Método de sedimentação espontânea

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Métodos - Parasitologia
Método de sedimentação espontânea (Hoffman, Pons e Janer; Lutz):
Fundamento:
- Precipitação de partículas, inclusive de cistos, ovos e larvas de parasitos ao fundo do cálice de sedimentação, devido à força de gravidade.
Indicação:
- Utilizado na pesquisa de ovos de S. mansoni, é atualmente usado na rotina diária dos laboratórios, na detecção de cistos de protozoários, de ovos e larvas de helmintos.
- A vantagem deste método é a economia, dispensando o uso de reagentes e centrífugas. A desvantagem é a grande quantidade de detritos fecais, dificultando, com frequência, a preparação e o exame da lâmina.
Procedimento:
1. Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de várias partes do bolo fecal, em copo graduado ou Becker de 250 ml. Completar o volume de 50 a 60 ml de água corrente e misturar vigorosamente.
2. Preparar a suspensão juntando 100 ml de água corrente.
3. Filtrar essa suspensão através de gaze dobrado 4 vezes, recolhendo-a em copo de sedimentação de capacidade de 125 ml.
4. Se necessário, adicionar água corrente, até completar aproximadamente ¾ do volume do copo cônico. Deixar a suspensão em repouso durante 1 a 2 horas.
5. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, colher uma pequena porção do sedimento na camada inferior, depositando sobre uma lâmina. Se a preparação estiver muito espessa, diluir com uma gota de solução salina a 0,85% ou água corrente. Colher amostra adicional do centro e do fundo do sedimento.
6. Examinar ao microscópio, a presença de ovos, larvas e cistos.
1. Homogeneizar fezes (2-5g) em água destilada com um bastão de vidro (ou palito).
2. Transfira a suspensão para o cálice de sedimentação, filtrando-a com filtro ou gaze.
3. Após 1-2 h despreze o sobrenadante, adicione água (lavagem do sedimento até atingir a limpidez), que deve ficar novamente em repouso. Despreze o sobrenadante e colete o sedimento com pipeta Pasteur e transfira para lâmina (uma gota).
4. Adicione 1 gota de lugol, ao sedimento e cubra com a lamínula.
5. Observe a lâmina ao microscópio com uma objetiva de 10x e, posteriormente, mude para a objetiva de 40x.
Método de Willis:
Fundamento:
- Baseia-se na capacidade da solução saturada de cloreto de sódio em fazer flutuar ovos de helmintos considerados leves.
Indicação:
- Recomendado para a pesquisa de ovos de helmintos de baixo peso específico como ancilostomídeos e Trichuris trichiura ou ainda de ovos férteis de Ascaris lumbricoides. Não é recomendado para protozoários, ovos inférteis de A. lumbricoides e ovos de tremaódeos ou E. vermicularis. Este método é bastante eficiente na identificação de ovos de ancilostomídeos, sobretudo nos casos em que há baixa infestação. Pode-se usar açúcar ao invés do sal no preparo da solução (Sheather).
Procedimento:
1. Colocar uma quantidade de fezes de aproximadamente 1 a 2 g, coletada de várias partes do bolo fecal, em pequena cuba de vidro de 3 cm de diâmetro com capacidade aproximada de 20 ml. Completar ¼ da capacidade do recipiente com solução saturada de cloreto de sódio.
2. Suspender as fezes na solução saturada salina até haver uma total homogeneização.
3. A lamínula deve ficar em contato com o menisco durante 30 a 45 minutos; não deverá haver formação de bolhas de ar entra a lamínula e a superfície do líquido. A gota contendo os ovos se adere à face inferior da lamínula.
4. Remover a lamínula e inverter rapidamente a sua posição sobre uma lâmina.
5. Examinar ao microscópio com objetiva de pequeno aumento.
1. Homogeneizar ~5g de fezes. Completar o volume do frasco Borel com a solução saturada de NaCl até formar menisco.
2. Colocar uma lâmina de microscopia sobre a boca do frasco Borel de modo que sua face inferior seja banhada pelo líquido.
