Resumo de Citologia - Cavendish (1)

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Universidade	
  de	
  Brasília	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
CITOLOGIA	
  
	
  
Organizado	
  por	
  Rafael	
  Cavendish	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
O	
  material	
  
	
  
Este	
  material	
  é	
  um	
  aglomerado	
  de	
  imagens	
  e	
  parágrafos	
  transcritos	
  de	
  diversas	
  fontes,	
  com	
  
intenção	
  de	
  ser	
  um	
  auxílio	
  no	
  estudo	
  da	
  matéria	
  de	
  citologia.	
  As	
  informações	
  foram	
  extraídas	
  
do	
  livro	
  Biologia	
  Molecular	
  da	
  Célula	
  (Alberts,	
  5ª	
  Ed),	
  slides	
  dos	
  professores	
  Tatsuya	
  Nagata	
  e	
  
Fernando	
  Lucas	
  Melo,	
  a	
  apostila	
  de	
  biologia	
  celular	
  do	
  CEDERJ	
  e	
  diversos	
  websites,	
  citados	
  no	
  
fim	
  do	
  documento.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
COMPOSIÇÃO	
  QUIMICA	
  DA	
  CELULA	
  
	
  
Substâncias	
  Orgânicas	
  
Proteínas:	
  presentes	
  em	
  todas	
  as	
  estruturas	
  celulares.	
  São	
  formadas	
  por	
  aminoácidos	
  
e	
   sua	
   presença	
   é	
   indispensável	
   para	
   o	
  metabolismo	
   do	
   organismo.	
   As	
   proteínas	
   formam	
   as	
  
enzimas.	
  Correspondem	
  a	
  17%	
  da	
  composição	
  química	
  da	
  célula	
  animal.	
  
Vitaminas:	
  podem	
  ser	
  hidrossolúveis	
  (solúveis	
  em	
  água)	
  ou	
  lipossolúveis	
  (solúveis	
  em	
  
lipídeos).	
   São	
   necessárias	
   em	
   pequenas	
   quantidades	
   pelo	
   organismo,	
   sua	
   falta	
   pode	
   causar	
  
doenças.	
  As	
  vitaminas	
  são	
  adquiridas	
  por	
  meio	
  de	
  uma	
  alimentação	
  variada.	
  	
  
	
  
Carboidratos	
  ou	
  Glicídios	
  ou	
  Açúcares:	
  são	
  fundamentais,	
  pois	
  dão	
  energia	
  às	
  células	
  e	
  
ao	
  organismo.	
  São	
  de	
  três	
  tipos:	
  monossacarídeos,	
  dissacarídeos	
  e	
  polissacarídeos.	
  Alguns	
  têm	
  
função	
   estrutural,	
   como	
   celulose	
   e	
   quitina;	
   e	
   de	
   reserva,	
   como	
   o	
   amido	
   e	
   glicogênio.	
  
Correspondem	
  a	
  6%	
  da	
  composição	
  química	
  da	
  célula	
  animal.	
  
Lipídios:	
  insolúveis	
  em	
  água,	
  atuam	
  como	
  reserva	
  de	
  energia,	
  isolante	
  térmico	
  etc.	
  São	
  
classificados	
   em	
   glicerídeos,	
   ceras,	
   esteroides,	
   fosfolipídios	
   e	
   carotenoides.	
   Compõem	
  
estruturas	
  celulares.	
  Correspondem	
  a	
  11%	
  da	
  composição	
  química	
  da	
  célula	
  animal.	
  
Substâncias	
  inorgânicas	
  
Sais	
  minerais:	
   formados	
  por	
   íons.	
  Algumas	
  de	
   suas	
   funções	
   são:	
   formar	
  o	
  esqueleto,	
  
participar	
  da	
  coagulação	
  sanguínea,	
  transmissão	
  de	
  impulsos	
  nervosos.	
  Sua	
  falta	
  pode	
  afetar	
  o	
  
metabolismo	
  e	
  levar	
  à	
  morte.	
  Correspondem	
  a	
  4%	
  da	
  composição	
  química	
  da	
  célula	
  animal.	
  
Água:	
   substância	
   encontrada	
   em	
   maior	
   quantidade	
   nos	
   seres	
   vivos.	
   Pode	
   dissolver	
  
diversas	
   substâncias,	
   por	
   isso	
   é	
   classificada	
   como	
   solvente	
   universal.	
   No	
   corpo	
   humano	
  
representa	
   cerca	
   de	
   70%	
   do	
   peso	
   corporal.	
   Participa	
   de	
   inúmeras	
   reações	
   químicas	
   no	
  
organismo.	
  Correspondem	
  a	
  62%	
  da	
  composição	
  química	
  da	
  célula	
  animal.	
  
	
  
Organelas	
  de	
  uma	
  célula	
  animal	
  e	
  suas	
  funções:	
  
	
  	
  
Nucléolo	
  -­‐	
  produção	
  dos	
  componentes	
  ribossômicos	
  
	
  
Núcleo	
   -­‐	
   conservar	
   e	
   transmitir	
   a	
   informação	
   genética	
   na	
   reprodução	
   das	
   células	
   e	
  
regular	
  as	
  funções	
  celulares.	
  
	
  	
  
Ribossomos	
  -­‐	
  produção	
  de	
  proteínas	
  
	
  	
  
Vesículas	
  -­‐	
  transporte	
  de	
  substância	
  e	
  união	
  com	
  a	
  membrana	
  para	
  eliminar	
  conteúdos	
  
para	
  fora	
  da	
  célula.	
  
	
  	
  
Retículo	
  endoplasmático	
  rugoso	
  -­‐	
  participa	
  da	
  síntese	
  e	
  transporte	
  de	
  proteínas.	
  
	
  	
  
Complexo	
  de	
  Golgi	
  -­‐	
  faz	
  a	
  secreção	
  celular.	
  
	
  	
  
Citoesqueleto	
  -­‐	
  participam	
  do	
  transporte	
  de	
  substâncias	
  e	
  dão	
  forma	
  a	
  célula.	
  
	
  	
  
Retículo	
   endoplasmático	
   Liso	
   -­‐	
   participa	
   do	
   processo	
   de	
   transporte	
   celular,	
   além	
  de	
  
participar	
  da	
  síntese	
  de	
  lipídios.	
  
	
  	
  
Mitocôndrias	
  -­‐	
  são	
  responsáveis	
  pela	
  respiração	
  das	
  células.	
  
	
  	
  
	
  Vacúolo	
  -­‐	
  atuam	
  no	
  processo	
  de	
  digestão	
  intracelular.	
  São	
  pequenos	
  na	
  célula	
  animal,	
  
mas	
  muito	
  grandes	
  em	
  células	
  vegetais.	
  
	
  	
  
Citoplasma	
   -­‐	
   nele	
   está	
   um	
   fluído	
   chamado	
   citosol,	
   O	
   citoplasma	
   tem	
   a	
   função	
   de	
  
albergar	
  as	
  organelas	
  e	
  favorecer	
  seus	
  movimentos.	
  
	
  	
  
Lisossomos	
  -­‐	
  participam	
  da	
  digestão	
  de	
  substâncias	
  orgânicas.	
  
	
  	
  
Centríolos	
  -­‐	
  estão	
  ligados	
  à	
  organização	
  do	
  citoesqueleto	
  e	
  aos	
  movimentos	
  de	
  flagelos	
  
e	
  cilios.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
FRACIONAMENTO	
  CELULAR	
  
	
  
Para	
  facilitar	
  o	
  estudo	
  dos	
  componentes	
  celulares,	
  sua	
  composição	
  e	
  função,	
  é	
  
necessário	
  separá-­‐los.	
  	
  
As	
  células	
  podem	
  ser	
  rompidas	
  de	
  varias	
  maneiras:	
  podem	
  ser	
  submetidas	
  a	
  um	
  
choque	
  osmótico,	
  vibração	
  ultrassônica,	
  forçadas	
  a	
  atravessar	
  um	
  pequeno	
  orifício	
  ou	
  
maceradas.	
  Esses	
  procedimentos	
  rompem	
  varias	
  das	
  membranas	
  da	
  célula	
  em	
  fragmentos	
  que	
  
imediatamente	
  se	
  unem	
  para	
  formar	
  varias	
  vesículas	
  fechadas.	
  	
  
Se	
  aplicados	
  com	
  cuidado,	
  entretanto,	
  os	
  procedimentos	
  de	
  ruptura	
  deixam	
  organelas	
  
como	
  o	
  núcleo,	
  mitocôndria,	
  Golgi,	
  lisossomos	
  e	
  peroxissomos	
  intactas.	
  A	
  suspensão	
  de	
  
células,	
  nesse	
  caso,	
  é	
  reduzida	
  a	
  um	
  caldo	
  grosso	
  (homogenato	
  ou	
  extrato)	
  que	
  contém	
  uma	
  
variedade	
  de	
  organelas	
  envolvidas	
  por	
  membranas,	
  cada	
  qual	
  com	
  tamanho,	
  carga	
  e	
  
densidade	
  diferentes.	
  
Uma	
  vez	
  que	
  o	
  meio	
  de	
  homogeneização	
  tenha	
  sido	
  escolhido	
  com	
  cuidado	
  (por	
  
tentativa	
  e	
  erro	
  para	
  cada	
  organela),	
  os	
  vários	
  componentes	
  –	
  incluindo	
  as	
  vesículas	
  derivadas	
  
do	
  reticulo	
  endoplasmático,	
  chamadas	
  microssomos	
  –	
  retêm	
  a	
  maioria	
  de	
  suas	
  propriedades	
  
bioquímicas	
  originais.	
  
	
  
Centrifugação	
  
	
  
	
   A	
  centrifugação	
  permite	
  a	
  separação	
  dos	
  componentes	
  baseado	
  em	
  seus	
  respectivos	
  
tamanhos	
  e	
  densidades.	
  Numa	
  velocidade	
  constante,	
  os	
  componentes	
  maiores	
  tendem	
  a	
  
sedimentar,	
  e	
  os	
  menores	
  tendem	
  a	
  manter-­‐se	
  no	
  sobrenadante.	
  Devem	
  também	
  ser	
  
considerados	
  são	
  a	
  intensidade	
  da	
  velocidade	
  e	
  o	
  tempo	
  de	
  centrifugação.	
  Ajustando	
  estes	
  
fatores,	
  é	
  possível	
  selecionar	
  isolar	
  a	
  maioria	
  dos	
  componentes	
  por	
  meio	
  de	
  sucessivas	
  
centrifugações,	
  partindo	
  de	
  velocidades	
  e	
  tempos	
  baixos	
  para	
  velocidades	
  e	
  tempos	
  altos.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Centrifugação	
  zonal	
  ou	
  por	
  velocidade	
  de	
  sedimentação	
  
	
  
A	
  centrifugação	
  é	
  a	
  primeira	
  etapa	
  na	
  maioria	
  dos	
  fracionamentos,	
  mas	
  ela	
  separa	
  
somentecomponentes	
  que	
  diferem	
  muito	
  em	
  tamanho.	
  Um	
  grau	
  mais	
  refinado	
  de	
  separação	
  
pode	
  ser	
  alcançado	
  colocando-­‐se	
  o	
  homogenato	
  no	
  topo	
  de	
  uma	
  solução	
  salina	
  diluída	
  dentro	
  
de	
  um	
  tubo	
  de	
  centrífuga,	
  de	
  maneira	
  que	
  forme	
  uma	
  fina	
  camada.	
  
Quando	
  centrifugada,	
  os	
  vários	
  componentes	
  da	
  mistura	
  movem-­‐se	
  como	
  uma	
  serie	
  
de	
  bandas	
  distintas	
  pela	
  solução	
  salina,	
  cada	
  uma	
  a	
  uma	
  velocidade	
  diferente.	
  	
  
Para	
  que	
  o	
  procedimento	
  funcione	
  efetivamente,	
  as	
  bandas	
  devem	
  ser	
  protegidas	
  de	
  
ser	
  misturadas	
  por	
  convecção,	
  o	
  que	
  	
  ocorreria	
  normalmente	
  quando	
  uma	
  solução	
  densa	
  fosse	
  
colocada	
  no	
  topo	
  de	
  uma	
  solução	
  menos	
  densa.	
  Para	
  que	
  tal	
  proteção	
  ocorra,	
  o	
  tubo	
  é	
  
preenchido	
  com	
  um	
  gradiente	
  de	
  sacarose	
  preparado	
  por	
  um	
  misturador	
  especial.	
  
O	
  gradiente	
  de	
  densidade	
  resultante	
  (com	
  a	
  parte	
  mais	
  densa	
  no	
  fundo	
  do	
  tubo)	
  
mantém	
  cada	
  região	
  da	
  solução	
  salina	
  mais	
  densa	
  do	
  que	
  qualquer	
  solução	
  acima	
  dela,	
  
evitando	
  que	
  uma	
  mistura	
  distorça	
  a	
  separação	
  por	
  convecção.	
  
	
  
Centrifugação	
  isopícnica	
  ou	
  sedimentação	
  por	
  equilíbrio	
  
	
  
A	
  ultracentrífuga	
  também	
  é	
  utilizada	
  para	
  separar	
  componentes	
  celulares	
  de	
  acordo	
  
com	
  a	
  sua	
  densidade	
  de	
  flutuação,	
  independentemente	
  do	
  seu	
  tamanho	
  ou	
  forma.	
  	
  
Nesse	
  caso,	
  a	
  amostra	
  é	
  usualmente	
  sedimentada	
  por	
  um	
  gradiente	
  de	
  densidade	
  que	
  
contém	
  uma	
  alta	
  concentração	
  de	
  sal	
  ou	
  de	
  cloreto	
  de	
  césio	
  (CsCl).	
  
Cada	
  componente	
  celular	
  começa	
  a	
  descer	
  pelo	
  gradiente,	
  mas	
  eventualmente	
  alcança	
  
uma	
  posição	
  em	
  que	
  a	
  densidade	
  da	
  solução	
  é	
  igual	
  à	
  sua	
  própria	
  densidade.	
  	
