ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE ÁGUA

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DEPARTAMENTO DE ANTIBIÓTICOS - CCB 
UNIVERSIDADE FEDERAL DE 
PERNAMBUCO. 
 
 
 
 
 
 
ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE ÁGUA 
 
 
 
 
Glícia Maria Torres Calazans 
Maria de Fátima Vieira de Queiroz Sousa 
José Otamar Falcão de Morais 
 
 
 
Recife 
2010 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 2 
 
ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE ÁGUA 
 
1. INTRODUÇÃO. 
A finalidade de se analisar bacteriologicamente uma amostra de água é investigar a 
presença das chamadas bactérias do grupo coliforme. Estas bactérias embora, geralmente, 
não sejam causadoras de doenças, podem estar associadas com outras patogênicas sendo 
assim bom índice de segurança bacteriológica de uma água. As bactérias coliformes são 
encontradas, normalmente, nos intestinos do homem e demais mamíferas, sendo expelidas 
em grande quantidade, através de seus dejetos. Assim se uma amostra água, contiver 
bactérias do grupo coliforme, outros tipos de microrganismos - causadores de doença - 
poderão estar igualmente presentes. 
A escolha das bactérias do grupo coliforme como indicadores de contaminação, deve-se à: 
 sua localização primordialmente intestinal; 
 grande quantidade em que são encontradas; 
 maior resistência fora de seu habitat natural, que os germes patogênicos; 
 facilidade de seu isolamento (incluindo meios de cultura e técnicas de trabalho). 
Ao grupo coliforme pertencem os bacilos aeróbios ou anaeróbios facultativos, Gram 
negativos, não esporulantes, móveis ou imóveis que fermentam lactose produzindo ácidos e 
gases (geralmente ácidos láctico e acético, CO2 e H2), dentro de 48 horas, a 35
o
C. 
Os coliformes compreendem principalmente Escherichia coli, Enterobacter aerogenes; em 
segundo plano, por serem menos freqüentes, vêm os chamados Intermediários: Citrobacter ( = 
Escherichia) freundii e suas variedades bioquímicas. 
 
2. COLETA DA AMOSTRA 
Frasco de amostra 
Os recipientes para coleta de amostra podem ser sacos plásticos estéreis ou frascos de 
plástico autoclavável, com capacidade para coletar pelo menos 100 ml de água deixando 
ainda um espaço para o ar, tornando possível a homogeneização da amostra, frascos brancos 
transparentes de vidro, com tampa de rosca ou esmerilhadas, com capacidade de 250 ml, 
também podem ser usados. Os frascos devem estar devidamente limpos e esterilizados. Na 
preparação do frasco de amostra, é conveniente juntar tiossulfato de sódio para eliminar 
qualquer ação de cloro residual (se trata de uma água clorada) posterior à coleta da amostra. 
Para tal fim, junta-se 0,1 ml de uma solução a 10% de tiossulfato de sódio ( = hipossulfito de 
sódio), que neste teor não tem qualquer ação nociva aos germes porventura existente. 
No caso de tampas de rosca não apertar por demais as tampas, e em se tratando de 
frascos de tampa esmerilhada, usar na preparação do frasco, entre a tampa e o gargalo, uma 
tirinha de papel, para permitir a saída livre do ar e circulação do vapor saturado (na autoclave). 
Por medida de segurança, proteger ainda a tampa do frasco com um papel ou folha metálica. 
Autoclavar os recipentes a 120 
o
C durante 20 minutos. 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 3 
 
3. TÉCNICA DE COLETA 
Todo o cuidado, na execução de uma técnica asséptica na coleta da amostra deve ser 
tomado. Durante a amostragem evita-se cuidadosamente tocar o interior ou a tampa do frasco; 
o papel deve ser afrouxado, devendo o operador segurar a tampa, para abri-lo, sem remover o 
papel, deixando, entretanto, cair por não mais necessária, a tirinha inserida no gargalo. 
Para colher amostras no sistema distribuidor de água, escolhe-se uma torneira e abrindo-a 
deixa-se a água fluir em jato forte durante 3-5 minutos; depois fecha-se e faz-se uma 
desinfecção enterna e internamente, com algodào embebido em solução de etanol diluída a 
70% ou solução diluída de hipoclorito de sódio. Alguns autores recomendavam a flambagem 
da torneira com algodão embebido em álcool na atualidade esta prática tem sido substituída 
pela desinfecção química. 
Em seguida abrese-se novamente a torneira deixando fluir a água em forte jato por um a 
dois minutos, diminui-se a vazão de água e com a torneira aberta moderadamente colhe-se a 
amostra não esquecendo de deixar o espaço de ar para a sua homogeneização. 
Poços com bombas manuais são operados de maneira semelhante, bombeando-se por 5 
minutos antes da tomada de amostra. Se o poço não tem bomba, faz-se descer o frasco 
esterilizado, ligado a um peso e com um dispositivo que permita abri-lo debaixo d’água. 
Existem frascos e dispositivos especiais para a coleta de amostras de água abaixo da 
superfície, a profundidades desejadas. 
 
4. REGISTRO DE DADOS. 
Devem ser anotados: 
 data e hora da coleta; 
 temperatura da água; 
 pH da água; 
 localização da tomada de amostra. 
Sempre que possível, medir o teor residual de cloro, no momento da coleta. 
A descrição da localização deve ser bastante exata para que outra pessoa possa chegar ao 
mesmo local. Pode ainda ser de utilidade o inquérito sanitário do lugar de onde provem a 
amostra, para a avaliação do suprimento, anotando informações tais como profundidade de 
poços, tempo de seu funcionamento, proximidade de fossas, etc. 
 
5. TRANSPORTE E TEMPO DE ESPERA 
O exame deve começar o mais cedo possível, de preferência dentro de 1 hora após a 
coleta. O tempo máximo decorrido entre a coleta e o exame, não deve exceder 24 horas. Se 
for o caso, deve-se estudar a possibilidade de realizá-lo no local da coleta. 
Tanto quanto possível, manter a temperatura da amostra próxima a da ocasião da retirada 
da mesma. Os métodos modernos de análise não mais recomendam o seu resfriamento pois 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 4 
consideram desprezíveis as alterações em tipos e números de bactérias durante a 
conservação. 
 
6. TÉCNICAS DE ANÁLISES 
 
6.1. TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS 
O método de fermentação em tubos múltiplos determina a presença e o número 
aproximado de coliformes através da inoculação de uma série de porções da amostra de água 
em tubos com meios de cultura adequados. O exame se processa através de três ensaios 
consecutivos: a) Ensaio presuntivo; b) Ensaio confirmativo e c) Ensaio completo diferencial. 
É possível parar a análise de água após qualquer um destes ensaios, desde que tenha sido 
atingida a finalidade da análise, ou se dá seqüência ao exame passando ao ensaio seguinte. 
Na prática de rotina, as provas bacteriológicas, da maior parte da água de abastecimento 
público, param no final do ensaio confirmativo, o qual na maioria das vezes é o único 
realizado. Este critério é válido para o exame de amostras tomadas na fonte de um 
abastecimento de água e nas várias fases do tratamento. 
Os métodos indicados pêlos Padrões de Água Potável do Serviço de Saúde Pública do 
Estados Unidos, os quais são normalmente aceitos entre nós recomendam, para testar águas 
com a qualidade de água potável, inocular 5 porções de 10 ml da amostra ou ainda, numa 
prova mais sensível, este plano pode ser aplicado à inoculação de 5 porções de 100 ml da 
amostra, o que é preferido em muitas estações de tratamento de água. 
 
