Extracao-DNA-RNA-Enz-restricao-SARA

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Extração de DNA e RNA
Enzimas de Restrição
Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências Biológicas
Laboratório de Polimorfismos Genéticos
1
Coleta de material biológico:
Quando?
De quem?
Como?
Tratamentos?
Quanto mais fresco melhor!
Quantidade aceitável
Boa conservação
EPI!
Contenção!
Várias fontes de material biológico. Todos os tecidos de todos os organismos.
2
3
Sangue
Tecidos
Células de cultura
Extração plasmídeos de células bacterianas
Purificação de DNA de gel
...
1. Extração de DNA
De onde podemos extrair DNA?
4
Material de pacientes e controles - Lapoge
Sangue total
Buffy coats
Amostras de tecido
1. Extração de DNA
Objetivos
Objetivos?
Genotipagem?
Sequenciamento?
Integridade
Pureza
Quantidade
PCR – tamanho?
Quantificação de RNA - Expressão?
1. Extração de DNA
1. Extração de DNA
Fundamentos
Lisar eritrócitos (choque osmótico)
Lisar leucócitos (detergentes)
Inativar DNAse (quelante -EDTA)
Precipitar/degradar proteínas (sais/proteinase)
Precipitar DNA (etanol)
Reidratação do DNA em água ou tampão
Principais Métodos
Fenol-Cloróformio
Salting-out
Kits com colunas
1. Extração de DNA
Lise I: eritrócitos
Lise II: leucócitos
Fenol-clorofórmio
Precipitação etanol
Fenol-Cloróformio
1. Extração de DNA
Barato
Simples
Boa quantidade
Boa qualidade
Estabilidade do DNA
Contaminação da amostra por fenol 
Reagentes tóxicos!
1. Extração de DNA
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-05962008000300002
 Salting-out 
1. Extração de DNA
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Barato
Simples
Boa quantidade
Boa qualidade
Não tóxico
Estabilidade do DNA?
Sais contaminantes
1. Extração de DNA
1. Extração de DNA Kits
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MUITO Simples
Boa quantidade
Boa qualidade
Não tóxico
Caro
Estabilidade do DNA
1. Extração de DNA
Similar a extração de DNA
Protocolo bem mais cuidadoso
Molécula muito mais instável
Amostra pode ser bem conservado em TRIzol, RNAlater, etc.) - snapshot
É preciso separá-la do DNA
2. Extração de RNA
Extração de RNA: Análises de expressão
TRIzol
RNAlater
Kit com colunas
Melhorar essa parte!
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2. Extração de RNA
Lise I: eritrócitos
TRIzol (fenol-guanidina)
Clorofórmio
Precipitação etanol
TRIzol
Pode ser usado para extração de RNA, DNA e Proteínas!
Kit com colunas
Transcrição reversa
(Quebit)
(Nanodrop)
Espectrofotômetro - Nanodrop
260nm – DNA/RNA
280nm – proteína, fenol,..
230nm – contaminantes (carboidratos, fenol,..)
260/230 ~1,8
260/230 ~2,0
Armazenar?
DNA: -20◦C
Estoque
Uso (diluído)
RNA: -80◦C
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Endonucleases produzidas por bactérias para se defender de vírus.
Quebram o DNA em fragmentos menores, não infecciosos.
Reconhecem sítios específicos (sítios de restrição) no genoma e a corta.
São conhecidos mais de 3000 enzimas
Enzima de restrição:
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Enzima de restrição: tipos de clivagem
Fragmentação DNA!
Clonagem!
Genotipagem!
...
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RFPL: Polimorfismos de comprimento do fragmento de restrição
Detecção dos polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs – single nucleotide polymorphisms). 
Os primers utilizados na PCR flanqueiam a região que contém, ou não, o sítio de clivagem reconhecido pela enzima de restrição utilizada.
O produto da PCR é posteriormente submetido à ação da enzima de restrição.
Enzima de restrição: Detecção de SNPs
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Enzima de restrição: como ocorre a clivagem
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3´ CGTAAATCTATACGAGAATTCACGTACGTA5´	
5´ GCATTTAGATATGCTCTTAAGTGCATGCAT3´ 
3´ CGTAAATCTATACGAGTATTCACGTACGTA5´ 
5´ GCATTTAGATATGCTCATAAGTGCATGCAT3´ 
2
1
2/2
1/2
2/2
1/2
1/1
2/2
1/1
2/2
1/2
1/1
Enzima de restrição: resultado da restrição
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