  
Nesse	
  ponto,	
  o	
  componente	
  flutua	
  e	
  não	
  pode	
  mais	
  se	
  mover.	
  Uma	
  serie	
  de	
  bandas	
  
distintas	
  é	
  então	
  produzida	
  no	
  tubo	
  da	
  centrifuga,	
  com	
  as	
  bandas	
  mais	
  próximas	
  do	
  fundo	
  
contendo	
  componentes	
  de	
  maior	
  densidade	
  de	
  sedimentação.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Cromatografia	
  
	
  
A	
  cromatografia	
  	
  é	
  uma	
  técnica	
  quantitativa	
  que	
  tem	
  por	
  finalidade	
  geral	
  a	
  
identificação	
  de	
  substâncias	
  e	
  a	
  separação-­‐purificação	
  de	
  misturas.	
  Usando	
  propriedades	
  
como	
  solubilidade,	
  tamanho	
  e	
  massa,	
  envolve	
  uma	
  série	
  de	
  processos	
  de	
  separação	
  de	
  
misturas.	
  A	
  cromatografia	
  acontece	
  pela	
  passagem	
  de	
  uma	
  mistura	
  através	
  de	
  duas	
  fases:	
  
uma	
  estacionária	
  (fixa)	
  e	
  outra	
  móvel.	
  A	
  grande	
  variabilidade	
  de	
  combinações	
  entre	
  a	
  fase	
  
móvel	
  e	
  estacionária	
  faz	
  com	
  que	
  a	
  cromatografia	
  tenha	
  uma	
  série	
  de	
  técnicas	
  diferenciadas.	
  
	
  
	
   Tipos	
  de	
  cromatografia:	
  
	
   -­‐	
  Partição	
  
	
   	
   .	
  Papel	
  
	
   	
   .	
  Camada	
  fina	
  
	
   -­‐	
  Coluna	
  
	
   	
   .	
  Troca	
  iônica	
  
	
   	
   .	
  Filtração	
  em	
  gel	
  
	
   	
   .	
  Afinidade	
  
	
   -­‐	
  HPLC	
  (High	
  Performance	
  Liquid	
  Cromatography)	
  
	
  
Cromatografia	
  de	
  papel	
  
	
  
	
   Envolve	
  a	
  separação	
  de	
  um	
  soluto	
  entre	
  um	
  solvente	
  ligado	
  firmemente	
  a	
  uma	
  fase	
  
estacionaria	
  polar	
  e	
  um	
  segmento	
  solvente	
  (fase	
  móvel),	
  que	
  se	
  move	
  através	
  da	
  fase	
  
estacionaria.	
  Utiliza-­‐se	
  papel	
  normal	
  ou	
  papel	
  de	
  filtro	
  como	
  suporte	
  da	
  fase	
  estacionaria.	
  
	
   A	
  mistura	
  é	
  aplicada	
  no	
  papel	
  e	
  mergulhada	
  na	
  mistura	
  das	
  fases	
  líquida	
  e	
  estacionária.	
  
A	
  tira	
  de	
  papel	
  de	
  suporte	
  é	
  colocada	
  em	
  um	
  cuba	
  contendo	
  o	
  eluente.	
  Esta	
  fase	
  móvel	
  
(solvente)	
  sobe	
  por	
  capilaridade	
  e	
  arrasta	
  a	
  substância	
  pela	
  qual	
  tem	
  mais	
  afinidade,	
  
separando-­‐a	
  das	
  substâncias	
  com	
  maior	
  afinidade	
  pela	
  fase	
  estacionária.	
  Como	
  a	
  maioria	
  das	
  
substâncias	
  separadas	
  são	
  incolores,	
  utiliza-­‐se	
  um	
  revelador.	
  As	
  manchas	
  podem	
  ser	
  reveladas	
  
por	
  meio	
  de	
  luz	
  UV,	
  vapores	
  de	
  iodo,	
  soluções	
  de	
  cloreto	
  férrico	
  e	
  tiocianoferrato	
  de	
  potássio,	
  
fluorescências,	
  radioatividade,	
  etc.	
  
	
  
	
  
	
  
Cromatografia	
  de	
  camada	
  fina	
  
	
  
	
   A	
  cromatografia	
  planar,	
  também	
  chamada	
  de	
  camada	
  fina,	
  é	
  realizada	
  sobre	
  uma	
  placa	
  
de	
  vidro,	
  plástico	
  ou	
  folha	
  de	
  alumínio,	
  revestida	
  com	
  uma	
  fina	
  camada	
  de	
  material	
  
adsorvente,	
  geralmente	
  sílica	
  em	
  gel,	
  oxido	
  de	
  alumínio	
  ou	
  celulose.	
  Esta	
  camada	
  de	
  
adsorvente	
  é	
  a	
  fase	
  estacionaria.	
  
	
   Depois	
  que	
  a	
  amostra	
  é	
  aplicada	
  sobre	
  a	
  placa,	
  um	
  solvente	
  ou	
  mistura	
  de	
  solventes	
  
(fase	
  móvel)	
  é	
  permeado	
  pela	
  placa	
  por	
  capilaridade.	
  Os	
  diferentes	
  componentes	
  da	
  mistura	
  
percorrem	
  a	
  placa	
  de	
  cromatografia	
  de	
  maneiras	
  diferentes,	
  sendo	
  possível	
  a	
  separação.	
  
	
   A	
  cromatografia	
  de	
  camada	
  fina	
  pode	
  ser	
  usada	
  para	
  monitorar	
  o	
  progresso	
  de	
  reações	
  
químicas,	
  identificar	
  os	
  compostos	
  presentes	
  em	
  uma	
  mistura	
  ou	
  determinar	
  a	
  pureza	
  de	
  uma	
  
substancia.	
  Como	
  exemplos	
  específicos	
  podem	
  ser	
  citados:	
  análise	
  de	
  ceramidas	
  e	
  ácidos	
  
graxos	
  ,	
  a	
  detecção	
  de	
  pesticidas	
  ou	
  inseticidas	
  em	
  alimentos	
  e	
  água	
  ou	
  identificação	
  
de	
  princípios	
  ativos	
  em	
  plantas	
  medicinais	
  ou	
  medicamentos. 
 
Cromatografia	
  em	
  colunas	
  
	
  
	
   Nesse	
  tipo	
  de	
  cromatografia,	
  a	
  amostra	
  –	
  uma	
  solução	
  contendo	
  uma	
  mistura	
  de	
  
diferentes	
  moléculas	
  –	
  é	
  aplicada	
  no	
  topo	
  de	
  uma	
  coluna	
  cilíndrica	
  de	
  vidro	
  ou	
  plástico	
  cheia	
  
de	
  matriz	
  solida	
  permeável,	
  como	
  celulose.	
  
	
   Uma	
  quantidade	
  grande	
  de	
  solvente	
  é	
  então	
  bombeada	
  lentamente	
  através	
  da	
  coluna	
  
e	
  coletada	
  em	
  tubos	
  separados	
  à	
  medida	
  que	
  emerge	
  na	
  parte	
  inferior	
  da	
  coluna.	
  Como	
  vários	
  
componentes	
  da	
  amostra	
  passam	
  pela	
  coluna	
  em	
  diferentes	
  velocidades,	
  eles	
  são	
  fracionados	
  
em	
  diferentes	
  tubos.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Cromatografia	
  de	
  troca	
  iônica	
  
	
  
	
   Na	
  cromatografia	
  de	
  troca	
  iônica,	
  a	
  matriz	
  insolúvel	
  carrega	
  cargas	
  iônicas	
  que	
  
retardam	
  o	
  movimento	
  das	
  moléculas	
  de	
  carga	
  oposta.	
  As	
  matrizes	
  utilizadas	
  para	
  separar	
  
proteínas	
  incluem	
  dietilaminoetilcelulose	
  (DEAE-­‐celulose),	
  que	
  é	
  carregada	
  positivamente,	
  e	
  
carboximetilcelulose	
  (CM-­‐celulose)	
  e	
  fosfocelulose,	
  que	
  são	
  carregadas	
  negativamente.	
  
Matrizes	
  análogas	
  com	
  base	
  em	
  agarose	
  ou	
  outros	
  polímeros	
  também	
  são	
  utilizadas	
  com	
  
frequência.A	
  força	
  entre	
  a	
  associação	
  entre	
  as	
  moléculas	
  dissolvidas	
  e	
  a	
  matriz	
  para	
  troca	
  iônica	
  
depende	
  tanto	
  da	
  força	
  iônica	
  quanto	
  do	
  pH	
  da	
  solução	
  que	
  esta	
  passando	
  pela	
  coluna,	
  que	
  
pode,	
  portanto,	
  ser	
  variada	
  sistematicamente	
  para	
  alcançar	
  uma	
  separação	
  efetiva.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Cromatografia	
  de	
  filtração	
  em	
  gel	
  
	
  
Na	
  cromatografia	
  de	
  filtração	
  em	
  gel,	
  a	
  matriz	
  é	
  inerte,	
  mas	
  porosa.	
  Moléculas	
  que	
  são	
  
suficientemente	
  pequenas	
  para	
  penetrar	
  a	
  matriz	
  retardam	
  e	
  viajam	
  mais	
  lentamente	
  através	
  
da	
  coluna	
  do	
  que	
  moléculas	
  que	
  maiores	
  que	
  não	
  podem	
  penetrar.	
  	
  
	
  
	
  
	
  
Cromatografia	
  de	
  afinidade	
  
	
  
	
   Esse	
  tipo	
  de	
  cromatografia	
  utiliza	
  uma	
  matriz	
  insolúvel	
  covalentemente	
  ligada	
  a	
  um	
  
ligante	
  específico,	
  como	
  um	
  molécula	
  de	
  anticorpo	
  ou	
  um	
  substrato	
  de	
  uma	
  enzima,	
  que	
  ira	
  
ligar	
  uma	
  proteína	
  especifica.	
  
	
   Moléculas	
  de	
  enzimas	
  que	
  se	
  ligam	
  a	
  substratos	
  imobilizados	
  em	
  tais	
  colunas	
  podem	
  
ser	
  eluidas	
  com	
  uma	
  solução	
  concentrada	
  da	
  forma	
  livre	
  da	
  molécula	
  do	
  substrato,	
  enquanto	
  
moléculas	
  que	
  se	
  ligam	
  a	
  anticorpos	
  imobilizados	
  podem	
  ser	
  eluidas	
  dissociando-­‐se	
  o	
  
complexo	
  antígeno-­‐anticorpo	
  com	
  soluções	
  concentradas	
  de	
  sais	
  ou	
  soluções	
  com	
  Ph	
  alto	
  ou	
  
baixo.	
  
	
  Altos	
  graus	
  de	
  purificação	
  são	
  frequentemente	
  alcançados	
  em	
  um	
  único	
  passo	
  por	
  
uma	
  coluna	
  de	
  afinidade.	
  
	
  
	
  
	
  
HPLC	
  –	
  High	
  Performance	
  Liquid	
  Cromatography	
  
	
  
É	
  um	
  tipo	
  de	
  cromatografia	
  líquida	
  que	
  emprega	
  pequenas	
  colunas,	
  recheadas	
  de	
  
materiais	
  especialmente	
  preparados	
  e	
  uma	
  fase	
  móvel	
  que	
  é	
  eluída	
  sobre	
  altas	
  pressões.	
  Ela	
  
tem	
  a	
  capacidade	
  de	
  realizar	
  separações	
  e	
  análises	
  quantitativas	
  de	
  uma	
  grande	
  quantidade	
  de	
  
compostos	
  presentes	
  em	
  vários	
  tipos	
  de	
  amostras,	
  em	
  escala	
  de	
  tempo	
  de	
  poucos	
  minutos,	
  
com	
  alta	
  resolução,	
  eficiência	
  e	
  sensibilidade.	
  
Resumo	
  do	
  procedimento:	
  
•	
  A	
  amostra	
  é	
  dissolvida	
  em	
  um	
  solvente	
  e	
  introduzida	
  na	
  coluna	
  cromatográfica	
  
preenchida	
  com	
  a	
  fase	
  estacionária	
  (FE)	
  	
  
•	
  Um	
  solvente	
  (FM)	
  é	
  bombeado	
  com	
  vazão	
  constante	
  e	
  desloca	
  os	
  componentes	
  da	
  
mistura	
  através	
  da	
  coluna.	
  Esses	
  se	
  distribuem	
  entre	
  as	
  duas	
  fases	
  de	
  acordo	
  com	
  suas	
  
afinidades	
  	
  
•	
  As	
  substâncias	
  com	
  maior	
  afinidade	
  com	
  a	
  FE	
  movem-­‐se	
  mais	
  lentamente.	
  Já	
  as	
  
substâncias	
  com	
  pouca	
  afinidade	
  com	
  a	
  FE	
  movem-­‐se	
  mais	
  rapidamente.	
  	
  
•	
  Ao	
  sair	
  da	
  coluna,	
  os	
  componentes	
  passam	
  por	
  um	
  detector	
  que	
  emite	
  um	
  sinal	
  
elétrico	
  o	
  qual	
  é	
  registrado,	
  constituindo	
  um	
  cromatograma.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Eletroforese	
  em	
  gel	
  
	
  
As	
  proteínas	
  normalmente	
  possuem	
  carga	
  positiva	
  ou	
  negativa,	
  dependendo	
  da	
  
mistura	
  de	
  aminoácidos	
  carregados	
  que	
  elas	
  contêm.	
  Um	
  campo	
  elétrico	
  aplicado	
  a	
  uma	
  
solução	
  que	
  contem	
  uma	
  molécula	
  proteica	
  faz	
  com	
  que	
  a	
  proteína	
  migre	
  a	
  uma	
  velocidade	
  
que	
  depende	
  da	
  sua	
  carga	
  liquida,	
  do	
  seu	
  tamanho	
  e	
  sua	
  forma.	
  	
  
A	
  aplicação	
  mais	
  popular	
  dessa	
  propriedade	
  é	
  a	
  eletroforese	
  em	
  gel	
  de	
  poliacrilamida-­‐
SDS	
  (SDS-­‐PAGE).	
  Ela	
  utiliza	
  um	
  gel	
  de	
  poliacrilamida	
  de	
  ligações	
  altamente	
  cruzadas	
  como	
  uma	
  
matriz	
  inerte,	
  pela	
  qual	
  as	
  proteínas	
  migram.	
  O	
  gel	
  é	
  preparado	
  pela	
  polimerização	
  de	
  
monômeros;	
  o	
  tamanho	
  do	
  poro	
  do	
  gel	
  pode	
  ser	
  ajustado	
  de	
  maneira	
  que	
  seja	
  
suficientemente	
  pequeno	
  para	
  retardar	
  a	
  migração	
  das	
  moléculas	
  proteicas	
  de	
  interesse.	
  