6.1.2. ENSAIO PRESUNTIVO 
Meio de cultura utilizado: caldo lactosado, podendo ou não conter um indicador como o 
caldo lauril triptose que contém o indicador de Andrade ou púrpura de bromocresol. 
Geralmente são usados 5 tubos grandes - com os respectivos tubos de Durham invertidos, 
para recolhimento de gases - com 10 ml cada um de meio de caldo lactosado de concentração 
dupla e 10 tubos menores também munidos com tubos de Durham com 10 ml cada um de 
caldo lactosado. Na impossibilidade da obtenção no comércio dos tubos de Durham, pode-se 
fazer uso de pequenas ampolas de injeção vazias. 
Técnica: com pipeta estéril de 10 ml, inocular cada umdos 5 tubos grandes (com caldo 
lactosado duplo) com 10 ml da amostra; com uma outra pipeta de 1 ml, estéril, inocular 1,0 ml 
da amostra em cada um de 5 tubos com caldo lactosado (concentração simples) e depois 
transferir 1 ml da amostra para um tubo de diluição com 9 ml de água estéril ou água 
tamponada estéril. Desta diluição de 1/10, inocular 1 ml em cada um dos 5 tubos de caldo 
lactosado restantes. Agitar cuidadosamente os tubos e incubá-los a 35 
o
C. 
1
a
 observação: após 24 h de incubação. Se houver formação de gás em qualquer 
quantidade, em qualquer tubo, o ensaio presuntivo é positivo. Se não houver gás, prolonga-se 
a incubação por mais 24 h. 
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2
a
 observação: após 48 h de incubação. Se após este período não houver gás em qualquer 
tubo, o ensaio é negativo e a análise está encerrada quanto a coliformes. Havendo formação 
de gás, anota-se o número de tubos positivos e negativos. 
 
6.1.3. ENSAIO CONFIRMATIVO 
Um ensaio presuntivo positivo, não indica necessariamente, a presença de coliformes; 
alguns germes da flora normal de águas e do solo, principalmente bacilos esporulados Gram-
positivos anaeróbios do gênero Clostridium são capazes de fermentar a lactose com produção 
de gases. Também a ação sinérgica de duas espécies diferentes de bactérias pode resultar no 
aparecimento de gases. Nesta hipótese, uma das espécies seria capaz de hidrolisar a lactose, 
liberando glicose e galactose; a glicose é um açúcar facilmente fermentescível, sendo atacada 
pela segunda espécie. O ensaio confirmativo tem assim por finalidade afastar estas duas 
possibilidades. 
Meios de cultura utilizados: baseia-se no emprego de meios nos quais os germes Gram-
positivos são inibidos não o sendo os germes Gram-negativos. Podem ser usados meios 
líquidos (caldo lactosado adicionado ou de verde-brilhante ou de fucsina ou de cristal violeta, 
com ou sem sais biliares p. ex.), ou ainda meios sólidos igualmente adicionados de 
substâncias inibidoras. 
Ensaio confirmativo em meio líquido: de cada um dos tubos positivos usados no ensaio 
presuntivo, transferir com alça estéril, após agitação, uma gota para um tubo com caldo verde-
brilhante lactose bile, igualmente dotado de tubinhos de Durham. Assim serão usados tantos 
tubos com caldo verde-brilhante quantos forem os tubos positivos do ensaio presuntivo. 
Incubar a 35 
o
C durante 24-48 h. Os tubos que apresentarem bolhas de gás são aqueles em 
que ficou confirmada a presença de germes coliformes. Devem ser anotados, recorrendo-se 
em seguida a tabela de Hoskins que indica, baseada em estatística, o número mais provável 
de coliformes existentes em 100 ml da amostra. Este número constitui o N. M. P. 
Ensaio confirmativo em meio sólido: para realizar este ensaio pode-se partir de um ou mais 
tubos fermentados do ensaio presuntivo ou de um dos tubos positivos usados no ensaio 
confirmativo em meio líquido. Uma boa prática consiste em realizar este ensaio, tão logo 
comece a fermentação em qualquer dos tubos, na suposição de que os coliformes por melhor 
adaptados aos meios utilizados, predominarão nos primeiros estágios do crescimento. Neste 
ensaio podem ser usados os meios de EMB (eosina - azul de metileno), Endo, MacConkey e 
outros. 
Com uma alça de platina espalhar uma gota do líquido (do tubo positivo) na superfície do 
meio sólido já colocado na placa. Incuba-se a placa em estufa a 35 
o
C durante 24 h. 
Observa-se, para determinar se houve ou não crescimento de colônias; o não crescimento 
indica que o ensaio confirmativo é negativo, ou seja, não há presença de germes coliformes. 
Esta possibilidade refere-se ao uso direto de um tubo de caldo lactosado do ensaio presuntivo 
para inocular a placa do meio confirmativo. 
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Quando, no entanto, partindo de um tubo fermentado do ensaio confirmativo ou de um tubo 
positivo do ensaio presuntivo, aparecerem colônias, estas devem ser escolhidas e transferidas, 
cada uma, para dois tubos, um contendo meio AN (ágar-nutritivo) e outro caldo lactosado. 
A escolha as colônias baseia-se no conhecimento prático do operador, que determinará as 
colônias típicas de coliformes, a transferir. 
São exemplos de colônias típicas: 
1. Colônias pequenas, vermelho-escuras, as vezes com brilho metálico (geralmente são de 
Escherichia coli). 
2. Colônias maiores, mais claras, as vezes com centro escuro, muitas vezes mucilaginosas 
(geralmente são de Enterobacter aerogenes). 
Os tubos de AN e caldo lactosado, inoculados a partir de colônias típicas - ou em falta 
destas de uma colônia rósea-clara atípica - serão incubados a 35 
o
C durante 24-48 h. Se após 
48 h não houver fermentação no tubo com caldo lactosado (será mais prudente esperar até 72 
h, se bem que os coliformes típicos, estatisticamente mais prováveis de ocorrer, produzem 
gás, logo nas primeiras 24 h de incubação), o ensaio confirmativo é negativo. 
Caso haja formação de gás faz-se uma coloração de Gram, partindo-se da cultura em AN. 
Tratando-se de bastonetes Gram-negativos, não esporulantes, o ensaio confirmativo é 
positivo. 
Para verificação de coliformes fecais ou termotolerantes utiliza-se o meio EC. Também 
podem ser utilizados meios sólidos adicionados de substâncias inibidoras, ex.: EMB, Endo e 
Mac Conkey. 
 
6.1.4. ENSAIO COMPLETO OU DIFERENCIAL 
Partindo da cultura de coliformes em ágar-nutritivo (AN) obtida no ensaio anterior inocula-
se: 
a) um tubo de caldo-peptona ou caldo triptona, para o teste de Indol. Caso se use peptona 
dá-se preferência à de caseína ou faz-se teste, usando uma cultura conhecida de Escherichia 
coli, para verificar a presença de triptofano na peptona utilizada. (Se Escherichia coli típica não 
produzir Indol, a peptona não deve ser usada). 
b) um tubo com caldo glicosado-fosfatado (meio de Clark Lubs), para os testes de vermelho 
de metila e de acetil-metil-carbinol ou de Voges-Proskauer. 
c) um tubo com meio citratado de Koser para a prova de utilização de citrato. Pode-se 
também usar um meio citratado sólido, o meio de citrato de Simmons. 
Após o semeio, os tubos serão incubados à 35
o
C. Estes testes são conhecidos pela sigla 
IMViC. 
Teste de indol: após incubação durante 18 a 24 h, juntar à cultura crescida 0,2 a 0,3 ml do 
reagente de Kovacs. O aparecimento de anel sobrenadante vermelho intenso indica a 
presença de indol. Se a cor do reagente permanecer inalterada: indol negativo. 
Triptona → indol + reativo de Kovacs → anel vermelho. 
Glicose → ácidos + vermelho de metila → cor vermelha 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 7 
Teste de Voges-Proskauer (método de Barrit) 
Após incubação no caldo glicosado-fosfatado por 48 h, retira-se com pipeta estéril 1 ml da 
amostra crescida para outro tubo de ensaio; junta-se 0,6 ml de solução de -naftol e 0,2 ml de 
KOH a 40%. Agita-se vigorosamente e deixa-se em repouso em estufa a 35 
o
C. 
Observa-se a partir de 15 min até um máximo de 4 h. O aparecimento de coloração cereja 
que se estende da superfície para o fundo do tubo indica um teste VP positivo. 
O aparecimento de coloração acobreada ou mesmo de coloração vermelha após 4 horas de 
observação não deve ser levado em consideração. 
O caldo de cultura restante é reincubado por mais 2 ou 3 dias para a prova de vermelho de 
metila. 
Teste de vermelho de metila 
A cultura em meio glicosado-fosfatado e que ficou incubada por 4 e 5 dias, junta-se 
algumas gotas do indicador vermelho de metila. A cor vermelha indica vermelho de metila 
positivo. Cor amarela indica vermelho de metila negativo. 
Teste de citrato 
A amostra de coliforme é inoculada no meio de citrato de Koser, de preferência com uma 
agulha e levando o mínimo possível de material. Incuba-se o tubo em estufa a 35
o
C de 72 a 96 
h. 
Prova positiva:crescimento visível (o meio fica turvo). 
Prova negativa: ausência de crescimento ( o meio permanece límpido). 
O teste realizado em meio de Simmons apresenta uma viragem do indicador azul de 
bromotimol, de verde para azul indicando o teste positivo para citrato. 
Obs.: Nestes testes, o citrato é utilizado como fonte de carbono e de Nitrogênio inorgânico nas 
sínteses orgânicas. 
Citrato de Simmons - viragem azul de bromotimol (alcalinização do meio na utilização) 
> Positivo = azul intenso. 
 
