Técnicas de Clonagem - Purificação e Ligação

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Técnicas de Clonagem: Purificação e Ligação
Fluxograma da clonagem:
Purificação do produto de PCR:
Por que seria necessário purificar o produto de PCR que foi amplificado?
Porque precisamos que a DNA ligase só identifique DNA. Para isso, devemos isolar o DNA e descartar outros reagentes envolvidos na PCR.
Possíveis métodos:
- Uso de colunas de sílica: possuem filtros que separam DNA de não-DNA.
- Precipitação do DNA (com etanol e acetato de sódio)
Precipitação do DNA com etanol e acetato de sódio:
Obs: Em condições de baixa temperatura e elevada concentração salina a adição de etanol absoluto (ou isopropanol) resulta na precipitação do DNA (aglomerados esbranquiçados).
Etanol: Precipita ácidos nucléicos (<15 pb), os demais solutos ficam em solução enquanto que ácidos nucléicos formam um precipitado branco que pode ser coletado por centrifugação.
Protocolo:
1) Adicionar volume 1/10 de NaAc 3M pH 5.2 e 2.5 volumes de EtOH
Misturar por inversão
Incubar -20 °C por 30 minutos
2) Centrifugar 12000 g, por 5 minutos
Descartar sobrenadante
3) Lavar precipitado duas vezes com EtOH 70% gelado
4) Secar o precipitado e ressuspender o DNA em H2O nuclease-free ou TE (tampão de eluição)
Esse processo também pode ser utilizado para aumentar a concentração do material, deixando o DNA mais agregado possível. 
Reação de ligação:
T4 DNA Ligase: enzima que liga o inserto no vetor
Ligase 10x Buffer: possui cofatores e estabilizantes de pH da T4 DNA ligase, para que ela atue em condições ideiais
Inserto: material amplificado
H2O: meio de atuação dos reagentes
Vetor: se liga ao inserto através de uma ligação fosfo-diéster, formando um DNA plasmidial recombinante
Parâmetros para reação de ligação:
Importante conhecer a concentração do DNA a ser trabalhado.
- Concentração do DNA (Inserto: Vetor) 1:1 3:1 5:1
- Preferência: mais inserto do que vetor; isso porque existe a possibilidade de algum dos insertos não se associarem ao vetor, ficando um “vetor vazio”, que é quando as duas extremidades se fecham. Então, para minimizar as chances de todos insertos não se ligarem a nenhum vetor, se coloca mais inserto do que vetor.
- O volume de inserto está associado à concentração do inserto.
- Técnicas de espectrometria podem ser utilizadas para quantificação.
- Exemplo de equipamento utilizado: NanoDrop® Thermo Scientific.
- Analisa amostras de 0,5 a 2 µL
- O sistema de retenção utiliza a tensão superficial para posicionar a amostra entre duas fibras ópticas.
- Ácidos nucléicos absorvem luz no comprimento de
onda de 260 nm.
Quantificação do DNA:
- Comprimento de onda para DNA/RNA: 260nm
- Comprimento de onda para proteínas: 280nm
Análise da pureza do DNA: Razão 260/280 = 1,8 a 2
- Para fazer a leitura no espectrofotômetro, normalmente se utiliza uma diluição em água*.
- Para estimar a concentração de DNA utiliza-se a seguinte relação:
1 OD260 = 50 µg DNA dupla-hélice
- A concentração de DNA na amostra é obtida pelo seguinte cálculo:
[DNA] = Valor da leitura em O.D. X 50 X Fator de diluição
Parâmetros para reação de ligação:
- Concentração do DNA (Inserto: Vetor) 1:1 3:1 5:1
- Temperatura: temperatura ambiente ou refrigeração (4 – 16 °C)
- Tempo: 30 minutos, 1 – 3h, “overnight”
- O tipo de terminal (coesivo ou cego) pode influenciar
- Se o inserto quantificado estiver numa concentração
de 25 ng/µL, quanto seria utilizado na reação considerando a proporção 3:1?
- 0.01 unidade de T4 DNA Ligase: quantidade de enzima necessária para catalizar a ligação de 1µg de fragmentos de DNA em 16°C em 20 minutos.