As	
  próprias	
  proteínas	
  não	
  estão	
  em	
  uma	
  simples	
  solução	
  aquosa,	
  mas	
  em	
  uma	
  solução	
  
que	
  inclui	
  um	
  detergente	
  fortemente	
  carregado	
  negativamente,	
  o	
  dodecil	
  	
  sulfato	
  de	
  sódio	
  
(SDS).	
  Como	
  esse	
  detergente	
  se	
  liga	
  a	
  regiões	
  hidrofóbicas	
  das	
  moléculas	
  proteicas,	
  causando	
  
o	
  seu	
  desdobramento	
  em	
  cadeias	
  polipeptídicas	
  estendidas,	
  as	
  moléculas	
  proteicas	
  individuais	
  
são	
  liberadas	
  de	
  suas	
  associações	
  com	
  outras	
  proteínas	
  ou	
  moléculas	
  lipídicas	
  tornando-­‐se	
  
completamente	
  solúveis	
  na	
  solução	
  detergente.	
  Além	
  disso,	
  um	
  agente	
  redutor	
  como	
  o	
  beta-­‐
mercaptoetanol	
  normalmente	
  é	
  adicionado	
  para	
  quebrar	
  quaisquer	
  ligações	
  S-­‐S	
  nas	
  proteínas,	
  
de	
  forma	
  que	
  todos	
  os	
  polipeptídeos	
  constituintes,	
  presentes	
  em	
  múltiplas	
  subunidades,	
  
possam	
  ser	
  analisados	
  separadamente.	
  
Cada	
  molécula	
  de	
  proteínas	
  se	
  liga	
  a	
  um	
  grande	
  numero	
  de	
  moléculas	
  do	
  detergente	
  
carregado	
  negativamente,	
  que	
  supera	
  a	
  carga	
  intrínseca	
  da	
  proteína	
  e	
  faz	
  com	
  que	
  ela	
  migre	
  
em	
  direção	
  ao	
  eletrodo	
  positivo,	
  quando	
  uma	
  voltagem	
  é	
  aplicada.	
  Proteínas	
  do	
  mesmo	
  
tamanho	
  tendem	
  a	
  migrar	
  pelo	
  gel	
  com	
  velocidades	
  similares,	
  pois	
  sua	
  estrutura	
  nativa	
  está	
  
completamente	
  desdobrada	
  pelo	
  SDS	
  e	
  se	
  ligam	
  à	
  mesma	
  quantidade	
  de	
  SDS,	
  tendo,	
  portanto,	
  
a	
  mesma	
  quantidade	
  de	
  cargas	
  negativas.	
  Proteínas	
  maiores,	
  com	
  mais	
  carga,	
  são	
  submetidas	
  
a	
  forças	
  elétricas	
  maiores	
  e	
  também	
  a	
  um	
  retardamento	
  maior.	
  
Livres	
  em	
  solução,	
  os	
  dois	
  efeitos	
  seriam	
  anulados,	
  mas	
  nas	
  malhas	
  do	
  gel	
  de	
  
poliacrilamida,	
  que	
  age	
  como	
  peneira	
  molecular,	
  as	
  proteínas	
  maiores	
  são	
  retardadas	
  muito	
  
mais	
  do	
  que	
  as	
  menores.	
  Como	
  resultado,	
  uma	
  mistura	
  complexa	
  de	
  proteínas	
  é	
  fracionada	
  
em	
  uma	
  serie	
  de	
  discretas	
  bandas	
  de	
  proteínas	
  arranjadas	
  de	
  acordo	
  com	
  sua	
  massa	
  
molecular.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Espectrometria	
  de	
  massa	
  
	
  
A	
  espectrometria	
  de	
  massas	
  (mass	
  spectrometry)	
  é	
  uma	
  poderosa	
  ferramenta	
  física	
  
que	
  caracteriza	
  as	
  moléculas	
  pela	
  medida	
  da	
  relação	
  massa/carga	
  de	
  seus	
  íons.	
  Ela	
  foi	
  usada,	
  
inicialmente,	
  na	
  determinação	
  de	
  massas	
  atômicas	
  e,	
  vem	
  sendo	
  empregada	
  na	
  busca	
  de	
  
informações	
  sobre	
  a	
  estrutura	
  de	
  compostos	
  orgânicos,	
  na	
  análise	
  de	
  misturas	
  orgânicas	
  
complexas,	
  na	
  análise	
  elementar	
  e	
  na	
  determinação	
  da	
  composição	
  isotópica	
  dos	
  elementos.	
  A	
  
espectrometria	
  de	
  massas	
  acoplada	
  (MS/MS)	
  é	
  uma	
  técnica	
  analítica	
  poderosa,	
  usada	
  para	
  
identificar	
  compostos	
  desconhecidos,quantificar	
  compostos	
  conhecidos	
  e	
  auxiliar	
  na	
  
elucidação	
  estrutural	
  de	
  moléculas.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
MICROSCOPIA	
  DE	
  LUZ	
  
	
  
Microscópio	
  óptico	
  comum	
  
	
  
Limite	
  de	
  resolução	
  –	
  limite	
  de	
  separação	
  pelo	
  qual	
  dois	
  objetos	
  ainda	
  podem	
  ser	
  vistos	
  como	
  
distintos.	
  Depende	
  do	
  comprimento	
  de	
  onda	
  da	
  luz	
  e	
  da	
  abertura	
  numérica	
  do	
  sistema	
  de	
  
lentes	
  utilizado.	
  
	
  
	
  
Abertura	
  numérica	
  –	
  é	
  uma	
  medida	
  da	
  largura	
  da	
  abertura	
  do	
  microscópio,	
  graduada	
  de	
  
acordo	
  com	
  sua	
  distância	
  a	
  partir	
  do	
  objeto	
  que	
  pode	
  ser	
  visualizado.	
  
	
  
	
  
ð Nas	
  melhores	
  condições,	
  com	
  luz	
  violeta	
  (comprimento	
  de	
  onda	
  =	
  0,4	
  µm)	
  e	
  uma	
  
abertura	
  numérica	
  de	
  1,4,	
  o	
  microscópio	
  óptico	
  pode	
  alcançar,	
  teoricamente,	
  um	
  
limite	
  de	
  resolução	
  logo	
  abaixo	
  de	
  0,2	
  µm.	
  
	
  
Caminho	
  da	
  luz	
  no	
  microscópio	
  óptico	
  
	
  
	
  
	
  
Preparação	
  de	
  amostras	
  
	
  
1) Fixação	
  –	
  estabilização	
  do	
  material	
  preservando	
  a	
  sua	
  estrutura.	
  A	
  fixação	
  torna	
  as	
  
células	
  permeáveis	
  aos	
  corantes	
  e	
  produz	
  uma	
  ligação	
  cruzada	
  entre	
  as	
  suas	
  
macromoléculas,	
  de	
  maneira	
  que	
  sejam	
  estabilizadas	
  e	
  presas	
  à	
  sua	
  posição.	
  Em	
  
seguida,	
  é	
  feito	
  tratamento	
  com	
  aldeídos	
  reativos,	
  em	
  particular	
  formaldeído	
  e	
  
gluteraldeído,	
  que	
  formam	
  ligações	
  covalentes	
  com	
  os	
  grupos	
  de	
  aminoácidos	
  
livres	
  de	
  proteínas,	
  produzindo	
  ligações	
  cruzadas	
  comas	
  moléculas	
  de	
  proteínas	
  
adjacentes.	
  (podem	
  ser	
  usados	
  ainda	
  calor,	
  solventes	
  orgânicos	
  e	
  ácidos)	
  
	
  
2) Desidratação	
  –	
  substituição	
  da	
  água	
  por	
  soluções	
  miscíveis	
  no	
  meio	
  de	
  inclusão	
  
(álcool	
  ou	
  acetona).	
  
	
  
3) Inclusão	
  –	
  os	
  tecidos	
  precisam	
  ser	
  embebidos	
  em	
  um	
  meio	
  de	
  suporte	
  antes	
  de	
  ser	
  
seccionado	
  (ceras	
  de	
  resinas	
  plásticas,	
  	
  sendo	
  parafina	
  a	
  mais	
  usada).	
  A	
  resina	
  é	
  
endurecida	
  por	
  resfriamento	
  ou	
  polimerização,	
  formando	
  um	
  bloco	
  pronto	
  para	
  
ser	
  seccionado	
  pelo	
  micrótomo.	
  
	
  
4) Microtomia	
  –	
  aparelho	
  que	
  corta	
  as	
  amostras	
  em	
  fatias	
  muito	
  finas.	
  As	
  secções,	
  
geralmente	
  com	
  1	
  a	
  10	
  µm	
  de	
  espessura	
  são	
  colocadas	
  na	
  superfície	
  de	
  uma	
  
lamina	
  de	
  vidro.	
  
	
  
5) Coloração	
  –	
  é	
  necessária	
  para	
  a	
  contrastação	
  da	
  amostra,	
  que	
  permite	
  a	
  obtenção	
  
de	
  mais	
  detalhes	
  na	
  visualização.	
  Os	
  corantes	
  utilizados	
  na	
  microscopia	
  de	
  luz	
  são	
  
geralmente	
  ácidos	
  (Eosina,	
  Orange	
  G,	
  Fucsina)	
  ou	
  básicos	
  (azul	
  de	
  toluidina,	
  azul	
  
de	
  metileno,	
  hematoxilina).	
  
	
  
6) Análise	
  –	
  amostra	
  pronta.	
  
Microscopia	
  de	
  fluorescência	
  
	
  
O	
  microscópio	
  de	
  fluorescência	
  é	
  semelhante	
  a	
  um	
  microscópio	
  óptico	
  comum,	
  exceto	
  que	
  a	
  
luz	
  utilizada	
  para	
  iluminação	
  (originada	
  de	
  uma	
  fonte	
  muito	
  potente)	
  passa	
  através	
  de	
  dois	
  
conjuntos	
  de	
  filtros:	
  um	
  para	
  filtrar	
  a	
  luz	
  antes	
  de	
  ela	
  atingir	
  a	
  amostra,	
  e	
  outro	
  para	
  filtrar	
  a	
  
luz	
  que	
  já	
  passou	
  pela	
  amostra.	
  
O	
  primeiro	
  filtro	
  é	
  selecionado	
  de	
  forma	
  que	
  permita	
  apenas	
  a	
  passagem	
  de	
  comprimentos	
  de	
  
onda	
  que	
  excitem	
  um	
  determinado	
  corante	
  fluorescente.	
  Já	
  o	
  segundo	
  filtro	
  bloqueia	
  a	
  
passagem	
  de	
  sinais	
  fluorescentes	
  indesejáveis,	
  permitindo	
  somente	
  a	
  passagem	
  dos	
  
comprimentos	
  de	
  onda	
  específicos	
  de	
  quando	
  o	
  corante	
  floresce.	
  
	
  
	
  
	
  
A	
  imagem	
  observada	
  é	
  resultado	
  da	
  radiação	
  eletromagnética	
  emitida	
  pelas	
  moléculas	
  que	
  
absorveram	
  a	
  excitação	
  primária	
  e	
  reemitiram	
  uma	
  luz	
  com	
  maior	
  comprimento	
  de	
  onda.	
  
O	
  principal	
  uso	
  do	
  microscópio	
  de	
  fluorescência	
  é	
  na	
  localização	
  de	
  substancias	
  especificas	
  no	
  
interior	
  da	
  célula	
  com	
  o	
  uso	
  de	
  substancias	
  fluorescentes	
  com	
  certa	
  afinidade	
  a	
  um	
  dos	
  
componentes	
  celulares	
  ou	
  anticorpos	
  conjugados	
  a	
  substancias	
  fluorescentes	
  para	
  a	
  detecção	
  
de	
  proteínas	
  especificas.	
  A	
  microscopia	
  de	
  fluorescência	
  permite	
  a	
  utilização	
  de	
  células	
  vivas	
  
ou	
  mortas.	
  
Principais	
  corantes	
  
.	
  Fluoresceína	
  –	
  emite	
  uma	
  fluorescência	
  verde	
  intensa	
  quando	
  excitado	
  com	
  luz	
  azul.	
  
.	
  Rodamina	
  –	
  emite	
  fluorescência	
  vermelha	
  quando	
  excitada	
  com	
  luz	
  amarelo-­‐esverdeada.	
  
	
  
Proteínas	
  fluorescentes	
  –	
  proteínas	
  que	
  emitem	
  fluorescência	
  na	
  faixa	
  do	
  laranja	
  e	
  vermelho,	
  
extraídas	
  de	
  animais	
  marinhos.	
  
	
  
	
  
	
  Microscopia	
  de	
  contraste	
  de	
  fase	
  
	
  
O	
  microscópio	
  de	
  contraste	
  de	
  fase	
  permite	
  a	
  visualização	
  com	
  detalhes	
  de	
  amostras	
  vivas	
  e	
  
não-­‐coradas.	
  É	
  possível	
  observar	
  os	
  processos	
  celulares	
  a	
  medida	
  que	
  acontecem.	
  
Quando	
  a	
  luz	
  atravessa	
  uma	
  célula	
  viça,	
  a	
  fase	
  da	
  onda	
  de	
  luz	
  é	
  alterada	
  de	
  acordo	
  com	
  o	
  
índice	
  de	
  refração	
  da	
  célula:	
  a	
  luz	
  que	
  passa	
  através	
  de	
  uma	
  parte	
  relativamente	
  espessa	
  ou	
  
densa	
  da	
  célula,	
  como	
  o	
  núcleo,	
  é	
  retardada.	
  Sua	
  fase,	
  consequentemente,	
  é	
  deslocada	
  em	
  
relação	
  à	
  luz	
  que	
  passou	
  por	
  uma	
  região	
  mais	
  delgada	
  do	
  citoplasma.	
  