6.1.5. COLIFORMES TERMOTOLERANTES 
Geralmente os testes referidos são suficientes para determinar a espécie do coliforme 
presente. Entretanto muitas vezes deseja-se separar os componentes de origem fecal dos 
provenientes de outras fontes. Estas determinações de coliformes fecais são aplicáveis às 
estimativas do grau de poluição das águas brutas submetidas a processos de depuração, ou a 
estudos de poluição dos cursos de água ou ainda à interpretação de dados sobre coliformes 
totais cuja significação seja duvidosa. 
Estes ensaios são realizados a partir dos tubos positivos do ensaio presuntivo. De cada 
positivo, inocula-se um tubo com meio EC, incubando-se em seguida em banho-maria a 
44,5
o
C  0,2
o
C durante 24 horas. Os tubos devem ser previamente aquecidos a 44,5
o
C e 
após sua inoculação colocados imediatamente no banho-maria. 
A produção de gás dentro de 24 h é considerada positiva para a presença de coliformes e 
sua densidade numérica é calculada pela tabela N. M. P. 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 8 
 
Baseada nos testes realizados encontra-se a seguinte classificação: 
 
Interpretação das reações IMViC 
Microorganismos Indol Vermelho 
de metila 
Voges-
Proskauer 
Citrato 
Escherichia coli 
Variedade I + + - - 
Variedade II - + - - 
 
Escherichia freundii 
(Intermediários) 
 
Variedade I - + -  
Variedade II + + - + 
 
Enterobacter aerogenes 
Variedade I - - +  
Variedade II + - + + 
 
 
CONTAGEM DE BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS. 
Reveste-se de importância, muitas vezes, a determinação do número de colônias em 
placas, também chamada contagem padrão em placas (n
o
 de colônias desenvolvidas em 
placas de Petri com meio de ágar-nutrivo-glicosado, incubadas em aerobiose a 35 
o
C até 72 
horas). 
Esta contagem pode ser de grande utilidade no controle da eficiência dos filtros nas plantas 
de tratamento, bem como pode ajudar, quando associados aos demais resultados, a interpretar 
corretamente uma análise. 
As águas de rios, poços recentemente abertos ou descobertos, piscinas, etc, costumam dar 
uma contagem alta. 
Águas de poços tubulares profundos, ou águas tratadas (cloradas), devem dar uma 
contagem pequena. 
Técnica: para assegurar-se a realização da contagem em placas costuma-se, além da 
inoculação da amostra original, efetuar-se diluições decimais, que irão de 1/10 (para águas 
sabidamente boas) até 1/10
5
 quando se fizeram necessárias. 
Estas diluições são feitas com frascos ou tubos contendo água tamponada (com KH2PO4) 
ou água de torneira ou destilada estéreis. A amostra deve ser agitada vigorosamente antes de 
se iniciar as diluições. Usando de tubos, faz-se a 1
a
 diluição (1/10) colocando 1 ml da amostra 
em 9 ml de água tamponada estéril; agita-se bem e transfere-se 1 ml para outro tubo de 9 ml 
da água tamponada estéril (1/100), prossegue-se desta maneira até que se tenha todas as 
diluições desejadas. 
De cada diluição transfere-se então 1 ml para placa de Petri estéril (é aconselhável fazer 
duplicatas ou triplicatas se possível) e juntar 10 a 15 ml de maio de ágar-glicosado (GA) 
fundido e resfriado entre 42-45
o
C. Agitar a placa por movimentos circulares nos dois sentidos 
e, também, segundo dois diâmetros perpendiculares evitando sujar a tampa. 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 9 
Deixa-se solidificar e incubar-se em estufa a 35
o
C durante 24 h. Após a incubação 
examinam-se as placas escolhendo para contagem as que tenham entre 30 e 300 colônias 
(evidentemente se a placa inoculada com 1 ml da amostra não diluída tiver um número inferior 
a 30 colônias, esse número é registrado). Usa-se para auxiliar na contagem um aparelho 
especial munido de lupa, o contador de colônias tipo Quebec. 
Se as placas escolhidas forem originadas de qualquer das diluições não se deve esquecer 
que o resultado final será: a média do n
o
 de colônias nas placas X recíproca de diluição. Na 
prática, esta contagem é feita na mesma ocasião em que é feito o ensaio presuntivo, 
planejando-se o trabalho para que se gaste o menor número de pipetas estéreis. Veja o 
esquema 2 de operações que conjuga o ensaio presuntivo e a contagem em placas 
simultaneamente. 
 
CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES 
Não é fácil interpretar corretamente os resultados de uma análise de água. As observações 
locais - natureza do terreno onde um poço está localizado; se o reservatório é descoberto ou 
mal coberto; se há fossa nas imediações ou se há acesso de água de chuva, etc - ajudam 
bastante a interpretação. 
Pode-se adotar na decisão sobre a potabilidade bacteriológica, como guia, os limites 
estabelecidos pelos Padrões de Água Potável do Serviço de Saúde Pública dos Estados 
Unidos. Estes limites são baseados na inoculação inicial de 5 porções de 10 ml ou 5 de 100 ml 
de uma amostra-padrão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 10 
TABELA DE HOSKINS PARA SÉRIE DE 05 TUBOS 
 
Índice de NMP e limites de confiança de 95% quando são utilizados inóculos de 10 ml, 1 ml e 0,1 ml em séries de 5 tubos. 
N
o
 de tubos com reação positiva quando utilizados, em séries de 5 tubos 
com inóculos de: 
 
Índice 
NMP/100mL 
Limite de confiança de 95% 
10 ml 1 ml 0, 1 ml inferior superior 
0 
0 
0 
0 
1 
1 
1 
1 
1 
2 
2 
2 
2 
2 
2 
3 
3 
3 
3 
3 
3 
4 
4 
4 
4 
4 
4 
4 
4 
4 
4 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
 
0 
0 
1 
2 
0 
0 
1 
1 
2 
0 
0 
1 
1 
2 
3 
0 
0 
1 
1 
2 
2 
0 
0 
1 
1 
1 
2 
2 
3 
3 
4 
0 
0 
0 
1 
1 
1 
2 
2 
2 
3 
3 
3 
3 
4 
4 
4 
4 
4 
5 
5 
5 
5 
5 
5 
 
0 
1 
0 
0 
0 
1 
0 
1 
0 
0 
1 
0 
1 
0 
0 
0 
1 
0 
1 
0 
1 
0 
1 
0 
1 
2 
0 
1 
0 
1 
0 
0 
1 
2 
0 
1 
2 
0 
1 
2 
0 
1 
2 
3 
0 
1 
2 
3 
4 
0 
1 
2 
3 
4 
5 
 
<2 
2 
2 
4 
2 
4 
4 
6 
6 
4 
7 
7 
9 
9 
12 
8 
11 
11 
14 
14 
17 
13 
17 
17 
21 
26 
22 
26 
27 
33 
34 
23 
30 
40 
30 
50 
60 
50 
70 
90 
80 
110 
140 
170 
130 
170 
220 
280 
350 
240 
300 
500 
900 
1600 
1600 
- 
1 
1 
1 
1 
1 
1 
2 
2 
1 
2 
2 
3 
3 
5 
3 
4 
4 
6 
6 
7 
5 
7 
7 
9 
12 
9 
12 
12 
15 
16 
9 
10 
20 
10 
20 
30 
20 
30 
40 
30 
40 
60 
80 
50 
70 
100 
120 
160 
100 
100 
200 
300 
600 
- 
 
 
- 
10 
10 
13 
11 
15 
15 
18 
18 
17 
20 
21 
24 
25 
29 
24 
29 
29 
35 
35 
40 
38 
45 
46 
55 
63 
56 
65 
67 
77 
80 
86 
110 
140 
120 
150 
180 
170 
210 
250 
250 
300 
360 
410 
390 
480 
580 
690 
820 
940 
1300 
2000 
2900 
5300 
- 
 
 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 11 
MOST PROBABLE NUMBER 
Three successive dilutions should be used to cover a suitable range of both positive and negative vials. The MPN can be estimated by multiplying the MPN 
derived from the table by the dilution factor of the first dilution. For example: if the first three dilutions (1/10; 1/100; 1/1000) are used, an MPN from the table of 
15 indicates numbers of 15x10 = 150 per mL of sample. For example: if 1/100; 1/1000 and 1/10000 dilutions are used, an MPN of 15 indicates numbers of 15 
x 100 = 1500 mL per sample. 
 
VALES OF THE MPN FOR 3 TUBES WITH THREEE SUCCESSIVE 10-FOLD DILUTIONS 
 Number of positive tubes observed at each dilution MPN per mL of 
the first dilution 
1
stdilution 2
nd 
dilution 3
rd 
dilution 
0 0 0 0,0 
0 0 1 0,3 
0 1 0 0,3 
0 1 1 0,6 
0 2 0 0,6 
1 0 0 0,4 
1 0 1 0,7 
1 0 2 1,1 
1 1 0 0,7 
1 1 1 1,1 
1 2 0 1,1 
1 2 1 1,5 
1 3 0 1,6 
2 0 0 0,9 
2 0 1 1,4 
2 0 2 2,0 
2 1 0 1,5 
2 1 1 2,0 
2 1 2 3,0 
2 2 0 2,0 
2 2 1 3,0 
2 2 2 3,5 
2 2 3 4,0 
2 3 0 3,0 
2 3 1 3,5 
2 3 2 4,0 
3 0 0 2,5 
3 0 1 4,0 
3 0 2 6,5 
3 1 0 4,5 
3 1 1 7,5 
3 1 2 11,5 
3 1 3 16,0 
3 2 0 9,5 
3 2 1 15,0 
3 2 2 20,0 
3 2 3 30,0 
3 3 0 25,0 
3 3 1 45,0 
3 3 2 110,0 
3 3 3 140,0 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 12 
 
Tabela índice de NMP e limites de confiança de 95% , quando inoculadas 10 
porções de 10ml da amostra 
 
 
Número de tubos com 
reação positiva a partir de 
10 tubos de 10mL 
Índice de NMP 100 
mL 
Limites de confiança 
de 95% 
Inferior Superior 
 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 
8 
9 
10 
<1,1 
1,1 
2,2 
3,6 
5,1 
6,9 
9,2 
12,0 
16,1 
23,0 
>23,0 
0 
0,03 
0,26 
0,69 
1,3 
2,1 
3,1 
4,3 
5,9 
8,1 
13,5 
3,0 
5,9 
8,1 
10,6 
13,4 
16,8 
21,1 
27,1 
36,8 
59,9 
Inifinito 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 13 
1. TÉCNICA DE TUBOS MÚLTIPLOS 
 
 
ESQUEMA DE INOCULAÇÃO DA ÁGUA 
 
 
 
I. TESTE PRESUNTIVO 
 
 
 
 
 
 
 
 
9ml 
água 
Diluído 
 1/10 
5 tubos com 
10ml de C.L. 
Simples 
5 tubos com 
10ml de C.L. 
duplo 
5 tubos com 
10ml de C.L. 
Simples 
Incubar a 35°C 
durante 24-48h. 
Formação de gás Não formação 
 de gás 
 POSITIVO PARA NEGATIVO 
 COLIFORMES 
1ml 
10ml 1ml 1ml 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 14 
 
 
 
II. TESTE CONFIRMATIVO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VB ou 
Fucsina ou 
Cristal-violetacom 
ou sem bil 
e 
Tubos Positivos 
CLVBB EC 
 
Presença de bolhas 
POSITIVO PARA 
 COLIFORMES 
TOTAIS 
POSITIVO PARA 
 COLIFORMES 
TERMOTOLERANTES 
Incubar a 35°c 
durante 24h 
Transferir colônias 
típicas 
Incubar 35°c 
durante 24-48h 
EMB, ENDO ou 
 Mac-Conkey 
Gram 
Bastonetes Gram-negativos 
 não esporulantes 
POSITIVO PARA 
COLIFORMES 
An CL 
24-48h 
35 oC 
44,5 oC 
24h 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 15 
III. ENSAIO COMPLETO OU DIFERENCIAL 
 
 
Testes IMVC
Meio An
 INDOL VERMELHO DE VOGES-PROSKAUER CITRATO
 METILA 
Incubar a 35°C
durante
4 a 5 dias..
Incubar a 35°C
durante
18-24h.
Incubar a 35°C
durante
48h.
Incubar a 35°C
durante
72-96h.
0,2 a 0,3ml 
reagente de Kovacs
Gotas do VM
1ml amostra
+0,6ml solução
alfa-naftol e 
0,2ml de KOH 
a 40%. 
Agitar e incubar 
a 35°C por 
15min a 4h
Caldo glicosado 
fosfatado 
(Clark Lubs)
V.P. POSITIVOINDOL 
POSITIVO
V-M
POSITIVO
V-M
NEGATIVO
Crescimento 
Visível
CITRATO
POSITIVO
CITRATO
NEGATIVO
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 16 
IV. INTERPRETAÇÃO DAS REAÇÕES DE I.M.V.C 
 
 
MICRORGANISMOS 
 
INDOL 
 
VERMELHO DE 
METILA 
 
Voges-
Proskauer 
 
CITRATO 
Escherichia coli 
Variedade I 
Variedade II 
 
+ 
- 
 
+ 
+ 
 
- 
- 
 
- 
- 
Escherichia freundii 
Variedade I 
Variedade II 
 
- 
+ 
 
+ 
+ 
 
- 
- 
 
+- 
+ 
Enterobacter aerogenes 
Variedade I 
Variedade II 
 
- 
+ 
 
- 
- 
 
+ 
+ 
 
+- 
+ 
 
 
 
Coloração de Gram: 
 
 Cobrir a lâmina com solução de cristal de violeta por 1 min,. 
 Lavar com água corrente, 
 Cobrir com solução de lugol durante 1 min, 
 Descorar usando solução álcool-acetona (1:1), 
 Cobrir com solução safranina diluída por 15 seg, 
 Lavar a lâmina com água corrente e deixar secar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 17 
V. CONTAGEM DE HETEROTRÓFICOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9ml 9ml 9ml 9ml 
Plate count Agar - PCA 
fundido 
1ml 
1ml não 
diluído 
1ml 
Incubar a 35°C 
durante 48-72h 
CONTAGEM NO CONTADOR 
DE COLÔNIAS TIPO QUEBEC 
Média do nº de colônias X diluição 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 18 
 
 
 
PROVAS BIOQUÍMICAS – IMViC 
 
Teste da produção de indol 
a) Princípio: 
Determinar a habilidade de um determinado microrganismo produzir indol a partir da 
molécula do triptofano. 
 
b) Bases bioquímicas: 
O triptofano é um aminoácido essencial que pode sofrer oxidação por meio da atividade 
enzimática de certas bactérias. A conversão do triptofano em produtos metabólicos é mediada 
pela enzima triptofanase. Esta capacidade de hidrolisar o triptofano com a produção de indol 
não é uma característica de todos os microrganismos e, portanto serve como um marcador 
bioquímico. 
A presença do indol é detectada pela adição do reagente de Kovacs (p-dimetilamino 
benzaldeído, butanol e ácido clorídrico) que produz uma camada vermelha devido à formação 
de um complexo quinoidal. 
 
Triptofano ( triptofanase ) → indol + ácido pirúvico + amônia 
 H2O 
 Desaminação + 
 
 
 p-dimetilamino benzaldeído 
 
 HCl + álcool 
 
 
 Composto quinoidal 
 (vermelho) 
 
 
d)Técnica 
A inoculação das bactérias em caldo peptonado ou triptonado deve seguir as normas de 
semeadura usualmente empregadas em microbiologia. Incubar a 35ºC por 24 horas. 
 
e) Resultado 
Para fazer a leitura, adicionam-se cinco gotas do reativo de Kovacs. 
 
f) Interpretação 
No teste positivo, a presença do indol no meio de cultivo é revelada pela adição do reativo 
de Kovacs, ocorrendo então a seguinte reação química: o p-dimetilamino benzaldeído se liga à 
molécula do indol, produzindo um composto quinoidal de coloração vermelha, evidenciado 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 19 
pela formação de um anel na camada alcoólica superficial do meio. A reação de cor, na 
realidade, é devida à reação dos grupos CH2 do anel pirrólico da molécula do indol com o 
aldeído, que num meio ácido forma uma quinona. 
O teste negativo fica amarelo, que é a cor do reativo de Kovacs. 
Teste do vermelho de metila 
a) Princípio: 
Testar a habilidade de um microrganismo em produzir ácidos orgânicos, relativamente 
estáveis, a partir da fermentação da glicose, de modo a suplantar a capacidade tampão 
existente no meio de cultivo. 
 
 
b) Bases bioquímicas: 
Neste teste será pesquisada a fermentação ácida mista, em que as bactérias utilizam a 
glicose como substrato e liberam grande concentração de ácidos como produto final. 
Os principais gêneros que realizam esta fermentação são: Escherichia, Salmonella, Shigella 
e Proteus 
 
Glicose ácido lático 
 ácido acético 
 ácido fórmico 
 ácido succínico 
 
d)Técnica 
A inoculação das bactérias em caldo glicosado-fosfatado deve seguir as normas de 
semeadura usualmente empregadas em microbiologia. Incubar a 35ºC por 24 horas. 
 
e) Resultado 
Antes de efetuar a leitura, retirar 2,5 mL de 5 mL de meio fermentado e acrescentar cinco 
gotas de uma solução hidroalcoólica de vermelho de metila. O vermelho de metila é um 
indicador em que a faixa de viragem do pH é de 4,4 a 6,2, ou seja, um pH = 4,4 toma a 
coloração vermelha e um pH = 6,2 toma a coloração amarela.f) Interpretação 
Os microrganismos que dão resultado positivo fermentam a glicose produzindo ácidos e 
dando um pH final muito baixo, vencendo o sistema tampão de fosfato e mantendo o meio 
ácido. 
 Os microrganismos que dão resultado negativo produzem ácidos, porém o pH é mais 
elevado (pH ~ 6,0) porque eles continuam metabolizando os produtos iniciais da fermentação 
por descarboxilação, produzindo acetoína. 
 
Teste de Voges Proskauer 
 
 
H2 + CO2 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 20 
a) Princípio 
Determinar a habilidade de certo microrganismo em produzir um composto neutro, o 
acetilmetilcarbinol (acetoína), a partir da fermentação da glicose. 
b) Bases bioquímicas 
Neste teste será pesquisada a fermentação butilenoglicol, na qual as bactérias utilizam a 
glicose como substrato e liberam acetoína como principal produto final. 
Os principais gêneros que realizam esta fermentação são: Enterobacter e Aeromonas. 
 
Glicose 
 
 
 
2 Ácido pirúvico 
 
Descarboxilação 
 
 
 Acetilmetilcarbinol 
Redução 2,3 
(Acetoína) Butanodiol 
 
 Oxidação 
 
 
  naftol + 
 KOH a 40% Diacetila + H2O 
 
 
Diacetila + Núcleo guanidina Composto vermelho 
 (Arginina) Condensação 
 
 
d) Técnica 
A inoculação das bactérias em caldo glicosado-fosfatado deve seguir as normas de 
semeadura usualmente empregadas em microbiologia. Incubar a 35ºC por 24 horas. 
 
e) Resultado: 
Antes de efetuar a leitura, aos 2,5 mL restantes dos 5 mL de meio fermentado em tubo do 
teste do vermelho de metila, adicionar os seguintes reativos de Barrit nesta ordem: 0,6 mL de 
uma solução de alfa-naftol a 5% e 0,2 mL de uma solução de KOH a 40%. Agitar o tubo 
suavemente para oxigenar o meio, a fim de oxidar a acetoína e obter uma reação de cor. 
Finalmente, deixar descansar o tubo por cerca de 10 a 15 minutos antes de iniciar a 
interpretação. 
 
f) Interpretação 
Depois de unir o alfa-naftol e o KOH, agita-se suavemente o tubo para o oxigênio 
atmosférico entrar e oxida a acetoína em diacetila, sendo que o KOH atua como agente 
oxidante e o alfa-naftol como catalizador e intensificador de cor. 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 21 
Com o uso de um agente oxidante, a cor produzida desaparece rapidamente, sobretudo 
porque o complexo de reação diacetila-peptona pode ser rapidamente oxidado num composto 
incolor. 
Concluindo, o resultado positivo será de rosa a vermelho e o negativo terá a cor cobre, que 
é a reação entre o KOH e o alfa-naftol. 
Teste do citrato 
a) Princípio: 
Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono 
para seu crescimento com conseqüente alcalinização do meio. 
b) Bases bioquímicas 
Neste teste serão observadas as bactérias que metabolizam o substrato citrato pelo ciclo de 
Krebs (oxidação) ou pelo ciclo de fermentação, resultando como produto final pH alcalino, 
acetato + formato. 
O meio utilizado para a fermentação do citrato contém sais de amônia inorgânica. Um 
microrganismo que é capaz de usar citrato corno uma única fonte de carbono utiliza também 
sais de amônia como sua fonte única de nitrogênio. Os sais de amônia se desdobram em 
amoníaco com conseqüente alcalinidade. 
 
 ciclo de Krebs 
Citrato Citratase (citrato oxaloacetato - liase) 
 ciclo da fermentação do citrato 
 Citrato oxaloacetato + acetato 
 
 piruvato + CO2 
 pH alcalino 
 
 
 acetato + formato 
 
 
d) Técnica: 
A inoculação das bactérias no meio de citrato de Simmons deve seguir as normas de 
semeadura em meio sólido, usualmente empregadas em microbiologia. Incubar a 35ºC por 24 
horas. 
f) Interpretação 
As bactérias que utilizam o citrato, como única fonte de carbono terão como resultado 
positivo cor azul (pH alcalino), que é um produto do metabolismo do sal inorgânico 
acrescentado no meio, pois o produto do metabolismo do citrato é difícil de detectar, porque 
são dois sais. Portanto, sabe-se que o citrato foi metabolizado, pelo produto do metabolismo 
do sal inorgânico de amônio, porque neste meio foram colocadas uma fonte de carbono que é 
o citrato, e uma de nitrogênio, que é um sal inorgânico de amônio. 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 22 
O teste negativo será verde e sem crescimento, pois a bactéria, não conseguindo utilizar a 
fonte de carbono e de nitrogênio do meio não sobreviverá. 
 
Resumo das Provas Bioquímicas - IMViC 
 
 
 
 
Fonte: MICROBIOLOGY: a laboratory manual. Cappuccino, J.G. & Sherman, N.; The 
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.; 4
th
 Edition; 1996 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 23 
 
6. 2. TÉCNICA DA MEMBRANA FILTRANTE 
 
Este método baseia-se na filtração a vácuo de volumes adequados com diluições variadas 
(10
-1
, 10
-2
, 10
-3
...) de água através de uma membrana com porosidade de 0,45μm. As bactérias 
com diâmetro maior ficarão retidas na membrana e esta será transferida para meio de cultura 
diferencial, seletivo e nutritivo, dependendo do tipo de bactéria a ser identificada (ex: meio 
ágar M-TEC para E. coli, ágar M-enterococos para estreptococos fecais...). Este teste revela a 
presença ou não de coliformes totais. 
As placas serão incubadas a 35°C durante 24 horas. Após este período observa-se 
colônias típicas e atípicas realizando a contagem destas para o cálculo da densidade. 
O limite aceitável é de 20 a 80 colônias típicas de coliformes totais, sendo que a contagem 
total de colônias típicas e atípicas deve ser inferior a 200. 
 
