PCR REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE

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Biologia Molecular 
PCR – REAÇÃO EM CADEIA 
DA POLIMERASE 
 
 
 
 Aplicações da PCR 
Diagnóstico; 
Medicina (estudo de câncer; identificação doenças); 
Processos evolutivos (filogenias, estudos populacionais); 
Genoma; 
Investigações forenses, paternidade. 
 
 
 
 Tipos de amostra de DNA 
Sangue/saliva, 
Urina 
Sêmen 
Tecido 
Osso 
Cabelo 
Marcas e pontas de cigarro; 
Impressões em armas de fogo; 
 
 Passos principais: 
 Lise das membranas plasmáticas e nucleares; 
 Degradação de proteínas; 
 Purificação do DNA 
 
 Lise de membranas e degradação de 
proteínas: 
Detergentes: CTAB, SDS, Sarcosil são os principais 
detergentes utilizados para ruptura da membrana 
 Tampão tris-HCl – manter o pH em torno de 8 – 
inibem a ação de nucleases!!! 
Desnaturação das proteínas e eliminação dos 
polissacarídeos – 2-mercaptoetanol e polivinilpirrolidona 
(PVP) e polivinilpolipirrolidona (PVPP) 
RNAse – elimina o RNA 
 
 Recuperação dos ácidos nucleicos: 
Clorofórmio: álcool isoamílico (24:1) 
Extração de lipídios, proteínas e polissacarídeos 
(inferior) 
DNA fase aquosa (superior). 
 
 Precipitação dos ácidos nucleicos: 
Isopropanol 
 
 
 Avaliação dos ácidos nucleicos por 
espectrofotometria UV 
 Conservação de DNA 
Estocagem de DNA a temperaturas menores de -‐20 
°C, evitando descongelamentos sucessivos; 
 
 
 Detecção e amplificação in vitro de um 
fragmento específico de ácido nucleico. 
 Técnica “inventada” em 1985 por Kary B. Mullis; 
 1969 – T. Brock e H. Freeze relataram a 
descoberta de uma nova espécie de bactéria – 
Thermus aquaticus – sobrevive na água a 
temperatura média de 75ºC; 
Várias enzimas isoladas desse microrganismo incluindo a 
primeira DNA polimerase termoestável – Taq DNA 
polimerase 
APLICAÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR 
EXTRAÇÃO DO DNA 
CONCENTRAÇÃO DE DNA 
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE –PCR 
COMPONENTES DA REAÇÃO: 
 Amostra de DNA 
 Primers: Oligonucleotídeos de cadeia simples 
com sequência complementar às sequências 
alvo do DNA (idealmente 20-24 nucleotídeos); 
 DNTPs: (desoxirribonucleotídeos fosfatados) são 
responsáveis pela síntese de novas cópias do 
material a ser amplificado; 
 
MISTURA DE REAÇÃO: 
 Enzima Taq polimerase: sintetiza a nova fita de 
DNA 
 MgCL2 - cofatores necessários para a atividade 
da enzima 
 Buffer: Solução tampão para estabilizar a 
reação; 
 
ETAPAS DA PCR: 
 TERMOCICLADOR 
 DESNATURAÇÃO - Abertura do DNA cadeia 
dupla (T=95ºC); 
 ANELAMENTO – os primers se ligam ao DNA 
fita simples (Ta~50 a 65ºC); 
 EXTENSÃO: Ativação da Taq polimerase e 
síntese da nova fita de DNA (T~75ºC); 
Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no 
máximo; 
Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo. 
 
 
 
 Separa as moléculas (proteínas ou ácidos 
núcleicos) de acordo com o seu peso 
molecular; 
 DNA e RNA possuem carga elétrica negativa 
→ migram para o pólo positivo 
 Brometo de Etídeo: corante fluorescente que 
se vai intercalar na dupla hélice de DNA e 
possibilitar a visualização dos fragmentos 
quando em exposição a luz UV; ( cuidado=> 
carcinógeno!) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE