ESTUDO DIRIGIDO - PCR

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ESTUDO DIRIGIDO - PCR 
1) No processo de extração de DNA/RNA qual o papel da solução de lise? 
A solução de lise é capaz de desestruturar proteínas e lipídios das membranas celulares. Assim, as 
membranas sofrem ruptura e todo o conteúdo celular – inclusive o DNA – fica disperso na solução, facilitando 
a extração do material genético. O detergente presente na solução de lise possui partes polares e apolares 
e por isso é amplamente utilizado para degradar as membranas. 
2) Após a separação do DNA de todos os outros componentes celulares qual o procedimento 
realizado para tirar o DNA de solução e transferi-lo para um novo microtubo? 
O DNA passa por um processo de centrifugação, que consiste em extrair o DNA com fenol, seguido da 
aplicação de etanol e sal para quebrar a ligação do DNA com a água, de maneira que possibilite a 
visualização do DNA olho nu. 
3) Após a extração de DNA quais técnicas podem ser utilizadas para qualificação e quantificação? 
Explique essas técnicas. 
O espectrofotômetro é capaz de determinar as concentrações médias de DNA ou RNA presentes em uma 
amostra, assim com sua pureza. É realizada por medição da quantidade de luz absorvida pelo DNA em 
solução num comprimento de onda específico (260 nm). Quanto maior for a absorção de luz nesse 
comprimento de onda, maior a concentração de DNA na solução. Já na técnica do gel de agarose, aplica-
se amostras de DNA juntamente com padrões de concentração já conhecidos. Logo, nas extrações é 
possível obter grandes moléculas, que incluem cromossomos inteiros ou fragmentados, de maneira que 
amostras de boa qualidade formam bandas íntegras, enquanto amostras degradadas ou com presença de 
moléculas de RNA apresentam rastros ao longo do gel. É realizada pela comparação entre a intensidade da 
fluorescência das amostras extraídas com uma solução de DNA de concentração conhecida. 
4) O que é eletroforese? 
É um mecanismo utilizado na separação (tamanho, carga e forma) dos componentes de um sistema, por 
meio do uso de um campo elétrico. Muito utilizado para analisar moléculas biológicas, como proteínas, 
enzimas e ácidos nucleicos. 
5) Por que, na eletroforese, o DNA migra para o polo positivo? 
O DNA migra para a extremidade anódica (carga positiva) porque possui carga negativa, principalmente 
devido ao seu caráter ácido, ou seja, em solução aquosa libera íons H+. 
6) Por que após a eletroforese as moléculas menores de DNA ficam mais abaixo no gel? 
A velocidade de migração das moléculas de DNA no gel é inversamente dependente do seu tamanho. Assim, 
os fragmentos em classes de tamanhos distintos vão formar bandas distintas no gel. O tamanho de cada 
fragmento na mistura pode ser determinado comparando sua distância de migração com um conjunto de 
fragmentos padrão de tamanhos conhecidos. Se as bandas estiverem bem separadas, pode-se cortar uma 
banda individual do gel, e a amostra de DNA pode ser purificada a partir da matriz de gel. Portanto, a 
eletroforese de DNA pode ser diagnóstica ou preparatória. 
7) Quais são os componentes da replicação do DNA in vivo que diferem da reação PCR? 
Para ocorrer a replicação do DNA in vivo, são necessárias 5 enzimas: DNA polimerases comuns, 
topoisomerases, ligases, helicases e primases. Já na reação por PCR, somente são necessárias: DNA 
polimerases termoestáveis (dependente de íons Mg+2) e primers altamente específicos. 
8) Quais são as três etapas da reação? O que acontece em cada uma delas? 
A primeira etapa é a Melting, a qual o DNA sofre desnaturação, ou seja, deixa de ser uma fita dupla e passa 
a ser uma fita simples, por meio do rompimento das pontes de hidrogênio. A segunda etapa é a Annealing, 
a qual os primers procuram a sequência complementar para se ligarem. A terceira e última etapa é a 
Extension, a qual os nucleotídeos são polimerizados pela DNA polimerase. 
9) Porque precisamos de utilizar DNA polimerases de bactérias termófilas? 
Pois as bactérias termófilas sobrevivem em águas extremamente quentes, mais especificamente acima dos 
75ºC. Logo, o DNA se mantém íntegro em elevadas temperaturas, mesmo com a perda das pontes de 
hidrogênio. 
10) Por que a PCR precisa acontecer em ciclos? 
Para gerar o máximo de replicações possíveis do DNA, de maneira a facilitar o estudo deste e o diagnóstico 
de uma possível patologia. 
11) Cite todas as diferenças entre a PCR convencional e a PCR Real Time. 
A principal diferença entre esses tipos de PCR é o tempo de reação, a qual é infinitamente inferior no PCR 
em tempo real. Além disso, o DNA requer concentrações muito maiores no PCR clássico e possui uma 
menor reprodutibilidade (regularidade) do que o PCR em tempo real. Diante disso, é óbvio que o PCR em 
tempo real tem uma maior precisão, fato esse que se evidencia em resultados quantitativos. Some-se a isso 
a não manipulação pós-PCR do PCR em tempo real em comparação ao PCR clássico e ao custo cerca de 
três vezes maior. O PCR em tempo real também se difere do PCR clássico pelo uso de corantes 
fluorescentes no sistema de detecção. 
12) Cite três aplicações da PCR na medicina. 
Detecção de mutações, medicina forense e diagnóstico molecular.