O	
  microscópio	
  de	
  contraste	
  de	
  fase	
  explora	
  os	
  efeitos	
  de	
  interferência	
  produzidos	
  quando	
  
esses	
  dois	
  conjuntos	
  de	
  ondas	
  se	
  recombinam,	
  criando	
  uma	
  imagem	
  estrutural	
  da	
  célula.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Microscopia	
  de	
  campo	
  escuro	
  
	
  
Na	
  microscopia	
  de	
  campo	
  escuro,	
  o	
  espécime	
  é	
  iluminado	
  de	
  tal	
  forma	
  que	
  somente	
  a	
  luz	
  
desviada	
  por	
  ele	
  pode	
  ser	
  vista:	
  a	
  luz	
  do	
  fundo	
  não	
  passa.	
  A	
  amostra	
  parece	
  luminescente	
  
contra	
  um	
  fundo	
  escuro.	
  
Entre	
  a	
  fonte	
  de	
  luz	
  e	
  a	
  lente	
  condensadora	
  é	
  encontrado	
  um	
  disco	
  opaco.	
  Este	
  disco	
  não	
  
permite	
  que	
  toda	
  a	
  luz	
  emitida	
  seja	
  passada	
  para	
  a	
  lente	
  condensadora:	
  apenas	
  uma	
  pequena	
  
fração	
  da	
  luz	
  passa.	
  É	
  ajustado	
  de	
  tal	
  forma	
  que	
  somente	
  a	
  luz	
  que	
  atingiu	
  a	
  amostra	
  chegue	
  
ao	
  olho	
  do	
  observador.	
  O	
  restante	
  da	
  luz	
  é	
  desviado	
  pelas	
  laterais.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Microscopia	
  confocal	
  
	
  
Na	
  microscopia	
  confocal,	
  ocorre	
  a	
  focalização	
  de	
  um	
  plano	
  especifico	
  de	
  cada	
  vez,	
  ao	
  contrario	
  
dos	
  outros	
  tipos	
  de	
  microscópio.	
  Assim,	
  é	
  possível	
  montaruma	
  imagem	
  tridimensional	
  ou	
  
bidimensional	
  com	
  maior	
  quantidade	
  de	
  detalhes.	
  A	
  focalização	
  acontece	
  por	
  meio	
  do	
  
intermédio	
  de	
  um	
  feixe	
  de	
  laser,	
  que	
  é	
  dividido	
  por	
  um	
  divisor	
  de	
  feixes.	
  Os	
  feixes	
  
provenientes	
  da	
  divisão	
  alcançam	
  um	
  espelho	
  dicroico,	
  que	
  os	
  refletem	
  para	
  diferentes	
  pontos	
  
da	
  amostra.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
CULTURA	
  DE	
  CÉLULAS	
  
	
  
	
   Embora	
  as	
  organelas	
  e	
  as	
  moléculas	
  grandes	
  em	
  uma	
  célula	
  podem	
  ser	
  visualizadas	
  
com	
  microscópios,	
  entender	
  como	
  esses	
  componentes	
  funcionam	
  requer	
  uma	
  analise	
  
bioquímica	
  detalhada.	
  A	
  maioria	
  dos	
  procedimentos	
  bioquímicos	
  requer	
  que	
  grandes	
  
quantidades	
  de	
  células	
  sejam	
  rompidas	
  fisicamente	
  para	
  se	
  ter	
  acesso	
  aos	
  seus	
  componentes.	
  
	
   Para	
  obter	
  o	
  máximo	
  de	
  informações	
  possíveis	
  sobre	
  células	
  em	
  um	
  tecido,	
  deve-­‐se	
  
dissociar	
  as	
  células	
  do	
  tecido	
  e	
  separa-­‐las	
  de	
  acordo	
  com	
  o	
  tipo.	
  Essas	
  manipulações	
  resultam	
  
em	
  uma	
  população	
  relativamente	
  homogênea,	
  que	
  será	
  proliferada	
  em	
  uma	
  cultura	
  de	
  células.	
  
	
   A	
  cultura	
  de	
  células	
  é	
  importante	
  pois	
  pode-­‐se	
  fazer	
  um	
  estudo	
  aprofundado	
  de	
  
fatores	
  como	
  expressão	
  gênica,	
  câncer	
  e	
  fatores	
  de	
  crescimento.	
  Além	
  disso,	
  as	
  culturas	
  
permitem	
  fazer	
  a	
  manutenção	
  de	
  patógenos	
  intracelulares	
  e	
  permitem	
  estudo	
  e	
  
desenvolvimento	
  de	
  células-­‐tronco.	
  
	
   Os	
  passos	
  para	
  se	
  produzir	
  uma	
  cultura	
  são	
  o	
  isolamento	
  de	
  tecidos,	
  esterilização	
  da	
  
superfície,	
  dissociação	
  das	
  células	
  (usando	
  centrifugação)	
  e,	
  finalmente,	
  colocá-­‐las	
  em	
  um	
  
meio	
  de	
  cultura.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Cultura	
  de	
  células	
  primária	
  
	
  
	
   Culturas	
  de	
  células	
  primarias	
  	
  são	
  culturas	
  preparadas	
  diretamente	
  a	
  partir	
  dos	
  tecidos	
  
de	
  um	
  organismo.	
  Elas	
  podem	
  ser	
  feitas	
  com	
  ou	
  sem	
  uma	
  etapa	
  inicial	
  de	
  fracionamento	
  para	
  
separar	
  diferentes	
  tipos	
  de	
  células.	
  As	
  células	
  em	
  culturas	
  primarias	
  têm	
  expectativa	
  de	
  vida	
  
muito	
  baixa	
  e,	
  por	
  isso,	
  devem	
  ter	
  uso	
  imediato.	
  Uma	
  vantagem	
  disso,	
  porém,	
  é	
  que	
  não	
  é	
  
preciso	
  esforço	
  para	
  mantê-­‐las	
  vivas.	
  
	
  
Linhagem	
  de	
  células	
  contínua	
  
	
  
	
   Ao	
  contrario	
  da	
  cultura	
  de	
  células	
  primaria,	
  a	
  linhagem	
  contínua	
  visa	
  a	
  preservação	
  das	
  
células,	
  que	
  são	
  cuidadosamente	
  inseridas	
  num	
  meio	
  vital.	
  A	
  linhagem	
  continua	
  permite	
  a	
  
execução	
  de	
  experimentos	
  homogêneos	
  e	
  repetitivos.	
  
	
  
Meios	
  definidos	
  e	
  meios	
  complexos	
  
	
  
	
   O	
  meio	
  em	
  que	
  se	
  insere	
  a	
  cultura	
  de	
  células	
  pode	
  ser	
  definido	
  ou	
  complexo.	
  	
  
Os	
  meios	
  definidos	
  possuem	
  composição	
  química	
  não	
  só	
  conhecida,	
  mas	
  também	
  
precisa.	
  Nestes	
  meios,	
  é	
  praticamente	
  certo	
  que	
  pode-­‐se	
  obter	
  uma	
  linhagem	
  contínua.	
  
Os	
  meios	
  complexos	
  tendem	
  à	
  desordem.	
  São	
  quimicamente	
  indefinidos,	
  usados	
  
principalmente	
  para	
  o	
  cultivo	
  de	
  rotina	
  em	
  laboratórios.	
  Não	
  há	
  muita	
  preocupação	
  com	
  a	
  
inserção	
  de	
  componentes	
  de	
  modo	
  preciso,	
  tanto	
  que	
  são	
  adicionados	
  produtos	
  naturais,	
  
como	
  extrato	
  de	
  leveduras,	
  carnes	
  e	
  plantas.	
  
	
  
Fatores	
  físicos	
  necessários	
  para	
  o	
  crescimento	
  	
  
	
  
-­‐	
  Temperatura	
  
	
   Existem	
  as	
  temperaturas	
  mínimas,	
  ótimas	
  e	
  máximas	
  para	
  o	
  crescimento	
  das	
  culturas.	
  
A	
  temperatura	
  ideal	
  (ótima)	
  para	
  o	
  crescimento	
  da	
  maioria	
  das	
  células	
  é	
  de	
  37	
  ºC.	
  Isso	
  
acontece	
  porque	
  essa	
  temperatura	
  é	
  aquela	
  em	
  que	
  as	
  enzimas	
  celulares	
  possuem	
  máximo	
  
rendimento.	
  
	
  
	
  
-­‐	
  pH	
  
	
   Assim	
  como	
  a	
  temperatura,	
  o	
  pH	
  possui	
  faixas	
  mínimas,	
  ótimas	
  e	
  máximas.	
  Em	
  geral,	
  a	
  
faixa	
  ótima	
  é	
  a	
  média	
  entre	
  a	
  máxima	
  e	
  a	
  mínima.	
  Se	
  o	
  pH	
  for	
  maior	
  que	
  a	
  faixa	
  máxima,	
  ou	
  
menor	
  que	
  a	
  faixa	
  mínima,	
  as	
  enzimas	
  perdem	
  suas	
  funções	
  e	
  as	
  células	
  morrem.	
  
Independentemente	
  do	
  pH	
  externo,	
  as	
  células	
  costumam	
  manter	
  o	
  pH	
  neutro	
  em	
  seu	
  interior.	
  
O	
  pH	
  pode	
  mudar	
  dependendo	
  do	
  crescimento	
  da	
  cultura,	
  ou	
  se	
  esta	
  for	
  contaminada.	
  
	
  
-­‐	
  Atmosfera	
  gasosa	
  
	
   As	
  células	
  precisam	
  de	
  diferentes	
  concentrações	
  de	
  O2,	
  CO2,	
  N2	
  e	
  CH4	
  para	
  sobreviver	
  
em	
  ambiente	
  natural.	
  Dependendo	
  da	
  adaptação	
  e	
  resposta	
  à	
  presença	
  de	
  oxigênio,	
  as	
  células	
  
podem	
  ser	
  classificadas	
  em	
  aeróbios,	
  microaerófilos,	
  facultativos	
  e	
  anaeróbios.	
  
	
  
	
  
-­‐	
  Pressão	
  osmótica	
  
	
   A	
  solução	
  deve	
  ser	
  isotônica	
  dentro	
  e	
  fora	
  da	
  célula,	
  para	
  que	
  a	
  pressão	
  osmótica	
  se	
  
estabilize.	
  Caso	
  a	
  solução	
  que	
  envolve	
  a	
  célula	
  seja	
  hipertônica	
  (muito	
  concentrada),	
  ocorre	
  
saída	
  de	
  água	
  da	
  célula,	
  o	
  que	
  inibe	
  seu	
  crescimento.	
  Caso	
  contrario,	
  há	
  entrada	
  de	
  água	
  em	
  
excesso,	
  o	
  que	
  pode	
  fazer	
  com	
  que	
  a	
  membrana	
  plasmática	
  se	
  rompa,	
  causando	
  a	
  morte	
  da	
  
célula.	
  
	
  
	
  
Curva	
  de	
  crescimento	
  
	
  
	
  
	
  
-­‐	
  Fase	
  lag:	
  é	
  a	
  fase	
  latente,	
  em	
  que	
  não	
  ocorre	
  replicação	
  imediata.	
  Ocorre	
  síntese	
  de	
  
DNA	
  expressão	
  gênica	
  e	
  a	
  produção	
  das	
  enzimas	
  necessárias	
  para	
  a	
  futura	
  divisão.	
  
-­‐	
  Fase	
  log:	
  é	
  a	
  fase	
  em	
  que	
  se	
  inicia	
  a	
  divisão	
  celular,	
  causando	
  um	
  crescimento	
  
exponencial	
  nos	
  indivíduos	
  da	
  cultura,	
  até	
  que	
  o	
  tempo	
  de	
  geração	
  atinja	
  um	
  valor	
  constante.	
  
É	
  o	
  período	
  de	
  maior	
  atividade	
  metabólica	
  das	
  células.	
  
-­‐	
  Fase	
  estacionária:	
  é	
  o	
  fim	
  do	
  crescimento	
  exponencial.	
  A	
  velocidade	
  de	
  crescimento	
  
diminui	
  tanto	
  que	
  a	
  população	
  torna-­‐se	
  estável,	
  ou	
  seja,	
  a	
  taxa	
  de	
  morte	
  celular	
  é	
  a	
  mesma	
  
taxa	
  de	
  surgimento	
  de	
  novas	
  células.	
  A	
  atividade	
  metabólica	
  decresce	
  consideravelmente	
  
devido	
  ao	
  término	
  de	
  nutrientes,	
  ao	
  acúmulo	
  de	
  produtos	
  de	
  degradação	
  e	
  à	
  alterações	
  no	
  pH	
  
do	
  meio.	
  
-­‐	
  Declínio:	
  a	
  taxa	
  de	
  morte	
  celular	
  aumenta	
  bastante,	
  sendo	
  ainda	
  maior	
  que	
  a	
  taxa	
  de	
  
surgimento	
  de	
  novas	
  células.	
  Essa	
  fase	
  decorre	
  até	
  que	
  a	
  população	
  desapareça	
  totalmente.	
  
Caracteriza	
  o	
  fim	
  da	
  cultura.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
TÉCNICAS	
  IMUNOLÓGICAS	
  
	
  
Proteínas	
  
	
   	
  
	
   São	
  polímeros	
  de	
  aminoácidos	
  que	
  podem	
  obter	
  diferentes	
  estruturas	
  dependendo	
  de	
  
seu	
  tamanhoe	
  ligações	
  entre	
  as	
  moléculas.	
  Essas	
  podem	
  ser	
  primárias,	
  secundárias,	
  terciárias	
  
ou	
  quaternárias,	
  sendo	
  que	
  cada	
  nível	
  de	
  organização	
  maior	
  é	
  formado	
  por	
  um	
  conjunto	
  de	
  
níveis	
  de	
  organização	
  menores.	
  
	
  
	
  
	
  
Anticorpos	
  
	
  
	
   Anticorpos	
  ou	
  imunoglobulinas	
  são	
  glicoproteínas	
  sintetizadas	
  e	
  excretadas	
  por	
  
células	
  plasmáticas	
  derivadas	
  dos	
  linfócitos	
  B,	
  os	
  plasmócitos,	
  presentes	
  no	
  plasma,	
  tecidos	
  e	
  
secreções	
  que	
  atacam	
  proteínas	
  estranhas	
  ao	
  corpo,	
  chamadas	
  de	
  antígenos,	
  realizando	
  assim	
  
a	
  defesa	
  do	
  organismo	
  (imunidade	
  humoral).	
  Depois	
  que	
  o	
  sistema	
  imunológico	
  entra	
  em	
  
contato	
  com	
  um	
  antígeno,	
  são	
  produzidos	
  anticorpos	
  específicos	
  contra	
  ele.	
  