3. Esperar ~30-40min, suspender a lâmina bruscamente e invertê-la. Acrescentar uma gota de lugol e cobrir com lamínula.
4. Observar ao microscópio, focalizando inicialmente no aumento de 10 e depois 40x.
Método de Faust (Centrífugo-flutuação pelo sulfato de zinco - FAUST & Cols.):
Fundamento:
Flutuação de cistos de protozoários e ovos leves de helmintos em solução de sulfato de zinco.
	
Indicação:
- Indicado na pesquisa de protozoários e de ovos leves de helmintos (Ancilostomídeos, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura).
- Esta técnica é imprópria para espécimes que contenham grande quantidade de gorduras. 
- A técnica pode ser utilizada com fezes preservadas em formaldeído, SAF e outros fixadores, no entanto a densidade específica deverá ser ajustada em 1.2 g/mL. O aumento de densidade poderá resultar em uma distorção dos organismos.
Obs.:
1. ovos de trematódeos e de cestóides podem estar presentes, portanto um exame completo deve se examinar também o sedimento.
2. uma permanência prolongada da suspensão em sulfato de zinco, pode resultar em distorção dos cistos e ovos de nematódeos. A preparação deve ser examinada até 20 minutos. Deve-se utilizar tubos com fundo
Procedimento:
1. Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10 ml de água. Filtrar a suspensão através de gazes dobradas em quatro vezes, e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml. 
2. Adicionar água corrente até completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar ( 650x g ( 2500rpm) por 1 minuto ).
3. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ao sedimento, antes de ressuspendê-lo. Completar com água 2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar.
4. Repetir a etapa 3, até que o sobrenadante apresente-se relativamente claro.
5. Depois que o último sobrenadante é decantado, adicionar 1 a 2 ml do reagente, e ressuspender o sedimento: completar com sulfato de zinco 33% até 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar (650 x g( 2500rpm) por 1 min ).
6. Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitação, colocá-lo em uma estante em posição vertical.
7. Com uma alça de arame (diâmetro de 5 a 7 mm) tocar no centro da membrana formada na superfície, transferido várias alçadas para uma lâmina de microscopia. Examinar ovos, larvas e cistos.
8. Depois de concluída a etapa 4, com auxílio de pipeta, encher o tubo até a borda com solução de sulfato de zinco. Colocar uma lamínula (22 x 22 mm) na superfície do tubo. Deixando-a em contato com o líquido durante 8 a 10 minutos. Remover a lamínula, invertendo a sua posição, e colocar a face com a gota sobre uma lâmina. Examinar para larvas e cistos.
1. Diluir ~1-2g de fezes em 10ml de água.
2. Filtrar com gaze em um tubo de centrífuga e centrifugar a 2500rpm por 1min.
3. Descartar o sobrenadante e ressuspender com 1-2ml de água, centrifugando novamente, até atingir a limpidez.
4. Uma vez o sobrenadante claro, despreza-se para adicionar solução de ZnSO4 (33%). Centrifugar novamente.
5. Recolhe-se o material formado em uma membrana na superfície com uma alça bacteriológica.
6. Deposita-se o material sobre a lâmina, cobre com lugol e deposita uma lamínula em cima.
Fita Gomada (Graham):
Fundamento:
Baseia-se na utilização da fita gomada na apreensão de estágios evolutivos de parasitos, localizados na região perianal.
Indicação:
Este método é indicado para a pesquisa de todos os parasitos que prioritária ou ocasionalmente se deslocam até a região perianal. Assim sendo, poderemos detectar o Enterobius vermicularis, Taenia sp, e eventualmente ovos de Ascaris lumbricoides, Ancilostomídeos e Trichuris trichiura.
Procedimento:
1. Coleta do material deverá ser realizada pela manhã antes que o paciente realize sua higiene. Recomendar que o paciente não utilize pomada ou outro qualquer medicamento de uso tópico na região anal ou perianal na noite anterior ao exame.
2. Tomar um pedaço de fita gomada com aproximadamente 10 cm, colar nas extremidades dois retângulos de papel "oficio", a fim de servirem para identificação dos pacientes e manuseio do técnico, sem risco de contaminação.
