Microscopia óptica, citopatologia, microscopia eletrônica e técnicas imunes

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Ferramentas da histopatologia
· O que nos diferenciam dos animais = ferramentas
· Aulas anteriores: exames da patologia e evolução da patologia
· Principal ferramenta da patologia: histologia convencional
· Histologia convencional
· Coleta
· Fixação: líquidos de transporte, conservantes
· Existem conservantes específicos
· Macroscopia: inspeção do que chegou no laboratório
· Desidratação
· Diafanização: tornar o tecido translúcido, quase transparente, é um transparente permeável a coloração, feita com xilol/xileno
· Parafinização: após a diafanização o material é colocado na parafina, é preciso que o tecido esteja a 61ºC, processo super controlado , a parafina ocupa o lugar da água que saiu no processo de desidratação, dá pra manter a estrutura do tecido = o que permite estudar esse tecido
· Blocagem + congelamento: é colocado em um bloco de parafina e resfriado
· Microtomia e laminação:
· Coloração
· Um exame de patologia não fica pronto antes de 24h
· Biópsia incisional
· Retira parte da lesão bem como pequena área marginal de tecido normal para comparação
· A maior parte da lesão continua no paciente, aguardando o resultado do exame histopatológico para definir a forma de tratamento mais adequada
· Biópsia excisional - exerése
· Retira-se toda a lesão, com pequena margem de tecido normal, como segurança
· Muito utilizada em lesões pigmentadas ou tumorais da pele
· Nódulo de mama
· Amputações e retiradas
· Retirada total ou parcial de qualquer órgão 
· Costuma ser feita após uma primeira biópsia ou exame citopatológico
· Procedimento radial
· BAG/CORE
· Biópsia por agulha grossa
· Por método radiológico (para se localizar) busca-se a introdução de uma agulha grossa no órgão afetado até alcançar a lesão
· Obtem-se um cilindro de tecido para ser estudado
· Substitui as biopsias incisionais e excisionais por ser mais rápida, fácil de realizar, utilizar anestesia local, dispensar internações e diminuir custos
· Muito utilizada em tumores de mama e próstata e em doenças hematológicas onde uma biópsia de medula óssea é necessária
· Fixação
· Formalina a 10¨%, volume: 10x o tamanho do órgão, pra cada cm 10 ml de líquido
· Bouin: biópsia renal/testículo
· Zenker: MO
· Karnowisk: ME
· Descalcicadores
· Meios de transporte: IMF
· Macroscopia
· Analisa a peça
· Macroscopista faz o recorte do tecido, analisa cada meio cm da peça, pega um fatia da peça e faz uma lâmina do materal
· Representação
· É colocado dentro de um cápsula numerada
· A cápsula é levada para o histotécnico onde ocorre os processos de desidratação, diafanização
· Histotécnica
· É o processo mais importante
· Começa com desidratação forçada do tecido, feita com álcool
· Torna-se o tecido translúcido
· Diafanização feita com xilol, que dissolve as gorduras
· Parafinização: tem a inclusão em parafina, o material vai ser colocado dentro de blocos e vai ser resfriado para ficar duro e facilitar o corte
· Emblocagem
· Procedimento de colocar o material em um bloco de parafina
· Microtomia/corte
· O bloco vai ser cortado em fatias e colocada na lâmina
· Uma vez tirada a fita, vai ser colocada numa solução de água morna com álcool pra ser esticada e colocada na lâmina
· Pigmentação/coloração
· Uma vez na lâmina, esse material é desparafinizado e vai passar por uma bateria de coloração
· Hematoxilina/eosina
Microscopia óptica
· Tudo que é vermelho é a eosina que corou
· Tudo que é azul é a hematoxilina que corou
· O preto é muito azul
· O branco é ausência
· Se meu corante corou o ácido, ele tem afinidade pelo ácido = logo, ele é básico
· Se meu corante corou vermelho, ele é acido, logo, corou substâncias básicas
· A importância da Coloração HE é que ela permite muito nitidamente a gente diferenciar tonalidades do branco, do azul e do vermelho; E isso tem a ver com a quantidade de ácido ou base no tecido que está sendo corado;
· Por exemplo, no núcleo das células eu tenho DNA, ácido, então quem reage é a Hematoxilina (corante azul); 
· Enquanto que no citoplasma não é tão acido, reagindo então com a eosina
· Hematoxilina: Corante básico de cor roxa/azul, core estruturas ácidas, que são basófilas: núcleo por exemplo; 
· Eosina: Corante ácido de cor rosa; core substâncias básicas, acidófilo
· Colorações específicas
· Existem N outras colorações para estudo de substâncias especiais
· Tricrômico de Masson
· Marca tecido fibroso em azul e o que não é fibroso em vermelho
· Marca colágeno
· Pearls:
· Faz a coloração do ferro em azul
· Reticulina
· Estrutura do tecido (microtúbulos)
· Giemsa:
· Coloração hematológica, leishmania, H. pilori
· Ziehl Baar
· Serve para marcar bacilos resistentes da lepra, hanseníase, tuberculose
· Importante
· Grocott
· Serve para marcar de marrom os fungos
· Importante
· PAS
· Diastase: é uma enzima presente na saliva, quando colocado SEM diastase, o PAS vai marcar o açúcar, quando colocado COM diastase, ele dissolve o açúcar e fica só a mucina, tirei o glicogênio
· PAS C/D com diastase
· Se quero saber se é mucina faz PAS C/D 
· Vermelho do congo
· Alzheimer
Citopatologia
· A principal é 
Microscopia eletrônica
· Permitiu o estudo:
· Da ultra-estrutura das células
· Dos padrões intrínsecos
· Precisão pontual
· Avaliação de densidades
· Alterações de membranas
· Organelas
· Aplicabilidade restrita à algumas áreas (focada em pesquisa)
· É muito demorada, técnica elaborada
· Utilizada em últimos casos
· Muito usada em: rim, pele, doenças de depósitos.. 