	
   Há	
  cinco	
  classes	
  de	
  imunoglobulina	
  com	
  função	
  de	
  anticorpo:	
  IgA,	
  IgD,	
  IgE,	
  IgG	
  e	
  IgM.	
  
Os	
  diferentes	
  tipos	
  se	
  diferenciam	
  pelas	
  suas	
  propriedades	
  biológicas,	
  localizações	
  funcionais	
  e	
  
habilidade	
  para	
  lidar	
  com	
  diferentes	
  antígenos.	
  
	
   -­‐	
  IgM	
  –	
  constitui	
  10%	
  dos	
  anticorpos	
  do	
  plasma	
  sanguíneo,	
  existindo	
  na	
  maior	
  parte	
  
das	
  vezes,	
  sob	
  a	
  forma	
  de	
  pentâmero	
  (combinação	
  de	
  cinco	
  moléculas).	
  Este	
  imunoglobulina	
  
é	
  a	
  predominante	
  no	
  início	
  das	
  respostas	
  imunitárias.	
  
	
  
	
  
	
   -­‐	
  IgG	
  –	
  é	
  a	
  imunoglobulina	
  mais	
  abundante	
  na	
  corrente	
  sanguínea,	
  constituindo	
  cerca	
  
de	
  75%	
  das	
  imunoglobulinas	
  presentes	
  no	
  plasma.	
  Serve	
  como	
  modelo	
  para	
  as	
  outras	
  classes.	
  
Formada	
  por	
  duas	
  cadeias	
  leves	
  idênticas	
  e	
  duas	
  cadeias	
  pesadas,	
  também	
  idênticas,	
  ligadas	
  
por	
  pontes	
  de	
  dissulfeto	
  e	
  forças	
  não-­‐covalentes.	
  É	
  a	
  responsável	
  pela	
  resposta	
  imunitária	
  a	
  
longo	
  prazo	
  (resposta	
  secundária).	
  
	
  
	
  
	
   -­‐	
  IgA	
  –	
  é	
  encontrado	
  em	
  áreas	
  de	
  mucosas,	
  como	
  os	
  intestinos,	
  trato	
  
respiratório	
  e	
  trato	
  urogenital,	
  prevenindo	
  sua	
  colonização	
  por	
  patógenos.	
  É	
  passado	
  para	
  o	
  
neonato	
  via	
  aleitamento.	
  
	
  
	
   -­‐	
  IgE	
  –	
  geralmente	
  está	
  na	
  forma	
  de	
  monômero,	
  possui	
  grande	
  afinidade	
  para	
  
receptores	
  localizados	
  na	
  membrana	
  de	
  mastócitos	
  e	
  basófilos.	
  Após	
  estas	
  moléculas	
  de	
  
imunoglobulinas	
  serem	
  secretadas	
  pelos	
  plasmócitos,	
  elas	
  irão	
  se	
  prender	
  àqueles	
  receptores,	
  
praticamente	
  desaparecendo	
  no	
  plasma.	
  A	
  reação	
  alérgica	
  é	
  mediada	
  pela	
  atividade	
  desta	
  
imunoglobulina	
  e	
  dos	
  alérgenos	
  que	
  estimulam	
  sua	
  produção.	
  
	
  
	
   -­‐	
  IgD	
  –	
  sua	
  função	
  principal	
  ainda	
  não	
  foi	
  esclarecida.	
  Está	
  presente	
  no	
  plasma	
  
sanguíneo	
  em	
  concentrações	
  muito	
  baixas,	
  representando	
  apenas	
  0,2%	
  do	
  total	
  de	
  
imunoglobulinas.	
  Esta	
  molécula,	
  juntamente	
  com	
  a	
  IgM,	
  está	
  presente	
  na	
  superfície	
  dos	
  
linfócitos	
  B	
  participando	
  da	
  diferenciação	
  desta	
  célula.	
  
	
  
ELISA	
  
	
  
	
   O	
  ELISA	
  (Enzyme-­‐linked	
  immuno	
  sorbent	
  assay)	
  é	
  um	
  dos	
  métodos	
  imunológicos	
  mais	
  
utilizados	
  para	
  quantificar	
  a	
  concentração	
  de	
  antígenos	
  e	
  anticorpos,	
  por	
  apresentarem	
  grande	
  
sensibilidade	
  e	
  especificidade.	
  
Nesse	
  método,	
  uma	
  enzima,	
  que	
  reage	
  com	
  um	
  substrato	
  incolor	
  para	
  produzir	
  um	
  
produto	
  colorido,	
  é	
  covalentemente	
  ligada	
  a	
  um	
  anticorpo	
  específico	
  que	
  reconhece	
  um	
  
antígeno	
  alvo.	
  Se	
  o	
  antígeno	
  estiver	
  presente,	
  o	
  complexo	
  anticorpo-­‐enzima	
  irá	
  ligar-­‐se	
  a	
  ele	
  e	
  
a	
  enzima	
  catalisará	
  a	
  reação.	
  Então,	
  a	
  presença	
  de	
  produto	
  colorido	
  indica	
  a	
  presença	
  de	
  
antígeno.	
  Trata-­‐se	
  de	
  um	
  método	
  eficiente,	
  pois	
  permite	
  detectar	
  quantidades	
  de	
  proteína	
  da	
  
ordem	
  de	
  nanogramas	
  (10-­‐9	
  g).	
  
O	
  método	
  ELISA	
  pode	
  ser	
  direto,	
  indireto	
  ou	
  por	
  sanduíche	
  (DAS-­‐ELISA):	
  
	
  
	
  
	
  
Imunofluorescência	
  
	
  
	
   Imunofluorescência	
  é	
  uma	
  técnica	
  que	
  permite	
  a	
  visualização	
  de	
  antígenos	
  nos	
  tecidos	
  
ou	
  em	
  suspensões	
  celulares	
  utilizando	
  corantes	
  fluorescentes,	
  que	
  absorvem	
  luz	
  e	
  a	
  emitem	
  
num	
  determinado	
  comprimento	
  de	
  onda	
  (c.	
  d.	
  o.).	
  Quando	
  o	
  corante	
  está	
  ligado	
  ou	
  conjugado	
  
com	
  um	
  anticorpo,	
  os	
  locais	
  de	
  reação	
  entre	
  o	
  antígeno	
  e	
  o	
  anticorpo	
  conjugado	
  podem	
  
facilmente	
  ser	
  visualizados.	
  	
  
Os	
  fluorocromos	
  mais	
  utilizados	
  em	
  técnicas	
  de	
  imunofluorescência	
  são	
  a	
  fluoresceína	
  
isocianetada	
  (FITC)	
  e	
  rodamina.	
  Os	
  fluoróforos,	
  depois	
  de	
  excitados	
  por	
  um	
  comprimento	
  de	
  
onda	
  específico	
  (espectro	
  de	
  absorção),	
  emitem	
  fluorescência	
  (fótons	
  de	
  luz)	
  a	
  um	
  
comprimento	
  de	
  onda	
  superior	
  (espectro	
  de	
  emissão).	
  
	
  
	
  
 
	
  
	
  
Immunogold	
  Labelling	
  
	
  
	
   Immunogold	
  Labelling	
  é	
  uma	
  técnica	
  de	
  coloração	
  utilizada	
  em	
  microscopia	
  eletrônica.	
  
Partículas	
  de	
  ouro	
  coloidal	
  são	
  geralmente	
  anexadas	
  a	
  anticorpos	
  secundários,	
  os	
  quais	
  são	
  
previamente	
  anexados	
  a	
  anticorpos	
  primários	
  ligados	
  a	
  um	
  certo	
  antígeno	
  ou	
  proteína.	
  	
  
O	
  ouro	
  é	
  usado	
  por	
  sua	
  alta	
  densidade	
  eletrônica,	
  o	
  que	
  aumenta	
  a	
  dispersão	
  
eletrônica	
  resultando	
  em	
  pontos	
  escuros	
  de	
  alto	
  contraste.	
  Isso	
  permite	
  que	
  a	
  partícula	
  
elétron-­‐densa	
  possa	
  ser	
  vista	
  num	
  microscópio	
  eletrônico	
  como	
  um	
  ponto	
  escuro,	
  
indiretamente	
  marcando	
  a	
  molécula	
  procurada.	
  
	
  
	
  
	
  
Imunocromatografia	
  
	
  
	
   O	
  sistema	
  é	
  realizado	
  em	
  uma	
  matriz	
  constituída	
  de	
  membrana	
  de	
  nitrocelulose	
  ou	
  de	
  
náilon	
  coberta	
  por	
  acetato	
  transparente	
  para	
  facilitar	
  a	
  visualização	
  do	
  teste.	
  O	
  antígeno	
  ou	
  o	
  
anticorpo	
  é	
  fixado	
  na	
  membrana	
  na	
  forma	
  de	
  linhas	
  ou	
  pontos	
  e	
  o	
  restante	
  da	
  membrana	
  é	
  
bloqueado	
  com	
  proteína	
  inerte.	
  
	
   Para	
  detecção	
  de	
  antígenos	
  podem	
  ser	
  utilizados	
  anticorpos	
  fixados	
  na	
  linha	
  de	
  
captura	
  e	
  como	
  conjugado	
  um	
  segundo	
  anticorpo	
  conjugado	
  ao	
  corante.	
  Um	
  dos	
  métodos	
  
imunológicos	
  desses	
  testes	
  emprega	
  corante	
  insolúvel,	
  como	
  ouro	
  coloidal	
  (róseo)	
  ou	
  prata	
  
coloidal	
  (azul	
  marinho)	
  como	
  revelador	
  da	
  interação	
  antígeno-­‐anticorpo.	
  
A	
  amostra	
  aplicada	
  se	
  liga	
  ao	
  conjugado	
  colorido	
  e	
  após	
  a	
  migração	
  por	
  cromatografia	
  
a	
  formação	
  do	
  imunocomplexo	
  é	
  revelada	
  pelo	
  depósito	
  do	
  corante	
  coloidal	
  na	
  linha	
  de	
  
captura.	
  
	
   	
  
	
  
	
  
Southern	
  Blotting	
  
	
  
	
   O	
  Southern	
  blotting	
  é	
  um	
  método	
  da	
  biologia	
  molecular	
  que	
  serve	
  para	
  verificar	
  se	
  
umadeterminada	
  seqüência	
  de	
  DNA	
  está	
  ou	
  não	
  presente	
  em	
  uma	
  amostra	
  de	
  DNA	
  analisada.	
  
Isso	
  é	
  feito	
  por	
  meio	
  do	
  realce	
  do	
  resultado	
  de	
  uma	
  eletroforese	
  em	
  gel	
  de	
  agarose.	
  O	
  método	
  
foi	
  batizado	
  com	
  o	
  nome	
  de	
  seu	
  inventor,	
  o	
  biólogo	
  britânico	
  Edwin	
  Southern,	
  e	
  isso	
  fez	
  com	
  
que	
  outros	
  métodos	
  de	
  blot	
  fossem	
  batizados	
  com	
  trocadilhos	
  ao	
  nome	
  de	
  Southern,	
  por	
  
exemplo,	
  Western	
  blot	
  e	
  Northern	
  blot.	
  
	
  
	
  
Northern	
  Blotting	
  
	
  
	
   O	
  Northern	
  Blotting	
  é	
  uma	
  técnica	
  usada	
  na	
  pesquisa	
  em	
  biologia	
  molecular	
  para	
  
estudar	
  a	
  expressão	
  gênica,	
  ou	
  seja,	
  verificar	
  se	
  um	
  determinado	
  gene	
  de	
  um	
  genoma	
  é	
  ou	
  não	
  
transcrito	
  em	
  RNA	
  e	
  quantificar	
  isso.	
  Essa	
  técnica	
  tem	
  tal	
  nome	
  devido	
  à	
  similaridade	
  de	
  seu	
  
procedimento	
  com	
  o	
  Southern	
  blotting,	
  com	
  a	
  diferença	
  chave	
  de	
  que,	
  em	
  vez	
  de	
  DNA,	
  a	
  
substância	
  analisada	
  por	
  eletroforese	
  com	
  uma	
  sonda	
  hibridizadora	
  é	
  RNA.	
  
Uma	
  diferença	
  no	
  procedimento	
  (quando	
  comparada	
  com	
  o	
  Southern	
  blot)	
  é	
  a	
  adição	
  
de	
  formaldeído	
  no	
  gel	
  de	
  agarose,	
  que	
  funciona	
  como	
  um	
  desnaturante.	
  
	
  
Western	
  Blotting	
  
	
  
É	
  usado	
  para	
  detectar	
  proteínas	
  em	
  um	
  homogenato	
  (células	
  bem	
  trituradas)	
  ou	
  um	
  
extrato	
  de	
  um	
  tecido	
  biológico.	
  Essa	
  técnica	
  usa	
  eletroforese	
  em	
  gel	
  para	
  separar	
  as	
  proteínas	
  
desnaturadas	
  por	
  massa.	
  As	
  proteínas	
  são	
  então	
  transferidas	
  do	
  gel	
  para	
  uma	
  membrana	
  
(tipicamente	
  de	
  nitrocelulose),	
  onde	
  são	
  usados	
  como	
  sonda	
  anticorpos	
  específicos	
  à	
  proteína.	
  	
  
Assim,	
  os	
  pesquisadores	
  podem	
  examinar	
  a	
  quantidade	
  de	
  proteína	
  em	
  uma	
  dada	
  
amostra	
  e	
  comparar	
  os	
  níveis	
  entre	
  diversos	
  grupos.	
  
	
  
	
   	
  
CITOQUÍMICA	
  
	
  
-­‐	
  É	
  o	
  estudo	
  da	
  composição	
  química	
  celular	
  e	
  dos	
  processos	
  biológicos	
  no	
  interior	
  da	
  
célula.	
  