3. Montar em tubo de ensaio. (l5xI50) de modo que a parte adesiva permaneça livre, na parte externa do fundo do tubo.
4. Recomendar que o paciente fique em decúbito ventral, e aplicara fita gomada montada sobre a região perianal, tendo o cuidado de afastar os glúteos.
5. Após a coleta, aplicar a fita gomada sobre a lâmina pressionando levemente do centro para a periferia a fim de evitar a apreensão de bolhas de ar.
6. Preparar no mínimo duas lâminas. Em seguida levar a microscopia.
7. As lâminas assim preparadas poderão ser encaminhadas até dois meses após, devido à capacidade de conservação da técnica.
1. Tomar um pedaço de fita gomada com ~10cm, colar nas extremidades dois retângulos de papel, a fim de servirem para identificação do paciente e manuseio, sem risco de contaminação.
2. Montar em tubo de ensaio, de modo que a parte adesiva permaneça livre, na parte externa do fundo do tubo.
3. Segurar a fita adesiva e colocá-la sobre o tubo, deixando a parte colante livre.
4. Levar a fita adesiva até a região perianal e fazer pressão em diversos lados.
5. Colar a fita na lâmina, tendo o cuidado de deixa-la lisa, sem rugas.
Método de Baermann-Moraes:
Fundamento:
- Baseia-se no hidro e termotropismo das larvas e na tendência destas de sedimentar, espontaneamente, quando se encontram na água.
Indicação:
- Indicado na pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. Demonstra também a presença de larvas de ancilostomídeos e por vezes até adultos de nematódeos pequenos como E. vermiculares.
- Ao serem examinadas fezes que permaneceram, antes do exame, em temperatura ambiente por período superior a 24 horas, ou ainda de indivíduos que sofrem de constipação intestinal, ocorre a possibilidade de que as larvas encontradas sejam rabditóides ou filarióides de ancilostomídeos e não de Strongyloides stercoralis.
Procedimento:
1. Encher o funil com água corrente, aquecida a 40-45ºC.
2. Abrir a pinça de Mohr, deixando escorrer uma pequena quantidade de água para evitar a formação de bolhas de ar na haste e no tubo de látex.
3. Colocar 8 a 10 g de fezes, recentemente emitidas, sobre gaze dobrada quatro vezes e, se necessário, juntar mais água, até que as fezes fiquem submersas.
4. Deixar em repouso durante 60 minutos.
5. Abrir a pinça e coletar parte do líquido em vidro de relógio; examinar ao microscópio estereoscópio (aumentos 20 a 30 x). Deixar em repouso durante alguns minutos, pois desta forma as larvas migrarão para o centro do vidro de relógio, ou proceder de acordo com o item 6.
6. Coletar em tubo cônico de centrífuga. Centrifugar (500 x g por 1 min), e examinar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com solução de Lugol, para a identificação das características morfológicas das larvas, e examinar ao microscópio com aumento de 20x.
1. Colocar ~10g de fezes sobre uma gaze dobrada 4x e fazer uma “trouxa”.
2. Encher o funil com água a 40-45ºC. Fechar o bico do funil, adaptado com tubo de borracha com um grampo. Colocar a gaze apoiada na borda superior do funil o suficiente para entrar em contato com as fezes.
3. Após ~12h de repouso, escoar 2-5mL do sedimento em vidro relógio e examinar em esteromicroscópio.
4. Ou coletar o sedimento em tubo cônico, centrifugar (500 x g por 1min), corar com lugol, montar entre lâmina e lamínula.
5. Examinar ao microscópio com aumento de 20x e identificação das características morfológicas das larvas.
Método de Rugai, Mattos & Brisola
Fundamento:
- Baseia-se no hidro e termotropismo das larvas de S. stercoralis contidas no material fecal.
Indicação:
- Indicado na pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. Demonstra também a presença de larvas de Ancilostomídeos, notadamente em pacientes portadores de constipação intestinal.
- A observação microscópica deve ser cuidadosa e toda larva visualizada deverá ser identificada segundo a chave de classificação proposta por AMATO NETO & cols.
