Tecnologia do DNA

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Tecnologia do DNA
- História
Na década de 70 começou a desenvolver técnicas e padrões de
manipulação genética. Watson e crick propuseram o modelo de dupla
hélice para o DNA. Na década de 70 surgiu a dificuldade de como isolar
um gene e conseguiram por meio de enzimas de restrição que eram
capazes de cortar o DNA em pontos específicos. Então essas novas
técnicas de manipulação…
1. permitiram transplantar genes de uma espécie para outra
2. separação, amplificação, sequenciamento e expressão de genes
3. após a amplificação, o DNA externo pode ser purificado
Os 4 tipos de técnicas:
- DNA recombinante: obtenção de organismos geneticamente
modificados
- DNA complementar: obtenção de cópias de genes de interesse
- PCR: obtenção de muito DNA em pouco tempo
- DNA fingerprint: paternidade
DNA recombinante
São moléculas de DNA que contém fragmentos de DNA ligados
covalentemente, derivados de duas ou mais fontes geralmente de
espécies diferentes. A clonagem molecular é a técnica central da
metodologia do DNA recombinante.
Permite combinar na mesma molécula de DNA genes provenientes de
fontes diferentes, mas não necessariamente de espécies diferentes,
dando origem a uma molécula de DNA recombinado. No DNA existem
sequências de restrição que dá para ler da direita para esquerda e direta
para esquerda -> sequências palindrômicas, é onde as enzimas de
restrição vão agir cortando essa região; O segmento cortado entre essas
duas regiões é chamado de fragmento de restrição.
Objetivos da clonagem de genes;
→ amplificar milhares de vezes apenas o gene de interesse
→ realizar um estudo individual da função dos genes
→ identificar mutações
→ entender ação enzimática da proteína produzida
→ verificar com quais ou genes ele interage
→ produzir a proteína em larga escala
→ montar genomas
→ produzir organismos transgênicos
ferramentas moleculares para esse mecanismo:
1. enzimas de restrição-> reconhecem a sequência de restrição e
cortam a molécula nesses locais (endonucleases). Essas enzimas
foram obtidas a partir da observação de como as bactérias reagem
para destruir vírus, elas reconheciam sequências nucleotídicas e
produziam enzimas para quebrá-las; existem enzimas que cortam
em pontos aleatórios (I e III) e outras que seguem padrões
específicos (II)
2. ligases do DNA -> liga o fragmento ao vetor formando o DNA
recombinante
3. vetores -> faz o elo de ligação e recebe o fragmento de DNA
diferente do dele, mais utilizado é o plasmídeo. No vetor deverá
atuar a mesma enzima de restrição para a complementaridade. As
extremidades se unem por meio das DNA polimerases que
catalisam as ligações fosfodiéster.
Enzimas necessárias: enzimas de restrição, DNA polimerase, liga-se e
fosfatase.
Aplicação do DNA recombinante: Produzir substâncias úteis [insulina,
hormônios, vacinas], estudar mecanismos de replicação e expressão
gênica; investigação da paternidade, diagnóstico de doenças genéticas e
infecciosas, terapia gênica, transgênicos;
DNA complementar
Os procariotos são muito utilizados como receptores de DNA externo por
serem fáceis de se multiplicar e de cultivar, mas não possuem o mRNA e
se recebem genes com íntrons, eles não conseguem retirar [splicing] e a
proteína não funciona.
A produção por meio desse mecanismo é possível pela transcriptase
reversa (DNA -> RNA), o DNA complementar é obtido a partir de um
RNA que é funcional e já passou pelo splicing, com a transcriptase
reversa é originado uma fita de DNA a partir desse RNA sem íntrons. Por
meio de uma DNA polimerase essa fita de DNA se torna uma fita dupla.
Cadeia da polimerase -PCR
Permite amplificar qualquer porção de DNA fora das células para:
- sequenciamento
- eletroforese
- clonagem
Para isso, o DNA é aquecido para separar as fitas, com isso adicionam-se
no meio nucleotídeos livres e DNA polimerase resistente [obtida a partir
da bactéria thermus aquaticus] ao calor/ Taq polimerase para fazer um
cópia. Assim, ocorre a duplicação e várias cópias do DNA. É necessário
primers para iniciar o processo. No PCR ocorre análise do DNA!!
Aplicações do PCR na área médica: ******
- medicina forense
- medicina diagnóstica parasitária
- medicina diagnóstica fetal e pré implantacional
- medicina diagnóstica genética
- oncologia - farmacogenômica
DNA fingerprint
Por meio de uma técnica de eletroforese, onde os segmentos de DNA se
movimentam de forma diferente formando bandas que podem diferir de
indivíduo para indivíduo.