Técnicas de Clonagem - Purificação e Ligação

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Técnicas de Clonagem: 
Purificação e Ligação 
Fluxograma da clonagem: 
 
 
Purificação do produto de PCR: 
Por que seria necessário purificar o produto de PCR 
que foi amplificado? 
Porque precisamos que a DNA ligase só identifique 
DNA. Para isso, devemos isolar o DNA e descartar 
outros reagentes envolvidos na PCR. 
 
Possíveis métodos: 
- Uso de colunas de sílica: possuem filtros que 
separam DNA de não-DNA. 
 
 
 
- Precipitação do DNA (com etanol e acetato de sódio) 
 
 
Precipitação do DNA com etanol e acetato de 
sódio: 
Obs: Em condições de baixa temperatura e elevada 
concentração salina a adição de etanol absoluto (ou 
isopropanol) resulta na precipitação do DNA 
(aglomerados esbranquiçados). 
 
Etanol: Precipita ácidos nucléicos (<15 pb), os demais 
solutos ficam em solução enquanto que ácidos 
nucléicos formam um precipitado branco que pode ser 
coletado por centrifugação. 
 
Protocolo: 
1) Adicionar volume 1/10 de NaAc 3M pH 5.2 e 2.5 
volumes de EtOH 
Misturar por inversão 
Incubar -20 °C por 30 minutos 
2) Centrifugar 12000 g, por 5 minutos 
Descartar sobrenadante 
3) Lavar precipitado duas vezes com EtOH 70% gelado 
4) Secar o precipitado e ressuspender o DNA em H2O 
nuclease-free ou TE (tampão de eluição) 
 
Esse processo também pode ser utilizado para 
aumentar a concentração do material, deixando o 
DNA mais agregado possível. 
 
Reação de ligação: 
 
T4 DNA Ligase: enzima que liga o inserto no vetor 
Ligase 10x Buffer: possui cofatores e estabilizantes 
de pH da T4 DNA ligase, para que ela atue em 
condições ideiais 
Inserto: material amplificado 
H2O: meio de atuação dos reagentes 
Vetor: se liga ao inserto através de uma ligação fosfo-
diéster, formando um DNA plasmidial recombinante 
 
Parâmetros para reação de ligação: 
Importante conhecer a concentração do DNA a ser 
trabalhado. 
- Concentração do DNA (Inserto: Vetor) 1:1 3:1 5:1 
- Preferência: mais inserto do que vetor; isso porque 
existe a possibilidade de algum dos insertos não se 
associarem ao vetor, ficando um “vetor vazio”, que é 
quando as duas extremidades se fecham. Então, para 
minimizar as chances de todos insertos não se ligarem 
a nenhum vetor, se coloca mais inserto do que vetor. 
- O volume de inserto está associado à concentração 
do inserto. 
- Técnicas de espectrometria podem ser utilizadas 
para quantificação. 
- Exemplo de equipamento utilizado: NanoDrop® 
Thermo Scientific. 
 
 
- Analisa amostras de 0,5 a 2 µL 
- O sistema de retenção utiliza a tensão superficial 
para posicionar a amostra entre duas fibras ópticas. 
- Ácidos nucléicos absorvem luz no comprimento de 
onda de 260 nm. 
 
Quantificação do DNA: 
- Comprimento de onda para DNA/RNA: 260nm 
- Comprimento de onda para proteínas: 280nm 
 
Análise da pureza do DNA: Razão 260/280 = 1,8 a 2 
 
 
- Para fazer a leitura no espectrofotômetro, 
normalmente se utiliza uma diluição em água*. 
- Para estimar a concentração de DNA utiliza-se a 
seguinte relação: 
1 OD260 = 50 µg DNA dupla-hélice 
- A concentração de DNA na amostra é obtida pelo 
seguinte cálculo: 
[DNA] = Valor da leitura em O.D. X 50 X Fator de 
diluição 
 
Parâmetros para reação de ligação: 
- Concentração do DNA (Inserto: Vetor) 1:1 3:1 5:1 
- Temperatura: temperatura ambiente ou refrigeração 
(4 – 16 °C) 
- Tempo: 30 minutos, 1 – 3h, “overnight” 
- O tipo de terminal (coesivo ou cego) pode influenciar 
 
- Se o inserto quantificado estiver numa concentração 
de 25 ng/µL, quanto seria utilizado na reação 
considerando a proporção 3:1? 
- 0.01 unidade de T4 DNA Ligase: quantidade de 
enzima necessária para catalizar a ligação de 1µg de 
fragmentos de DNA em 16°C em 20 minutos.