VOLUME DA AMOSTRA: 
Para consumo humano -- Volume mínimo de 100ml. 
Para águas "in natura" -- 50ml, 25ml, 5ml, etc. (dependendo da procedência). 
 
Para a identificação dos coliformes fecais, retirar uma porção da colônia que ficou retida na 
membrana e inocular em tubo com EC e incubar a 44°C durante 24h. A formação de gás 
indica presença de coliformes fecais. 
 
Cálculo dos resultados 
 
* Nº colônias de coliformes totais/100ml = nº colônias típicas __ X 100 
 Volume filtrado da amostra (ml) 
NCMF (nº de colônias em membrana filtrante)/100ml. 
Presença ou ausência de coliformes fecais em 100ml. 
Nº colônias de coliformes totais/100mL: < 1 (ausente) 
 
Quando a contagem não for efetuada devido ao grande número de colônias (>200), seguir: 
 
Presença de coliformes totais e/ou fecais: Contagem prejudicada devido ao crescimento 
confluente. 
 
6.3. TÉCNICA DE PRESENÇA - AUSÊNCIA (P/A) 
 
É uma modificação simplificada da técnica de tubos múltiplos onde se utiliza um maior 
volume da amostra (100ml) e 50 ml de meio P-A com concentração tripla, para obter 
informações sobre a presença de coliformes. Incubar a 35° por 24-48h dependendo do 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 24 
resultado. Após este período, se positivo, realizar a diferenciação de totais e fecais utilizando 
os meios CLVBB (incubar a 35°C) e EC (incubar a 44,5°C ± 0,2) ambos num período de 24 a 
48 horas. A presença de gás em cada um destes meios indica positividade para coliformes 
totais e termotolerantes (fecais). 
Esta técnica é mais simples além de ter um baixo custo do que a de tubos múltiplos e 
membrana filtrante, e apresenta resultados fidedignos. 
 
6.4. TÉCNICA DO SUBSTRATO CROMOGÊNICO E FLUOROGÊNICO 
 
 Esta técnica baseia-se na identificação de enzimas produzidas por microrganismos, 
através da alteração de cor sem nenhuma necessidade de testes confirmativos. Baseia-se na 
adição de um volume da amostra em frasco estéril contendo o substrato em pó, hidrolisável 
que é usado como substrato definido apenaspara os microrganismos alvo que se quer 
modificar, com posterior incubação, obtendo-se os resultados após 24-48 horas. 
 
As bactérias coliformes possuem a enzima β-D-galactosidase que hidrolisa a molécula 
de ONPG, que atua como nutriente-indicador, liberando uma substância cromogênica amarela 
ou azul dependendo do fabricante do produto, indicando positividade para coliformes totais. 
Algumas bactérias como as do gênero Aeromonas e Pseudomonas também possuem esta 
enzima hidrolítica, só que estas são suprimidas, não produzindo uma resposta positiva, a 
menos que estejam presentes em densidades superiores a 10
4
 unidades formadoras de 
colônias por ml. 
 
E.coli possui uma enzima glucoronidase que hidrolisa o MUG liberando 4-
metilumbelliferona que, quando exposto a UV (366nm) apresenta fluorescência de cor azul 
brilhante. Se a coloração for duvidosa, incubar a 35°C por mais 4 horas. 
 
Identificação de coliformes totais e Escherichia coli num mesmo meio: 
 
 Transferir 100 ml da amostra de água para um frasco estéril; adicionar o conteúdo do 
flaconete contendo os substratos ONPG (orto-nitrofenil β-D galactopiranosídeo) e 
MUG (4-metilumbeliferil β-D glucoronídeo); 
 Agitar vigorosamente até a dissolução do substrato; 
 Incubar a 35°C durante 24 horas e observar a modificação da cor, a qual dependerá do 
fabricante do substrato a ser usado (amarelo ou azul). Exemplo: a cor mudará de 
amarelo (negativo) para azul esverdeado (positivo), indicando a presença de 
coliformes totais. 
 Após a leitura de coliformes totais o frasco deverá ser irradiado com luz ultravioleta. 
Se houver aparecimento de fluorescência no meio irradiado, a qual se evidencia pela 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 25 
emissão de luz azulada fluorescente, que ocorrerá a partir do cultivo líquido contido no 
frasco, o teste é considerado positivo para Escherichia coli (coliforme fecal). 
TÉCNICA DA MEMBRANA FILTRANTE 
 
 Avaliação de águas minerais e potáveis, 
 Avaliação e controle de águas tratadas, 
 Avaliação e controle das condições higiênicas de sistemas industriais. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Incubar a 35°C 
durante 24h. 
------- 
------------- 
---------- 
I 
I 
I 
I 
I 
I Incubar a 44,5°C 
durante 24h. 
Cálculo dos resultados 
Nº de colônias /100ml= X 100 
 nº de colônias típicas 
M-endo 
Ágar LES 
Ágar M-Endo 
Observar colônias 
típicas através do 
microscópio estereoscópico 
Formação de gás 
 
 
POSITIVO PARA 
 COLIFORMES 
termotolerantes 
Bomba à vácuo 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 26 
 
 
 
 
 
 
 (NCMF) Volume filtrado da amostra 
(ml) 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 27 
MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS NA ANÁLISE BACTERIOLÓGICA DE ÁGUAS 
 
Estes meios podem ser encontrados sob forma desidratada, de fabricantes, BBL, Difee, 
Merck, Oxoid, etc. 
Caldo lactosado 
Extrato de carne - 3,0 g 
Peptona - 5,0 g 
Lactose - 5,0 g 
Água destilada - 1 L 
pH 6,8 - 7,0. Autoclava-se a 120
o
C, 15 min. Caso deseje o caldo lactosado de concentração 
dupla, usa-se a metade da água destilada. 
 
Glicose - agar 
Extrato de carne - 3,0 g 
peptona - 5,0 g 
Glicose - 10,0 g 
Agar (em pó) - 10 g a 15 g (conforme a qualidade) 
Água destilada - 1 L 
pH 6,8 - 7,0. Autoclava-se a 120
o
C, 20 min. 
 
Caldo de verde brilhante lactose bile 
Peptona -10,0 g 
Lactose -10,0 g 
Bile de boi -20,0 g ou sais biliares (1/2) 
Água destilada - 1 L 
pH 7,2. Autoclava - se a 115
o
C, 15 min. 
Para adicionar o verde brilhante pode-se preparar uma solução à 0,1% em água destilada e 
dela juntar 13,3 ml ao meio de cultura. 
 
Eosina - azul de metileno - agar 
Peptona - 10,0 g 
Lactose - 5,0 g 
Sacarose - 5,0 g 
PO4HK2 - 2,0 g 
Agar (em pó) - 10,0 g a 15,0 g (conforme a qualidade) 
Coloca - se em balões, para uso, fundir o meio, esfriar a 45
o
C e juntar para cada 100 ml, 1 ml 
de solução aquosa estéril de eosina a 4 g / 100 ml, e 1 ml de solução aquosa estéril de azul de 
metileno a 0,65g/100 ml. 
 
Endo - agar 
Peptona -10,0 g 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 28 
Lactose -10,0 g 
K2HPO4 - 3,5 g 
Sulfito de sódio - 2,5 g 
Fucsina básica - 0,5 g 
Agar (em pó) - 10,0 g a 15,0 (conforme a qualidade) 
Água destilada - 1 L 
pH 7,4. Esterilizar a 115
o
C, 15 min. O meio deve ser rosa claro quando quente incolor ao 
esfriar. 
 
Caldo peptonado ou triptonado 
Peptona de caseína ou triptona -1 g 
Água destilada -100 ml 
Colocar porções de 5 ml em tubos de ensaio e autoclavar a 120
o
C por 15 min. 
 