	
  
Corantes	
  
	
  
Corantes	
  ácidos	
  
	
   Corantes	
  ácidos	
  são	
  corantes	
  aniônicos	
  hidrossolúveis	
  que	
  se	
  ligam	
  a	
  um	
  substrato	
  
carregado	
  positivamente	
  (catiônico).	
  Entre	
  eles	
  destacam-­‐se	
  o	
  grupo	
  Ponceau	
  e	
  o	
  Fast	
  Green,	
  
cujos	
  alvos	
  são	
  proteínas.	
  
	
  
	
  
Corantes	
  básicos	
  
	
   Corantes	
  básicos	
  são	
  corantes	
  catiônicos	
  que	
  se	
  ligam	
  a	
  um	
  substrato	
  carregado	
  
negativamente	
  (aniônico).	
  Entre	
  eles	
  destacam-­‐se	
  o	
  Azul	
  de	
  Toluidina,	
  que	
  colore	
  a	
  parede	
  
celular,	
  e	
  a	
  Hematoxilina,	
  que	
  colore	
  o	
  núcleo.	
  
	
  
Azul	
  de	
  Toluidina	
   	
   	
   	
   Hematoxilina	
  
Coloração	
  por	
  interação	
  hidrofóbica	
  
	
   Existem	
  corantes	
  hidrofóbicos	
  que	
  funcionam	
  por	
  afinidade	
  entre	
  o	
  corante	
  e	
  seu	
  alvo,	
  
também	
  hidrofóbico.	
  Um	
  exemplo	
  desses	
  é	
  o	
  Sudan,	
  que	
  detecta	
  lipídeos.	
  
	
  
	
  
	
   	
  
	
  
Coloração	
  por	
  ligação	
  covalente	
  
	
   São	
  corantes	
  que	
  se	
  utilizam	
  de	
  ligações	
  covalentes	
  com	
  seus	
  substratos	
  para	
  que	
  
possam	
  detectá-­‐los.	
  Dentre	
  esses	
  podemos	
  citar	
  a	
  Reação	
  de	
  Feulgen,	
  que	
  colore	
  DNA,	
  e	
  as	
  
PAS	
  lectinas,	
  que	
  detectam	
  polissacarídeos.	
  
	
  
	
  
	
   Reação	
  de	
  Feulgen	
   	
   	
   	
   PAS	
  lectinas	
  
	
  
	
  
Em	
  resumo:	
  
Corante	
   Alvo	
   Tipo	
  
Grupo	
  Ponceau	
   Proteínas	
   Aniônico	
  
Fast	
  Green	
   Proteínas	
  	
   Aniônico	
  
Azul	
  de	
  Toluidina	
  	
   Parede	
  Celular	
   Catiônico	
  
Hematoxilina	
  	
   Núcleo	
   Catiônico	
  
Sudan	
   Lipídeos	
   Hidrofobicidade	
  
Reação	
  de	
  Feulgen	
   DNA	
   Lig.	
  Covalente	
  
PAS	
  Lectinas	
   Açúcares	
   Lig.	
  Covalente	
  
	
  
	
  
Citoquímica	
  enzimática	
  
	
  
Detecção	
  de	
  enzimas	
  in	
  situ	
  
Para	
  obter	
  sucesso	
  na	
  localização	
  de	
  enzimas	
  in	
  situ,	
  é	
  preciso	
  criar	
  um	
  ambiente	
  
favorável,	
  que	
  consiste	
  na	
  incubação	
  de	
  seu	
  substrato,	
  e	
  no	
  ajuste	
  de	
  pH	
  e	
  temperatura	
  que	
  
correspondem	
  à	
  atividade	
  padrão	
  da	
  enzima.	
  O	
  substrato	
  é	
  escolhido	
  de	
  tal	
  forma	
  que	
  
obtenha	
  uma	
  coloração	
  diferente	
  quando	
  ligado	
  à	
  sua	
  enzima	
  específica.	
  Assim,	
  pode	
  se	
  
detectar	
  a	
  presença	
  de	
  enzimas.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Imunocitoquímica	
  
	
  
Consiste	
  na	
  detecção	
  de	
  antígenos	
  in	
  situ	
  através	
  de	
  anticorpos	
  específicos	
  marcados	
  
com	
  indicadores:	
  enzimas	
  (visíveis	
  ao	
  microscópio	
  de	
  luz),	
  fluorocromos	
  (visíveis	
  ao	
  
microscópio	
  de	
  fluorescência),	
  ou	
  coloides	
  de	
  ouro	
  (elementos	
  eletrondensos	
  visíveis	
  ao	
  
microscópio	
  eletrônico	
  de	
  transmissão).	
  O	
  anticorpo	
  marcado	
  se	
  liga	
  ao	
  antígeno,	
  revelando	
  
sua	
  presença.	
  
	
  
	
  
	
   Fluorocromos	
  
	
  
	
  
	
   Os	
  anticorpos	
  marcados	
  podem	
  ser	
  primários,	
  ou	
  seja,	
  se	
  ligam	
  diretamente	
  ao	
  
antígeno,	
  ou	
  secundários,	
  que	
  se	
  ligam	
  a	
  outro	
  anticorpo,	
  que	
  por	
  sua	
  vez	
  estará	
  ligado	
  ao	
  
antígeno.	
  
	
  
	
  
Hibridização	
  in	
  situ	
  
	
  
	
   A	
  hibridização	
  in	
  situ	
  é	
  uma	
  técnica	
  que	
  permite	
  identificar	
  sequencias	
  específicas	
  de	
  
nucleotídeos	
  através	
  de	
  uma	
  sequencia	
  complementar	
  de	
  nucleotídeos	
  marcada	
  com	
  um	
  
indicador.	
  Essa	
  sequencia	
  é	
  chamada	
  de	
  sonda.	
  A	
  sonda	
  é	
  aplicada	
  à	
  amostra,	
  e	
  se	
  houver	
  uma	
  
sequencia	
  complementar	
  à	
  sonda	
  presente,	
  estas	
  se	
  ligam,	
  permitindo	
  a	
  detecção	
  da	
  
sequencia.	
  
	
  
	
  
FISH	
  
	
  
	
   A	
  hibridização	
  fluorescente	
  in	
  situ,	
  conhecida	
  como	
  FISH	
  (do	
  inglês:	
  Fluorescence	
  In	
  
Situ	
  Hybridization),	
  é	
  um	
  técnica	
  citogenética	
  usada	
  para	
  detectar	
  e	
  localizar	
  a	
  presença	
  ou	
  a	
  
ausência	
  de	
  determinadas	
  sequências	
  de	
  DNA	
  em	
  cromossomos.	
  Ela	
  utiliza	
  sondas	
  
fluorescentes	
  que	
  se	
  ligam	
  somente	
  às	
  partes	
  do	
  cromossomo	
  a	
  que	
  eles	
  apresentem	
  um	
  
elevado	
  grau	
  de	
  complementaridade	
  de	
  sequência.	
  A	
  visualização	
  do	
  resultado	
  é	
  feita	
  em	
  um	
  
microscópio	
  de	
  fluorescência.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
TÉCNICAS	
  MOLECULARES	
  
	
  
PCR	
  
	
  
	
   A	
  reação	
  em	
  cadeia	
  da	
  polimerase	
  (Polymerase	
  Chain	
  Reaction)	
  é	
  uma	
  técnica	
  pela	
  
qual	
  se	
  pode	
  clonar	
  rapidamente	
  uma	
  determinada	
  sequencia	
  de	
  DNA.	
  
	
   A	
  fita	
  de	
  DNA	
  a	
  ser	
  replicada	
  é	
  aquecida	
  até	
  94ºC,	
  temperatura	
  em	
  que	
  as	
  fitas	
  são	
  
separadas.	
  São	
  adicionados	
  a	
  enzima	
  DNA-­‐polimerase	
  e	
  bastantes	
  nucleosídeos	
  que	
  serão	
  
usados	
  na	
  replicação,	
  como	
  substratos	
  da	
  DNA	
  polimerase,	
  são	
  eles	
  o	
  dATP,	
  dGTP,	
  dCTP	
  e	
  
dTTP.	
  	
  
A	
  temperaturaé	
  reduzida	
  para	
  54ºC	
  e	
  ocorre	
  o	
  anelamento	
  dos	
  primers,	
  ou	
  seja,	
  eles	
  
conectam-­‐se	
  às	
  fitas	
  de	
  DNA	
  separadas.	
  
A	
  temperatura	
  é	
  aumentada	
  para	
  72ºC,	
  ideal	
  para	
  o	
  funcionamento	
  da	
  DNA	
  
polimerase,	
  que	
  sintetiza	
  as	
  outras	
  fitas	
  complementares.	
  	
  
Este	
  ciclo	
  é	
  repetido	
  inúmeras	
  vezes,	
  fazendo	
  com	
  que	
  a	
  quantidade	
  de	
  fitas	
  de	
  DNA	
  
cresça	
  exponencialmente.	
  
	
  
	
  
	
  
Bibliotecas	
  genômicas	
  
	
  
Uma	
  biblioteca	
  genômica	
  é	
  uma	
  coleção	
  de	
  fragmentos	
  de	
  DNA	
  de	
  uma	
  determinada	
  
espécie	
  de	
  organismo,	
  obtidos	
  a	
  partir	
  da	
  ação	
  de	
  endonucleases	
  de	
  restrição,	
  ligados	
  aos	
  
vetores	
  apropriados	
  e	
  clonados	
  após	
  terem	
  sido	
  inseridos	
  em	
  um	
  hospedeiro. 	
  
É	
  suposto	
  que	
  uma	
  biblioteca	
  genômica	
  seja	
  representativa	
  de	
  todos	
  os	
  genes	
  do	
  
organismo,	
  sendo	
  muito	
  útil	
  quando	
  se	
  pretende	
  isolar	
  um	
  gene	
  específico.	
  Assim,	
  torna-­‐se	
  
claro	
  que	
  quando	
  se	
  quer	
  clonar	
  um	
  determinado	
  gene	
  ou	
  o	
  cDNA	
  (DNA	
  complementar)	
  das	
  
mensagens	
  por	
  ele	
  codificadas	
  (mRNA)	
  é	
  necessário	
  a	
  construção	
  de	
  coleções	
  de	
  genes	
  
recombinantes. As	
  bibliotecas	
  são	
  construídas,	
  na	
  maioria	
  das	
  vezes,	
  usando-­‐se	
  vetores	
  
plasmidiais.	
  
Os	
  vetores	
  plasmidiais	
  são	
  pequenas	
  moléculas	
  circulares	
  de	
  DNA	
  de	
  fita	
  dupla,	
  
derivadas	
  de	
  plasmídeos	
  maiores.	
  Os	
  círculos	
  de	
  DNA	
  plasmidial	
  purificados	
  são	
  primeiro	
  
clivados	
  com	
  uma	
  nuclease	
  de	
  restrição	
  para	
  criar	
  moléculas	
  de	
  DNA	
  linear.	
  O	
  DNA	
  genômico	
  
usado	
  na	
  construção	
  da	
  biblioteca	
  é	
  clivado	
  com	
  a	
  mesma	
  nuclease	
  de	
  restrição,	
  e	
  os	
  
fragmentos	
  de	
  restrição	
  resultantes	
  são	
  então	
  adicionados	
  aos	
  plasmídeos	
  clivados	
  e	
  anelados	
  
por	
  meio	
  de	
  suas	
  extremidades	
  coesivas	
  para	
  formar	
  círculos	
  de	
  DNA	
  recombinante.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Os	
  plasmídeos	
  são	
  inseridos	
  em	
  bactérias,	
  que	
  são	
  colocadas	
  em	
  culturas	
  para	
  
multiplicar	
  o	
  DNA	
  plasmidial	
  resultante.	
  A	
  coleção	
  inteiura	
  dos	
  plasmídeos	
  é	
  chamada	
  de	
  
biblioteca	
  de	
  DNA	
  genômico.	
  
	
  
As	
  bibliotecas	
  de	
  cDNA	
  são	
  construídas	
  extraindo-­‐se	
  o	
  mRNA	
  de	
  células	
  e	
  fazendo-­‐se	
  
uma	
  copia	
  de	
  DNA	
  complementar	
  (cDNA)	
  a	
  partir	
  desse	
  mRNA.	
  Essa	
  reação	
  é	
  catalisada	
  pela	
  
transcriptase	
  reversa	
  de	
  retrovírus,	
  que	
  sintetiza	
  uma	
  cadeia	
  de	
  DNA	
  complementar	
  a	
  partir	
  de	
  
um	
  molde	
  de	
  RNA.	
  As	
  moléculas	
  de	
  cDNA	
  de	
  fita	
  simples	
  sintetizadas	
  pela	
  transcriptase	
  
reversa	
  são	
  convertidas	
  em	
  cDNA	
  de	
  fita	
  dupla	
  pela	
  DNA	
  polimerase,	
  sendo	
  inseridas	
  em	
  um	
  
vetor	
  plasmidial	
  e	
  clonadas.	
  
	
  
	
  
Eletroforese	
  em	
  gel	
  –	
  ver	
  parte	
  de	
  fracionamento	
  celular	
  
	
  
Hibridização	
  –	
  ver	
  parte	
  de	
  citoquímica	
  
	
  
Sequenciamento	
  de	
  DNA	
  
	
  
	
   O	
  sequenciamento	
  de	
  DNA	
  é	
  um	
  processo	
  que	
  determina	
  a	
  disposição	
  dos	
  
nucleotídeos	
  ao	
  longo	
  de	
  um	
  dado	
  fragmento	
  de	
  DNA.	
  Isto	
  é	
  feito	
  através	
  de	
  técnicas	
  manuais	
  
ou	
  automatizadas,	
  baseadas	
  na	
  identificação	
  do	
  último	
  nucleotídeo	
  incorporado	
  na	
  
extremidade	
  de	
  alongamento	
  de	
  uma	
  molécula	
  de	
  DNA	
  marcada,	
  complementar	
  fita	
  simples	
  
da	
  qual	
  se	
  deseja	
  determinar	
  a	
  sequência.	
  Assim,	
  é	
  possível	
  a	
  identificação	
  da	
  ordem	
  exata	
  dos	
  
pares	
  de	
  bases	
  (A,	
  T,	
  G	
  e	
  C)	
  em	
  um	
  segmento	
  de	
  DNA.	
  
