN e massas atômicas diferentes, a incorporação de deutério é facilmente detectada, podendo determinar a dinâmica e tempo de dobramento de determinados resíduos individuais de proteínas.