Caldo glicosado - fosfatado 
Peptona - 5,0 g 
Glicose - 5,0 g 
K2HPO4 - 5,0 g 
Água destilada - 1,0 L 
Colocar porções de 5 ml em tubos de ensaio e autoclavar a 120
o
C por 15 min. 
 
Citrato de Koser 
Citrato de sódio - 3,0 g 
K2HPO4 - 1,0 g 
MgSO4.7H2O - 0,2 g 
NaNH4HPO4. 4H2O - 1,5 g 
Água destilada - 1 L 
Colocar porções de 5 ml em tubos de ensaio e autoclavar a 120
o
C por 15 min. 
 
Citrato de Simmons 
Citrato de sódio - 2,0 g 
MgSO4 . 7H2O - 0,2 g 
NH4H2PO4 - 1,0 g 
NaCL - 5,0 g 
Azul de bromotimol - 0,08 g 
Agar ( em pó ) - 10,0 g 
Água destilada - 1,0 L 
Fundir e colocar em tubos e autoclavar a 120
o
C por 15 min. 
 
Meio EC 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 29 
Triptose ou tripticase - 20,0 g 
Lactose - 5,0 g 
Mistura de sais biliares ou sais biliares n
o
 3 - 1,5 g 
K2HPO4 - 4,0 g 
KH2PO4 - 1,5 g 
NaCl - 5,0 g 
Água destilada - 1,0 L 
pH 6,9 
Colocar em tubos de fermentação e autoclavar a 115
o
C por 15 min. 
 
Preparação da água tamponada para diluições 
Prepara-se uma solução “stock” dissolvendo 34,0 g de KH2PO4 em 500 ml de água 
destilada, ajusta-se, com NaOH 1N, o pH a 7,2 e completa-se o litro com água destilada. 
Para preparar a água tamponada de diluição, junta-se 1,25 ml da solução “stock” a 1 L de 
água destilada. Distribui-se em frascos ou tubos convenientemente e autoclava-se a 120
o
C por 
15 minutos. 
 
Soluções corantes e reagentes 
 
Cristal violeta ou violeta de genciana (Hueker) 
Solução A 
Cristal violeta (90% de corante) - 2,0 g 
Álcool etílico (95%) - 20,0 ml 
Solução B 
Oxalato de amônio - 0,8 g 
Água destilada - 80,0 ml 
Juntar as soluções A e B. 
 
Lugol 
Iodo - 1 g 
Iodeto de potássio - 2 g 
Água destilada - 300 ml 
Misturar num almofariz o iodo e o iodeto de potássio, depois juntar a água. 
 
Solução Safranina 
Safranina - 0,25 g 
Álcool etílico (95%) - 10 ml 
Água destilada - 100 ml 
 
Reagente de Kovacs 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 30 
Para-dimetil-amino benzaldeído - 5 g 
Álcool amílico ou butílico - 75 ml 
HCl, concentrado - 25 ml 
 
Reagente para a prova de Voges-Proskauer (Método de Barrit) 
Solução A 
 - Naftol - 5 g 
Álcool absoluto - 100 ml 
 
Solução B 
KOH - 40 g 
Água destilada - para completar 100 ml 
 
Reagente indicador de vermelho de metila 
Vermelho de metila - 0,1 g 
Álcool absoluto - 300 ml 
Água destilada - 200 ml 
 
Corante para coloração de esporos 
Verde malaquita 
Verde malaquita - 5 g 
Água - 100 ml 
(Solução aquosa a 5%) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 31 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
APÊNDICE 
 
 
 
 
 
 
 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 32 
 
Universidade Federal de Pernambuco 
Centro de Ciências Biológicas 
Departamento deAntibióticos 
Disciplina: “Análises Bacteriológicas da Água” 
EQUIPE ______ 
Alunos: 
 
 
 
 
 
 
 
ANÁLISES BACTERIOLÓGICAS DE ÁGUA 
PROTOCOLO PARA COLETA 
Interessado: 
Escola/Creche/Asilo/ outros 
 
Endereço: 
Ponto de referência: 
Telefone para contato: 
Data da coleta: Hora: 
Responsáve(l) ou (is) pela amostragem: 
 
 
 
 
Dados sobre a amostra de água a ser analisada e local de coleta: 
 
 
 
 
pH da amostra: 
Temperatura: 
1. Água do sistema de abastecimento da COMPESA ( ) 
2. Poço ( ) 
 
2.2. Profundidade do poço: 
2.2. Tempo de perfuração: 
2.3. Água submetida a tratamento ( ) Cloração ( ) Outro ( ) 
Obs.: .................................................................................................................. 
A água captada é armazenada em cisterna ou tanque ( ) 
Obs.: Em caso afirmativo preencha os demais subitens relativos a cisternas/tanques, no item 3. 
Número de tanques existentes: 
3. Local de coleta da amostra: 
3.1. Torneira ( ) Localização: 
3.2. Bebedouro ( ) Localização: 
3.3 Cisterna/tanque ( ) Localização: 
ANOTE: Condições físicas do tanque de armazenamento usado para acumular água (registre presença ou não de tampas, 
rachaduras, condições de higiene, tempo da última limpeza realizada na caixa d’água, localização no terreno, proximidade 
de fossas, etc.): 
 
 
Número de alunos/usuários: 
 
Números de professores e funcionários: 
Espaço reservado para observações e notas consideradas relevantes, pelo responsável pela coleta: 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 33 
 
LOGOMARCA DOS ALUNOS 
 
 
 
Exame nº 23/2008 
 
Interessado: 
Endereço: 
 
Amostra: Água tratada, etc. ,................ 
 (Colhida pelo interessado ou pela equipe xxxx..) 
 
Natureza do exame: Análise bacteriológica da água. 
 
TÉCNICA UTILIZADA: Tubos múltiplos; Substrato cromogênico; Presença e 
Ausência; Membrana Filtrante, etc.. 
 
 
 
Dados da amostra: 
pH: ..... 
Data e hora da coleta: 
Data e hora do início da análise: 
 
 
Resultados: 
 
1) Coliformes totais: positivo/negativo ou presentes/ausentes 
 
2) Número mais provável (NMP) de coliformes totais por 100/mL da amostra: .... 
(DEPENDENDO DO MÉTODO USADO) 
 
3) Coliformes termotolerantes OU E. coli (DEPENDENDO DO MÉTODO USADO): 
positivo/negativo ou presentes/ausentes 
 
4) Número mais provável (NMP) de coliformes termotolerantes por 100/mL da 
amostra: .... (DEPENDENDO DO MÉTODO USADO) 
 
 
5) Contagem de bactérias heterotróficas em placa pela técnica do Pour Plate: 165 
UFC/mL (SE HOUVER SIDO REALIZADA NA AMOSTRA) 
 
 
7) Conclusão: De acordo com a Portaria N
o
 518, de 25 de março de 2004/Ministério 
da Saúde, a água é considerada NÃO POTÁVEL do ponto de vista 
bacteriológico, devido à presença de coliformes totais e 
termotolerantes. 
Recife, _____________________. 
NOME CRIADO PELA EQUIPE 
 
NOME DO LABORATÓRIO CRIADO PELA EQUIPE 
 
 
 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 34 
OBSERVAÇÕES: SUGESTÕES OU RECOMENDAÇÕES OU ALERTAS QUE O 
ANALISTA DESEJE ENCAMINHAR AO CLIENTE. 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 35 
PROCEDIMENTO PARA REALIZAÇÃO DA COLETA – SUMÁRIO 
 
 
 