	
   Antigamente,	
  eram	
  utilizados	
  o	
  método	
  de	
  degradação	
  de	
  bases	
  (Allan	
  Maxam	
  e	
  
Walter	
  Gilbert,	
  1977)	
  e	
  o	
  método	
  didesoxi	
  (Sanger,	
  1978).	
  Atualmente,	
  existem	
  técnicas	
  
automatizadas,	
  como	
  o	
  pirosequenciamento	
  Roche	
  454	
  e	
  o	
  sequenciamento	
  Illumina.	
  
	
  
Southern	
  Blot	
  –	
  ver	
  parte	
  de	
  técnicas	
  imunológicas	
  
	
  
	
  
MICROSCOPIA	
  ELETRÔNICA	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
Microscópio	
  eletrônico	
  de	
  transmissão	
  (MET)	
  
	
  
A	
  imagem	
  é	
  formada	
  pelos	
  elétrons	
  que	
  atravessam	
  a	
  amostra,	
  resultando	
  em	
  imagens	
  2D.	
  
	
  	
  
	
  
Microscópio	
  óptico	
  (esquerda)	
  em	
  comparação	
  com	
  o	
  MET	
  (direita).	
  
	
  
Preparação	
  da	
  amostra	
  para	
  MET	
  
	
   Fixação	
  –	
  consiste	
  em	
  matar	
  o	
  tecido	
  vivo	
  e	
  preservá-­‐lo.	
  A	
  fixação	
  é	
  feita	
  com	
  
gluteraldeído,	
  que	
  faz	
  com	
  que	
  as	
  moléculas	
  de	
  proteína	
  façam	
  ligações	
  covalentemente	
  
cruzadas	
  com	
  seus	
  vizinhos.	
  
	
   Pós-­‐fixação	
  –	
  o	
  tetróxido	
  de	
  ósmio	
  se	
  liga	
  e	
  estabiliza	
  as	
  bicamadas	
  lipídicas,	
  assim	
  
como	
  as	
  proteínas.	
  
	
   Desidratação	
  –	
  substituição	
  da	
  água	
  presente	
  nas	
  células	
  por	
  um	
  solvente	
  orgânico	
  
(acetona	
  ou	
  álcool,	
  por	
  exemplo).	
  
	
   Inclusão	
  –	
  o	
  solvente	
  orgânico	
  é	
  substituído	
  por	
  uma	
  resina	
  monomérica	
  que	
  se	
  
polimeriza	
  para	
  formar	
  um	
  bloco	
  sólido	
  (endurecimento	
  da	
  resina).	
  
	
   Ultramicrotomia	
  –	
  o	
  bloco	
  sólido	
  é	
  cortado	
  com	
  uma	
  lamina	
  de	
  vidro	
  especial,	
  ou	
  de	
  
diamante,	
  em	
  um	
  micrótomo	
  especial.	
  
	
   Contrastação	
  –	
  são	
  aplicados	
  sais	
  que	
  contenham	
  metais	
  pesados,	
  como	
  acetato	
  de	
  
uranila	
  e	
  citrato	
  de	
  chumbo.	
  
	
  
	
  
Microscópio	
  eletrônico	
  de	
  varredura	
  (MEV)	
  
	
  
A	
  imagem	
  é	
  formada	
  pelos	
  elétrons	
  refletidos	
  ou	
  emitidos	
  pela	
  superfície	
  da	
  amostra,	
  
resultando	
  em	
  imagens	
  3D.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  	
  
	
  	
  
Preparação	
  de	
  amostra	
  para	
  MEV	
  
Fixação	
  –	
  consiste	
  em	
  matar	
  o	
  tecido	
  vivo	
  e	
  preservá-­‐lo.	
  A	
  fixação	
  é	
  feita	
  com	
  
gluteraldeído,	
  que	
  faz	
  com	
  que	
  as	
  moléculas	
  de	
  proteína	
  façam	
  ligações	
  covalentemente	
  
cruzadas	
  com	
  seus	
  vizinhos.	
  
	
   Pós-­‐fixação	
  –	
  o	
  tetróxido	
  de	
  ósmio	
  se	
  liga	
  e	
  estabiliza	
  as	
  bicamadas	
  lipídicas,	
  assim	
  
como	
  as	
  proteínas.	
  
	
   Desidratação	
  –	
  substituição	
  da	
  água	
  presente	
  nas	
  células	
  por	
  um	
  solvente	
  orgânico	
  
(acetona	
  ou	
  álcool,	
  por	
  exemplo).	
  
	
   Secagem	
  ao	
  ponto	
  crítico	
  –	
  a	
  secagem	
  ao	
  ponto	
  crítico	
  tem	
  como	
  objetivo	
  remover	
  o	
  
solvente	
  orgânico	
  e	
  substituí-­‐lo	
  por	
  ar,	
  mas	
  sem	
  que	
  a	
  célula	
  se	
  deforme.	
  Primeiro,	
  o	
  solvente	
  
orgânico	
  é	
  substituído	
  por	
  CO2	
  líquido	
  num	
  aparelho	
  especial.	
  Esta	
  troca	
  se	
  dá	
  entre	
  0	
  e	
  5ºC	
  
sob	
  pressão	
  atmosférica.	
  Em	
  seguida,	
  eleva-­‐se	
  a	
  temperatura	
  e	
  a	
  pressão	
  da	
  câmara	
  que	
  
contém	
  a	
  amostra	
  até	
  o	
  chamado	
  ponto	
  crítico,	
  em	
  que	
  o	
  CO2	
  passa	
  ao	
  estado	
  gasoso	
  semque	
  se	
  forme	
  uma	
  interfase	
  gás-­‐líquido,	
  que	
  levaria	
  à	
  deformação	
  das	
  células	
  devido	
  à	
  alta	
  
tensão	
  superficial	
  do	
  sistema.	
  O	
  ponto	
  crítico	
  do	
  CO2	
  se	
  dá	
  a	
  31ºC	
  e	
  sob	
  pressão	
  de	
  73	
  atm.	
  
	
   Cobertura	
  com	
  metal	
  pesado	
  –	
  a	
  amostra	
  é	
  coberta	
  com	
  um	
  metal	
  pesado,	
  como	
  ouro	
  
ou	
  platina,	
  que	
  ajuda	
  na	
  reflexão	
  dos	
  elétrons	
  e	
  protege	
  a	
  amostra.	
  	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
MEMBRANA	
  PLASMÁTICA	
  
	
  
A	
  membrana	
  plasmática	
  é	
  uma	
  bicamada	
  fosfolipídica	
  que	
  possui	
  várias	
  funções,	
  
dentre	
  as	
  quais	
  a	
  definição	
  dos	
  limites	
  espaciais	
  da	
  célula,	
  proteção,	
  revestimento	
  e	
  
permeabilidade	
  seletiva.	
  Os	
  fosfolipídios	
  estão	
  dispostos	
  de	
  modo	
  que	
  suas	
  extremidades	
  
hidrofílicas	
  fiquem	
  voltadas	
  para	
  o	
  meio	
  externo	
  e	
  interno,	
  enquanto	
  as	
  extremidades	
  
hidrofóbicas	
  compõem	
  a	
  parte	
  interna	
  da	
  membrana.	
  
A	
  membrana	
  também	
  é	
  composta	
  por	
  varias	
  proteínas,	
  com	
  diversas	
  funções.	
  A	
  
relação	
  aproximada	
  entre	
  a	
  quantidade	
  de	
  lipídios	
  e	
  proteínas	
  na	
  membrana	
  é	
  de	
  50%	
  para	
  
cada	
  tipo	
  de	
  molécula.	
  
	
  
Modelo	
  do	
  mosaico	
  fluido	
  
	
  
	
   No	
  meio	
  da	
  matriz	
  lipídica	
  são	
  encontradas	
  moléculas	
  de	
  proteínas,	
  com	
  grande	
  
capacidade	
  de	
  movimentação	
  e	
  deslocamento,	
  apresentando	
  significativa	
  importância	
  na	
  
retenção	
  e	
  no	
  transporte	
  de	
  outras	
  moléculas	
  através	
  da	
  membrana	
  plasmática,	
  tarefa	
  que	
  
realiza	
  de	
  forma	
  seletiva.	
  
 As	
  substâncias	
  que	
  são	
  lipossolúveis	
  transpõem	
  a	
  membrana	
  passando	
  diretamente	
  
pela	
  dupla	
  camada	
  lipídica.	
  O	
  restante	
  das	
  substâncias	
  é	
  transportado	
  pelas	
  moléculas	
  
proteicas,	
  do	
  meio	
  externo	
  para	
  o	
  meio	
  interno.	
  Íons	
  e	
  pequenas	
  moléculas	
  hidrossolúveis,	
  até	
  
mesmo	
  a	
  própria	
  água,	
  atravessam	
  a	
  membrana	
  por	
  meio	
  de	
  diminutos	
  canais	
  compostos	
  
pelas	
  moléculas	
  de	
  proteína.	
  Esta	
  estrutura	
  da	
  membrana	
  proteica	
  é	
  chamada	
  de	
  mosaico	
  
fluido.	
  
 
 
Lipídios	
  de	
  membrana	
  
	
  
	
   -­‐	
  Esteróis:	
  conferem	
  maior	
  rigidez	
  à	
  membrana	
  e	
  aumentam	
  a	
  sua	
  resistência	
  à	
  
deformação.	
  Isso	
  acontece	
  pois	
  os	
  anéis	
  aromáticos	
  atrapalham	
  o	
  movimento	
  das	
  caudas	
  dos	
  
fosfolipídios,	
  que	
  são	
  bastante	
  flexíveis.	
  
	
  
	
   	
  
	
  
	
   -­‐	
  Glicolipídios:	
  representam	
  5%	
  dos	
  lipídios	
  da	
  membrana.	
  
	
  
	
  
-­‐	
  Fosfolipídios:	
  são	
  anfipáticos,	
  ou	
  seja,	
  possuem	
  uma	
  extremidade	
  polar	
  (a	
  “cabeça”)	
  
e	
  outra	
  apolar	
  (a	
  “cauda”).	
  	
  
São	
  formados	
  por	
  um	
  grupo	
  hidrofílico	
  composto	
  por	
  um	
  esqueleto	
  de	
  glicerol	
  com	
  um	
  
radical	
  fosfatado	
  e	
  uma	
  cauda	
  hidrofóbica	
  composta	
  por	
  duas	
  cadeias	
  de	
  ácidos	
  graxos	
  de	
  
comprimento	
  variável	
  (14	
  a	
  24	
  carbonos).	
  
	
  Uma	
  dessas	
  cadeias	
  geralmente	
  é	
  saturada,	
  isto	
  é,	
  não	
  há	
  duplas	
  ligações	
  entre	
  os	
  
átomos	
  de	
  carbono,	
  e	
  a	
  outra	
  pode	
  ser	
  saturada	
  ou	
  insaturada.	
  
	
  Os	
  principais	
  fosfolipídios	
  são	
  a	
  fosfatidilcolina,	
  fosfatidilserina,	
  esfingomielina	
  e	
  
fosfatidiletanolamina.	
  
	
  
	
  
	
  
Proteínas	
  de	
  membrana	
  
	
  
	
   As	
  proteínas	
  de	
  membrana	
  podem	
  ser	
  classificadas	
  em	
  transmembrana	
  (atravessam	
  
toda	
  a	
  membrana	
  plasmática)	
  ou	
  periféricas	
  (associadas	
  a	
  outras	
  proteínas	
  ou	
  lipídios	
  na	
  
membrana).	
  	
  
Dentre	
  as	
  proteínas	
  transmembrana,	
  existem	
  as	
  unipasso,	
  que	
  atravessam	
  a	
  
membrana	
  apenas	
  uma	
  vez,	
  e	
  as	
  multipasso,	
  que	
  atravessam	
  a	
  membrana	
  múltiplas	
  vezes.	
  
	
  
	
  
	
  
Experimento	
  de	
  Frye	
  e	
  Edidin	
  –	
  as	
  proteínas	
  se	
  movem	
  
	
  
	
  
Domínios	
  específicos	
  
	
  
	
   Muitas	
  proteínas	
  não	
  se	
  difundem	
  livremente	
  no	
  plano	
  da	
  membrana.	
  Isso	
  acontece	
  
porque	
  membrana	
  plasmática	
  se	
  divide	
  em	
  várias	
  áreas,	
  chamadas	
  domínios,	
  que	
  podem	
  ser	
  
delimitados	
  por	
  barreiras.	
  	
  
As	
  barreiras	
  são	
  formadas	
  por	
  arranjos	
  de	
  proteínas	
  que	
  impedem	
  a	
  livre	
  difusão	
  de	
  
outras	
  proteínas	
  ou	
  lipídeos	
  entre	
  elas.	
  As	
  proteínas	
  se	
  difundem	
  livremente	
  dentro	
  de	
  um	
  
determinado	
  domínio;	
  entretanto,	
  não	
  passam	
  aos	
  domínios	
  vizinhos	
  por	
  não	
  serem	
  capazes	
  
de	
  cruzar	
  as	
  barreiras.	
  
	
  
	
  
Permeabilidade	
  da	
  membrana	
  
	
  
	
   A	
  membrana	
  possui	
  permeabilidade	
  seletiva,	
  que	
  se	
  baseia	
  no	
  tamanho,	
  na	
  polaridade	
  
e	
  na	
  carga	
  das	
  moléculas	
  que	
  atravessam	
  a	
  bicamada.	
  	
   	
  
Quanto	
  ao	
  tamanho,	
  quanto	
  menor	
  a	
  molécula,	
  mais	
  facilidade	
  tem	
  de	
  atravessar	
  a	
  
membrana.	
  	
  
Em	
  relação	
  à	
  polaridade,	
  as	
  moléculas	
  apolares	
  têm	
  muito	
  mais	
  facilidade	
  em	
  
atravessar	
  a	
  membrana,	
  pois	
  a	
  natureza	
  do	
  interior	
  da	
  membrana	
  é	
  apolar.	
  	
  
Quanto	
  à	
  carga,	
  os	
  íons,	
  positivos	
  ou	
  negativos,	
  não	
  atravessam	
  a	
  membrana,	
  por	
  
menores	
  que	
  sejam.	
  
