Espectrofotometria

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Espectrofotometria, preparo de curva padrão e quantificação de açúcares redutores em amostra biológica
OBJETIVOS
- utilizar um método espectrofotométrico de quantificação, 
- determinar a concentração de açúcares redutores em uma amostra biológica pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). 
 No método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), usado para quantificar açúcares redutores, ocorre uma reação, em meio alcalino, com o referido ácido convertendo-se em ácido 3- amino-5-nitrossalícilico por ação dos açúcares redutores, dando origem a um complexo tijolo, que por sua vez é quantificado espectrofotometricamente. 
MATERIAIS E MÉTODOS
Para cada equipe (4 equipes):
Béquer de 500 mL (para descarte)
6 tubos de ensaio
Suporte para tubos
Micropipeta e ponteiras
Água destilada ou deionizada
3 béqueres de 10 mL
Balão volumétrico de 25 ou 50 mL
Para a turma:
- leite (deve ser diluído 40 x). Faça os cálculos para realizar esta diluição, sendo que o volume final da amostra deverá ser de 2,0 mL
- solução padrão de glicose 5 mg/mL (solução-mãe)
- Reagente DNS (75 g de tartarato duplo de sódio e potássio, 0,25 g de ácido 3,5 dinitrosalicílico e 50 mL de NaOH 2 M)
- Banho-maria
- Espectrofotômetro
- Cubetas
Preparo da curva padrão 
- a partir da solução-mãe de glicose fazer as seguintes diluições: 3,0; 2,5; 2; 1,5; 1,0 e 0 mg/mL, conforme tabela. Fazer esse procedimento em tubo de ensaio.
	Concentração (mg/mL)
	Volume da solução-mãe (mL)
	Volume de água (mL)
	3,0
	0,6 (600 µL)
	0,4
	2,5
	0,5 (500 µL)
	0,5
	2,0
	0,4 (400 µL)
	0,6
	1,5
	0,3 (300 µL)
	0,7
	1,0
	0,2 (200 µL)
	0,8
	0
	0
	1
- pipetar 1000 µL (1 mL) da solução de DNS para tubos de ensaios previamente identificados com a respectiva concentração da curva padrão. 
- Aquecer a mistura em banho-maria, com água fervente, por 10 minutos. 
- Resfriar as soluções até temperatura ambiente.
- Acrescentar 2 mL de água e calcular as novas concentrações.
- Determinar a absorbância a 570 nm (A570). 
- Anotar os resultados e determinar a curva padrão, a equação da reta e o R2.
Determinação da concentração de açúcares redutores do leite 
- fazer a diluição de 40 x para a amostra. 
- repetir o procedimento anterior usando agora, ao invés dos pontos da curva, a 1 mL de amostra que desejamos determinar a concentração (leite diluído). Fazer isso em duplicata.