Procedimento:
1. Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada quatro vezes, e repuxar as extremidades para trás;
2. Encher, com aproximadamente 70 a 100 ml de água corrente aquecida a 40-45°C, um copo cônico de sedimentação (capacidade de 125ml);
3. Transferir o recipiente com as fezes para o interior do copo cônico de sedimentação, de modo que o líquido alcance toda a extensão da abertura do recipiente, cuidando para não formar bolhas de ar;
4. Deixar em repouso durante 60 minutos.
5. Colher o sedimento, no fundo do copo cônico, com pipeta capilar longa. Alguns autores recomendam retirar o recipiente do copo Cônico antes da colheita do sedimento. Entretanto, outros preferem manter o recipiente, para evitar o revolvimento do líquido; 
6. Examinar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com solução de lugol
Método de Harada-Mori:
Fundamento
O método visa o cultivo de larvas em papel de filtro.
Indicação
Empregado no cultivo de larvas de ancilostomídeos e Strongyloides stercoralis presentes no material fecal.
Procedimento:
1. Distribuir 0,5 g de fezes em tira de papel de filtro (3 x 15 cm), deixando as extremidades livres.
2. colocar a tira em um tubo de ensaio (18 cm), com água destilada, de modo que a extremidade inferior toque na água;
3. tampar o tubo de ensaio, deixar 7 a 14 dias na temperatura ambiente 
4. examinar com lupa o fundo do tubo 
5. adicionar formalina 10% de piperazina a 5% e colocar o tubo de ensaio em banho-maria a 50oC por 15 minutos a fim de matar as larvas;
6. retirar as larvas e coloca-las entre lâmina e lamínula para identificação.
Método de Kato-Katz
Fundamento
Fundamenta-se na contagem de ovos de helmintos em lâmina após o peneiramento e contato com substância conservadora. QUANTITATIVO
Indicação
- Indicado para avaliação da carga parasitária no diagnóstico e controle de cura após o tratamento.
Ex. Schistosoma mansoni.
- Contar os ovos encontrados em toda a lâmina e multiplicar por 23, a fim de ter o número de ovo por grama de fezes.
- OBS.:Apesar de ser recomendado para a pesquisa de helmintos, este método tem sido empregado com mais frequência na esquistossomose, devido às modificações que podem ocorrer na morfologia dos ovos de outros parasitas.
- A função da glicerina é a clarificação da matéria fecal, tornando-a transparente e permitindo melhor visualização dos ovos aí presentes. Os ovos de Ascaris e de Trichuris conservam-se bem por semanas ou meses, enquanto os ovos de Ancilostomídeos têm sua visualização comprometida por este método.
Procedimento:
1. Colocar a amostra fecal sobre o papel absorvente.
2. Comprimir a tela metálica ou de náilon sobre as fezes, fazendo com que parte passe através das malhas.
3. Remover as fezes que passam através das malhas e transferi-las para o orifício do cartão, colocado sobre a lâmina.
4. Depois de encher o orifício central, remover com cuidado o cartão, deixando as fezes com a lamínula.
5. Cobrir as fezes com a lamínula de celofane, invertendo e pressionando a lâmina sobre o papel absorvente.
6. Deixar a preparação em repouso (clarificação) durante 30 minutos a 34-40°C ou à temperatura ambiente por 1-2 horas.
7. Examinar a preparação ao microscópio
Centrífugo-sedimentação por formol acetato de etila
Fundamento:
Fornece o diagnóstico para ovos, larvas e cistos de todas as espécies de parasitos intestinais detectáveis, além de separar dos detritos, deixando o sedimento limpo.
Indicação:
Destina-se à pesquisa de protozoários e helmintos nas fezes
Procedimento:
1. Diluir aproximadamente 2 g de fezes em 5 mL de solução de formalina a 10% e filtrar por meio de gaze dobrada.
2. colocar em tubo de centrifuga e acrescente 1 ou 2 gotas de detergente comercial.
3. acrescentar 3 mL de acetato de etila comercial;
4. tampe o tubo e agite por 10 segundos
5. destampar e centrifugar por 2 minutos a 2000rpm
Observar a formação de quatro camadas distintas:
1a camada - sedimento no fundo do tubo
2a camada formalina
3a camada detritos
4a camada acetato de etila
6. despreze a camadas sobrenadantes com um movimento rápido
7. ressuspender o sobrenadante com 7 ml de água. Tampe o tubo e agite
8. centrifugar 2000 rpm por 2 minutos. Desprezar o sobrenadante
9. deixar o tubo emborcado sobre gaze por 2 minutos
10. ressuspender o sedimento com lugol. Colocar umagota do sedimento sobre lâmina e proceder a leitura. 