 
1. PROCEDIMENTO PARA COLETA: 
Todo o cuidado, na execução de uma coleta de amostra de água deve ser 
tomado para que os resultados sejam confiáveis. Durante a amostragem evita-
se tocar o interior do recipiente ou tampa (no caso de frasco esterilizado). 
Coletar um volume mínimo de 100 mL. 
1.1. ETAPAS DA COLETA COM FRASCO DE VIDRO OU PLÁSTICO: 
a. O papel que recobre a tampa deve ser afrouxado, devendo o operador 
segurar a tampa, para abri-lo, sem remover o papel totalmente, deixando, 
entretanto, cair por não mais necessária, a tira de papel ou alumínio inserida 
entre o gargalo e a tampa. 
b. Para colher amostras no sistema distribuidor de água, escolhe-se uma 
torneira, abrindo-a deixa-se a água fluir em jato forte durante 3-5 minutos; 
depois fecha-se e realiza-se a assepsia da mesma com algodão embebido em 
álcool a 70 % em água. 
c. Em seguida com a torneira aberta moderadamente, colhe-se a amostra 
não esquecendo de deixar o espaço de ar para a sua homogeneização. 
d. Poços com bombas manuais são operados de maneira semelhante, 
bombeando-se por 5 minutos antes da tomada de amostra. Se o poço não tem 
bomba, faz-se descer o frasco esterilizado, ligado a um peso e com um 
dispositivo que permita abri-lo debaixo d’água. 
e. Existem frascos e dispositivos especiais para a coleta de amostras de 
água abaixo da superfície, a profundidades desejadas. 
1.2. COLETA COM SACOS PLÁSTICOS ESTÉREIS: 
Em caso de uso de sacos plásticos estéreis, o mesmo só deverá ser aberto no 
momento da captação da amostra de água, sem que os dedos toquem a 
abertura do plástico. Abrir o saco utilizando as abas de papel na extremidade 
da boca do saco (puxando as abas para as laterais). Encher o saco até a 
marca de 100 ml. Puxar o arame da borda para fechar o saco, dobrar a borda 3 
vezes, e lacrar com o auxílio do arame, fazendo o arremate da dobra nas 
laterais no sentido oposto às voltas realizadas na boca do saco. 
2. REGISTRO DE DADOS. 
a. Devem ser anotadas a data e hora da coleta, temperatura da água; pH 
da água; localização da tomada de amostra. 
b. Sempre que possível, medir o teor residual de cloro, no momento da 
coleta. 
c. A descrição da localização deve ser bastante exata para que outra 
pessoa possa chegar ao mesmo local. Pode ainda ser de utilidade o inquérito 
sanitário do lugar de onde provem a amostra, para a avaliação do suprimento, 
anotando informações tais como profundidade de poços, tempo de seu 
funcionamento, proximidade de fossas, etc. 
3. TRANSPORTE E TEMPO DE ESPERA: o exame deve começar o mais 
cedo possível, de preferência dentro de 2 horas após a coleta. No entanto, o 
tempo máximo decorrido entre a coleta e o exame, não deve exceder 24 horas. 
Se for o caso, deve-se estudar a possibilidade de realizá-lo no local da coleta. 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 36 
Tanto quanto possível, manter a temperatura da amostra próxima a da ocasião 
da retirada da mesma. Pode-se manter a amostra sobre refrigeração (em torno 
de 4 
o
C se o transporte até ao laboratório exceder mais de 2 horas. 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 37 
 Referências bibliográficas. 
 
A evolução do consumo de água mineral no Brasil. Organização não governamental SOS 
água. Disponível em: < sosaguas.org.br/notas/aguamineral.htm>. acesso em:25 fev.2002. 
 
ANA – Agência Nacional de Água - http://www.ana.gov.br 
 
Andueza, F. Calidad bacterilógicadel água mineral envasada expendidaen la ciudad de Mérida 
. Revista da faculdade de Farmácia de Mérida. Vol. 38. P. 9-19. Disponível em: 
 <http://bireme.br/cgi-bin/wsislind.exe/iah/online/>. Acesso em: 12 fev. 2002 
 
Brasil. Resolução n
o
 54, de 15 de junho de 2000, regulamento técnico para fixação de padrões 
de identidade e qualidade de água mineral natural e água natural. Disponível em: 
<http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2000/54-00rdc.htm>. acesso em 31 fev. 2002. 
 
Bier, O. Microbiologia e Imunologia. São Paulo: Melhoramentos. ed: 30. 1990. 
 
Coelho, D. L; Pimentel, I. C; Beux, M. G. Uso do método do substrato cromogênico para 
quantificação do número de bactérias do grupo coliforme em águas minerais envasadas. 
Boletim do Centro de pesquisas e Processamento alimentar (UFPA). Vol. 16. n
o
 1. P. 45-54. 
Jan-jun. 1998. 
Disponível em: http://bireme.br/cgi-bin/wsislind.exe/iah/online/. Acesso em: 20 fev. 2002 
 
Costa, L. J. P. Análise bacteriológica da água. João Pessoa: universitária/UFPB. 1980. 
 
DIFCO LABORATORIES. Medios de cultivodeshidratados y reactivos para microbiologia. 
Madrid. Ed. .10. 1984. 
 
Foster, S. S. D. et al. Contaminación de las aguas subterrâneas: un enfoque ejecutivo de la 
situacion en america latina y caribe en relacion con el suministro de agua potável. Lima, 
[Peru]. CEPIS. 38 p. 1987. Disponível em: http://bireme.br/cgi-bin/wsislind.exe/iah/online/. 
Acesso em: 20 fev. 2002 
 
Franco, B. D. G. M. et al. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: ed Ateneu. 1996. 
 
Guilherme, E. F. M. ; Silva, J. A. M. ; Otto, S.S. Pseudomonas aeruginosa como indicadora de 
contaminação fecal. Revista de higiene alimentar. vol. 14 n
o 
76 p. 43-47. Set. 2000. 
 
http://www.ana.gov.br/
http://bireme.br/cgi-bin/wsislind.exe/iah/online/
http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2000/54-00rdc.htm
http://bireme.br/cgi-bin/wsislind.exe/iah/online/
http://bireme.br/cgi-bin/wsislind.exe/iah/online/
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 38 
Hamer, M. J. Sistema de abastecimento de água e esgoto. São Paulo: Livros técnicos e 
cientificos, 1979. 
 
Jawetz, E.; Melnick, J. L; Adelberg, E. A. Microbiologia Médica. ed: 20. Rio de janeiro: 
Guanabara Koogan. 1998. 
Macêdo, J. A. B. Águas e Aguas. São Paulo: Varela. Ed: 1. 2001. 
 
Menaker, l. ; Morhart, R.E. ; Navia, J.M. Cáries dentárias: Bases biológicas. Rio de Janeiro: 
Guanabara Koogan, 1984. 
 
MERCK. Manual de medios de cultivo. Rio de Janeiro. 1990. 
 
Nascimento, A. R. et al. Qualidade microbiológica de águas minerais consumidas na cidade de 
São Luiz- MA. Revista Higiene alimentar. Vol. 14, n
o 
76 p 69-73. Set. 2000. 
 
Newbrun, E. Cariologia. São Paulo: Ed. Santos. 1988. 
 
Konemam, E.W. et al .Diagnóstico microbiológico: Texto e Atlas. Ed: 5. 2001. 
 
Organização Panamericana da Saúde (OPAS). A desinfecção de água.[1996]. 
 
Pelczar, M. J. et al. Microbiologia: Conceitos e aplicações. Ed. 2, v.1. São Paulo: Makron 
books. 1996. 
 
Roitman, I.; Travassos, W. ; Azevedo, J.L. Tratado de Microbiologia. São Paulo: Manole. v 2. 
1998. 
 
Sanches, P.S. Atualização em técnicas para o controle microbiológico de águas minerais. São 
Paulo: Universidade Mackenzie. 1999. 
 
São Paulo (Estado).Companhia de tecnologia de saneamento ambiental (CETESB). Exame 
microbiológico da água: Processos simplificados. São Paulo. 1991. 
 
Schwab, A. et al. Microbiologia das águas minerais comercializadas no município de curitiba. 
Arquivos de biologia e biotecnologia. Vol. 35, n
o
 1, p. 183-90. Mar. 1992. 
 
Silva,N.; Neto, R.C.; Junqueira, V.C.A.;Silveira, N.F.A. Manual de métodos de análise 
microbiológica da água., São Paulo, Varella, 2005. 
 
Standard Methods for the examination of water and wastewater. Washington: APHA. Ed.13 th. 
1971. 
 
StandardMethods For The Examination of Water & Wastewater. ed. 21
th
. Washington: APHA, 
2005. 
 
 
 
 
Análises Bacteriológicas da Água – Calazans, Sousa e Falcão de Morais - ANO 2010 39