· Patologia renal: consegue detectar depósitos de substâncias na membrana do glomérulo renal
· Grande evolução na biologia muscular, zoneamento das actinas e miosinas
Microscopia óptica citoquímicas
· Histo-citoquímica
· Avaliações enzimáticas
· Dá indícios de micro-morfologia
· Baseada no funcionamento metabólico celular
· Melhor avaliação funcional
· Permitem avaliar placa motora, junção muscular
· Dá pra identificar a quantidade de mitocôndrias por fibras
· Dá pra identificar atrofias
Métodos imunológicos
· IMF, IMHQ, FISH
· Imunoflurescência
· 3 padrões de depósito (liso, ..)
· Imuno-histoquímica - histórico
· Técnica de marcação de anticorpos com produtos fluorecentes
· Grande sensibilidade e especificidade (se liga ao antígeno específico)
· Imunologia
· É o conjunto de procedimentos que utiliza anticorpos como reagentes específicos para a detecção de antígenos presentes em células ou tecidos
· Antígeno
· Proteínas de membrana
· Conteúdo nuclear
· Elemento exógeno/estranho
· Anticorpo
· Proteína em formato de “Y” que são produzidos pelo sistema imunológico 
· É um sinalizador de superfície
· Anti-corpos policlonais: são os anticorpos que servem para tudo, soro
· Anti-corpos monoclonais: pego uma parte dos anticorpos e purifico ele, de forma que ele é ultra-específico, ou seja, é o anticorpo purificado com elevada especificidade
· V- fase molecular
· Proteína = alto peso molecular, toda a molécula de proteína tem carga (se move em um campo elétrico), o que muda de uma proteína p outra = o peso (são peso-específicas)
· Como separo proteínas? pelo peso delas, por eletroforese
· CD20 positivo = linfócito B (defino que é um linfócito B)
· Imunofluorescência
· Como é definido o exame de imunofluorescência?
· O exame de imunofluorescência direita (IF) é definido como a pesquisa de depósitos de imunoglobina e frações do complemento em localização específicas
· Nefropatologialogia (marca os néfrons- olha a imagem)
· Pode ser direta ou indireta
· Direta: quando ligo o antígeno ao anticorpo primário e consigo marca-lo com flurescência (anticorpos são ligados diretamente ao composto fluorescente (isocianato de fluoresceína) emite luz verde com o estímulo da UV
· Indireta: anticorpo primário se liga a um antígeno de interesse, anticorpo secundário
· Padrões de depósito
· Imuno-histoquímica
· As técnicas de IHQ detectam moléculas (antígenos) teciduais
· O mecanismo básico é o reconhecimento do antígeno por um anticorpo (ac primário) associado a diversos tipos de processos de visualização
· Vantagem: grande disponibilidade de anticorpos para uso em tecidos fixadosem formol e incluídos em blocos de parafina, permitindo o estudo de blocos arquivados por longos períodos (diferente da imunofluorescência)
· IMHQ- Ação de peroxidase no tecido
· Peroxidase > oxidação do heme + complexo molecular
· Método peroxidase Anti-Peroxidase
· Propriedades imuno-histoquímica
· É uma técnica qualitativa: objetivo fundamental - encontrar e localizar topograficamente antígenos nos tecidos ou células
· Permite alguns métodos semiquantitativos e quantitativos
· Técnica interpretativa, qualitativa que leva em conta contexto clínico, cirúrgico e macroscopia (qualquer imuno-histoquímica que não levar isso em conta não tem validade)
· Funções mais importantes: marcadores prognósticos e preditivos em câncer de mama, caracterização de carcinomas de sítio primário e desconhecido
· A imuno-histoquímica conseguiu diferenciar marcadores linfóides
Biologia molecular em patologia
· Hibridização in situ
· Captura de híbridos: pego um pedaço de DNA e coloco em uma cuba, na qual tem uma placa de anticorpos, que podem marcar 
· PCR:
· Fish: hibridização fluorescente in situ
· Cariótipo
· Análise cromossômica
· Eletroforese: blots
· Hibridização em larga escala - micro arrav