Centrífugo-sedimentação por formol éter (método de Ritchie)
Fundamento:
Fornece o diagnóstico para ovos, larvas e cistos de todas as espécies de parasitos intestinais detectáveis, além de separar dos detritos e gorduras fecais.
Indicação:
Destina-se à pesquisa de protozoários e helmintos nas fezes
Função do éter:
O éter tem a mesma função do acetato de etila, isto é, ele dissolve as substâncias graxas e faz flutuar os detritos, porém ele é mais volátil, explosivo e inflamável.
Procedimento:
1. Colocar 1 ou 2g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10ml de água corrente ou solução salina a 0,85%;
2. Filtrar a suspensão através de gaze dobrada duas ou quatro vezes, e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml.
3. Centrifugar 2000 rpm por minuto);
4. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ou solução salina a 0,85% ao sedimento antes de ressuspendê-lo. Completar com água corrente (ou solução salina a 0,85%) 2/3 do volume do tubo. Agitar e centrifugar 2000rpm por 1 min).
5. Repita a etapa 4, até que o sobrenadante se apresente relativamente claro.
6. Depois que o último sobrenadante é decantado, ressuspender o sedimento com 1 a 2 ml de formalina a 10% (dar preferência à solução tamponada de formalina a 10% pH. Neutro). Completar o volume da suspensão em 10 ml com formalina a 10%. Deixar em repouso em repouso durante 5 minutos.
7. Adicionar 3ml de éter ou acetado de etila, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posição invertida, por 30 minutos. Remover a tampa com cuidado.
8. Centrifugar 2000rpm 1 min. Quatro camadas se formarão: (1) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitas, (2) camada de formalina, (3) tampão de detritos fecais, e (4) camada de éter na superfície.
9. Afrouxar e separar o tampão de detritos das paredes do tubo com um estilete fino, e com cuidado decantar as três camadas superiores. Limpar com swab de algodão as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes.
10. Uma pequena quantidade de líquido que permanece nas paredes do tubo escorre para o fundo junto ao sedimento. Misturar o líquido e o sedimento, preparando as lâminas para a pesquisa de ovos, lavas e cistos.
Técnica de Kinyoun:
Fundamento:
Os coccídios coram-se pela fucsina básica, adquirindo coloração vermelha ou rosa brilhante intensa; e são álcool ácido resistente, destacando-se de outros resíduos, leveduras e bactérias.
Indicação:
Este método é indicado para pesquisa dos coccídios intestinais, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis e Isospora belli
 
Procedimento:
1. Preparar o esfregaço com uma a duas gotas de fezes frescas ou preservadas. Deixar secar a temperatura ambiente.
2. Fixar submetendo direto ao calor rapidamente.
3. Cobrir com Fucsina 3 a 5 minutos
4. Lavar rapidamente
5. Diferenciar com álcool ácido até não sair mais corante.
6. Lavar com água
7. Contra corar com azul de metileno 30 segundos a 1 minuto.
8. Deixar secar e examinar ao microscópio
Obs.: a coloração de fundo da preparação depende do corante utilizado; azul de metileno concede a cor azul aos organismos que não se coram pela fucsina, enquanto o verde malaquita cora o fundo verde e o ácido pícrico em amarelo
Solução de fucsina carbórica
Fucsina básica 4,0 g
Fenollíquido 8,0 g
Álcool a 95 % 20 mL
Água destilada 100 mL
Dissolver a fucsina no álcool e no fenol.
Filtrar antes de usar.
Solução de álcool-ácido clorídrico a 0,1%
HCl P.A 0,1 mL
Álcool 99 Ml
Solução estoque de azul de metileno
Azul de metileno 1,4 g
Álcool a 95% 100 mL
Solução de uso azul de metileno
Solução estoque 10 mL
Água destilada 90 mL