	
  
	
  
Proteínas	
  de	
  transporte	
  
	
  
	
   As	
  proteínas	
  de	
  transporte	
  têm	
  a	
  função	
  de	
  permitir	
  a	
  passagem	
  de	
  moléculas	
  que	
  não	
  
atravessariam	
  a	
  membrana	
  por	
  elas	
  mesmas.	
  Essas	
  proteínas	
  são	
  transmembrana,	
  multipasso,	
  
e	
  específicas	
  para	
  cada	
  tipo	
  de	
  molécula.	
  Elas	
  se	
  dividem	
  de	
  acordo	
  com	
  seu	
  modo	
  de	
  atuação,	
  
em	
  carreadoras	
  ou	
  canais.	
  
	
   As	
  proteínas	
  carreadoras	
  têm	
  a	
  função	
  de	
  se	
  ligar	
  à	
  molécula	
  em	
  um	
  dos	
  meios	
  e	
  
liberá-­‐la	
  no	
  outro.	
  Elas	
  transportam	
  poucas	
  moléculas	
  por	
  vez.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
   As	
  proteínas	
  do	
  tipo	
  canal	
  atuam	
  como	
  comportas.	
  Ao	
  se	
  abrirem,	
  formam	
  um	
  poro	
  ou	
  
canal	
  pelo	
  qual	
  passa	
  rapidamente	
  uma	
  grande	
  quantidade	
  de	
  moléculas.	
  Mesmo	
  assim,	
  
podem	
  ser	
  específicas,	
  como	
  os	
  canais	
  iônicos.	
  
	
  
Tipos	
  de	
  transporte	
  
	
  
	
   O	
  transporte	
  transmembrana	
  pode	
  ser	
  classificado	
  em	
  uniporte	
  (a	
  molécula	
  passa	
  pela	
  
proteína	
  de	
  membrana	
  normalmente),	
  simporte	
  (a	
  molécula	
  precisa	
  que	
  um	
  íon	
  passe	
  junto	
  
com	
  ela),	
  ou	
  antiporte	
  (ao	
  mesmo	
  tempo	
  que	
  uma	
  molécula	
  entra,	
  outra	
  deve	
  sair	
  ao	
  mesmo	
  
tempo).	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
RETÍCULO	
  ENDOPLASMÁTICO	
  
	
  
	
   Todas	
  as	
  células	
  eucarióticas	
  possuem	
  o	
  Retículo	
  Endoplasmático.	
  Sua	
  membrana	
  
constitui	
  mais	
  da	
  metade	
  da	
  membrana	
  total	
  de	
  uma	
  célula	
  animal.	
  Está	
  localizado	
  em	
  um	
  
labirinto	
  de	
  túbulosramificados	
  e	
  vesículas	
  achatadas	
  que	
  se	
  estendem	
  através	
  do	
  citosol.	
  Os	
  
túbulos	
  e	
  vesículas	
  se	
  interconectam,	
  e	
  suas	
  membranas	
  são	
  contínuas	
  junto	
  à	
  membrana	
  
nuclear	
  externa.	
  O	
  espaço	
  interno	
  do	
  reticulo	
  chama-­‐se	
  lúmen,	
  e	
  ocupa	
  aproximadamente	
  
10%	
  do	
  volume	
  total	
  da	
  célula.	
  
	
   A	
  principal	
  função	
  do	
  reticulo	
  é	
  a	
  síntese	
  de	
  proteínas	
  e	
  lipídeos,	
  servindo	
  também	
  
como	
  fonte	
  de	
  armazenamento	
  intracelular	
  de	
  Ca2+.	
  A	
  membrana	
  do	
  RE	
  é	
  o	
  sítio	
  de	
  produção	
  
de	
  todas	
  as	
  proteínas	
  transmembrana	
  e	
  lipídeos	
  para	
  a	
  maioria	
  das	
  organelas	
  celulares,	
  e	
  
membranas	
  mitocondriais	
  e	
  de	
  peroxissomos.	
  Alem	
  disso,	
  todas	
  as	
  proteínas	
  endereçadas	
  
para	
  secreção	
  ao	
  exterior	
  da	
  célula	
  são	
  destinadas	
  inicialmente	
  ao	
  lúmen	
  do	
  RE.	
  
	
   O	
  reticulo	
  possui	
  dois	
  domínios	
  variáveis,	
  o	
  liso	
  e	
  o	
  rugoso.	
  O	
  domínio	
  liso	
  caracteriza	
  
pela	
  ausência	
  de	
  ribossomos	
  acoplados	
  à	
  sua	
  membrana	
  e	
  é	
  responsável	
  principalmente	
  pela	
  
síntese	
  de	
  lipídeos.	
  O	
  domínio	
  rugoso	
  caracteriza-­‐se	
  pela	
  presença	
  abundante	
  de	
  ribossomos	
  
acoplados	
  à	
  superfície	
  de	
  sua	
  membrana;	
  sua	
  principal	
  função	
  é	
  a	
  síntese	
  de	
  proteínas,	
  além	
  
de	
  participar	
  de	
  modificações	
  pós-­‐traducionais	
  proteicas.	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
	
  
A	
  síntese	
  de	
  proteínas	
  no	
  retículo	
  rugoso	
  
	
  
	
   Quando	
  a	
  síntese	
  de	
  uma	
  proteína	
  que	
  precisa	
  passar	
  pelo	
  retículo	
  se	
  inicia,	
  os	
  
primeiros	
  aminoácidos	
  expostos	
  fora	
  do	
  ribossomo	
  constituem	
  uma	
  sequencia	
  sinal.	
  Essa	
  
sequencia	
  então	
  se	
  liga	
  a	
  uma	
  partícula	
  reconhecedora	
  do	
  sinal	
  ou	
  SRP	
  (do	
  inglês	
  Signal	
  
Recognition	
  Particle).	
  A	
  membrana	
  do	
  retículo,	
  por	
  sua	
  vez,	
  possui	
  um	
  receptor	
  para	
  o	
  
conjunto	
  sequencia	
  de	
  sinal.	
  A	
  membrana	
  do	
  retículo	
  possui	
  também	
  um	
  receptor	
  que	
  forma	
  
uma	
  âncora	
  para	
  adesão	
  do	
  ribossomo.	
  A	
  SRP	
  interrompe	
  a	
  síntese	
  das	
  proteínas	
  endereçadas	
  
ao	
  retículo	
  até	
  que	
  o	
  ribossomo	
  esteja	
  acoplado	
  à	
  sua	
  membrana.	
  A	
  partir	
  do	
  acoplamento,	
  a	
  
cadeia	
  proteica	
  continuará	
  sendo	
  sintetizada	
  para	
  dentro	
  do	
  lúmen	
  do	
  retículo.	
  
	
  
	
   A	
  importação	
  de	
  proteínas	
  é	
  um	
  processo	
  co-­‐traducional,	
  ou	
  seja,	
  o	
  ribossomo	
  que	
  
esta	
  sintetizando	
  a	
  proteína	
  está	
  diretamente	
  aderido	
  à	
  membrana	
  do	
  RE,	
  permitindo	
  que	
  uma	
  
ponta	
  da	
  proteína	
  seja	
  translocada	
  para	
  o	
  RE	
  enquanto	
  o	
  resto	
  da	
  cadeia	
  polipeptídica	
  está	
  
sendo	
  montada.	
  
	
   Quando	
  o	
  ribossomo	
  vai	
  se	
  acoplar	
  ao	
  retículo,	
  forma-­‐se	
  um	
  canal	
  hidrofílico	
  
transmembrana	
  por	
  onde	
  a	
  proteína	
  nascente	
  vai	
  passar.	
  Esse	
  canal	
  é	
  formado	
  por	
  proteínas	
  
transmembrana	
  que	
  se	
  agrupam	
  apenas	
  quando	
  o	
  ribossomo	
  vai	
  se	
  acoplar.	
  Esse	
  canal	
  
hidrofílico	
  recebe	
  o	
  nome	
  de	
  translócon	
  (translocador).	
  O	
  ribossomo	
  se	
  ajusta	
  no	
  translocon,	
  
de	
  modo	
  que	
  nada	
  mais	
  atravesse	
  o	
  canal	
  além	
  da	
  cadeia	
  proteica	
  e	
  nada	
  vaze	
  do	
  lúmen	
  do	
  
retículo	
  para	
  o	
  citosol.	
  O	
  ribossomo	
  permanecerá	
  aderido	
  até	
  terminar	
  de	
  sintetizar	
  a	
  
seqüência	
  primária	
  de	
  aminoácidos	
  da	
  proteína.	
  No	
  final	
  da	
  síntese,	
  a	
  seqüência	
  sinal	
  é	
  
cortada	
  por	
  uma	
  enzima	
  específica	
  e	
  a	
  proteína	
  fica	
  livre	
  no	
  lúmen	
  do	
  retículo,	
  a	
  partir	
  de	
  onde	
  
terá	
  início	
  um	
  processo	
  de	
  acabamento	
  e	
  endereçamento	
  ao	
  seu	
  destino	
  final.	
  Quanto	
  ao	
  
ribossomo,	
  o	
  que	
  define	
  se	
  este	
  ficará	
  livre	
  ou	
  aderido	
  ao	
  retículo	
  é	
  o	
  tipo	
  de	
  proteína	
  (com	
  ou	
  
sem	
  sequencia	
  de	
  sinal)	
  que	
  ele	
  estiver	
  sintetizando	
  naquele	
  momento.	
  
	
  
A	
  síntese	
  de	
  lipídeos	
  no	
  retículo	
  liso	
  
	
  
	
   Todas	
  as	
  enzimas	
  responsáveis	
  por	
  catalisar	
  a	
  síntese	
  de	
  fosfolipídeos	
  se	
  localizam	
  na	
  
membrana	
  do	
  retículo	
  do	
  lado	
  voltado	
  para	
  o	
  citossol,	
  onde	
  estão	
  as	
  moléculas	
  precursoras	
  
colina,	
  glicerolfosfato	
  e	
  ácidos	
  graxos.	
  Com	
  isso,	
  todos	
  os	
  lipídeos	
  sintetizados	
  serão	
  
inicialmente	
  adicionados	
  ao	
  lado	
  da	
  bicamada	
  voltados	
  para	
  o	
  citossol.	
  
	
   Entretanto,	
  	
  uma	
  membrana	
  é	
  uma	
  bicamada	
  lipídica	
  em	
  que	
  as	
  quantidades	
  de	
  
lipídeo	
  em	
  cada	
  camada	
  é	
  equivalente,	
  assim	
  como	
  as	
  áreas	
  ocupadas	
  por	
  eles,	
  no	
  retículo	
  liso	
  
deveria	
  haver	
  um	
  desequilíbrio	
  entre	
  as	
  duas	
  camadas.	
  Esse	
  desequilíbrio	
  de	
  área	
  que	
  
teoricamente	
  deveria	
  existir	
  nunca	
  foi	
  realmente	
  observado.	
  Assim,	
  acredita-­‐se	
  que	
  ele	
  é	
  
muito	
  rápido,	
  sendo	
  imediatamente	
  corrigido	
  por	
  uma	
  enzima	
  chamada	
  scramblase,	
  capaz	
  de	
  
flipar	
  um	
  fosfolipídeo,	
  translocando-­‐o	
  para	
  a	
  face	
  da	
  membrana	
  voltada	
  para	
  a	
  luz	
  do	
  retículo.	
  
	
   	
  
	
  
O	
  fosfolipídeo	
  sintetizado	
  em	
  maior	
  quantidade	
  é	
  a	
  fosfatidilcolina.	
  Essa	
  molécula	
  é	
  
produzida	
  pela	
  adição	
  de	
  colina	
  a	
  duas	
  cadeias	
  de	
  ácido	
  graxo	
  e	
  uma	
  molécula	
  de	
  glicerol	
  
fosfato.	
  Outros	
  lipídeos,	
  como	
  a	
  fosfatidiletanolamina,	
  a	
  fosfatidilserina	
  e	
  o	
  fosfatidilinositol,	
  
são	
  sintetizados	
  e	
  acrescentados	
  à	
  membrana	
  dessa	
  mesma	
  forma.	
   	
  
COMPLEXO	
  DE	
  GOLGI	
  	
  
	
  
	
   Assim	
  como	
  o	
  retículo	
  endoplasmático,	
  geralmente	
  existe	
  apenas	
  um	
  complexo	
  de	
  
Golgi	
  por	
  célula.	
  Diferente	
  do	
  retículo	
  endoplasmático,	
  com	
  sua	
  rede	
  contínua	
  de	
  túbulos,	
  o	
  
complexo	
  de	
  Golgi	
  é	
  formado	
  por	
  cisternas	
  (ou	
  cisternas)	
  que	
  não	
  são	
  contínuas.	
  No	
  conjunto,	
  
elas	
  se	
  arranjam	
  como	
  uma	
  pilha	
  de	
  pratos	
  ou,	
  comparação	
  ainda	
  melhor,	
  como	
  vários	
  pães	
  
árabes	
  empilhados.	
  Olhando	
  mais	
  atentamente,	
  há	
  perfurações	
  nas	
  cisternas,	
  como	
  se	
  os	
  pães	
  
tivessem	
  buracos	
  não	
  alinhados.	
  De	
  cada	
  lado	
  da	
  pilha	
  há	
  uma	
  rede	
  de	
  túbulos.	
  
	
  
	
  
	
   As	
  vesículas	
  que	
  trazem	
  material	
  do	
  retículo	
  se	
  incorporam	
  à	
  primeira	
  rede	
  de	
  túbulos	
  
do	
  Golgi	
  e	
  daí	
  atingem	
  a	
  primeira	
  cisterna.	
  O	
  complexo	
  de	
  Golgi	
  é	
  muito	
  polarizado,	
  isto	
  é,	
  tem	
  
uma	
  face	
  diferente	
  da	
  outra.	
  As	
  vesículas	
  que	
  vêm	
  do	
  retículo	
  sempre	
  se	
  incorporam	
  ao	
  Golgi	
  
pelo	
  mesmo	
  lado.	
  Esse	
  lado	
  de	
  “entrada”	
  do	
  Golgi,	
  que	
  recebe	
  material	
  do	
  retículo,	
  é	
  chamado	
  
lado	
  (ou	
  face)	
  Cis,	
  enquanto	
  a	
  outra	
  extremidade,	
  mais	
  distante	
  do