=Toxicologia e Analises Toxicologicas UNIP 2014

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INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE 
 
 
 
 
 
 
CURSO DE FARMÁCIA 
 
 
 
 
 
 
 
ROTEIRO PARA AULAS PRÁTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DISCIPLINA: 
 
 
TOXICOLOGIA E ANÁLISES 
TOXICOLÓGICAS 
2 
 
 
OBJETIVO: Teste rápido para como triagem da exposição do organismo a fármacos 
ou drogas de abuso 
PROCEDIMENTO: 
Padronização de fármacos por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
MATERIAL 
Padrões: 
1. ácido salicílico 
2. cafeína 
3. nicotina (extrair á partir do cigarro com álcool metílico) 
Agentes cromogênicos: 
1. Solução de cloreto férrico (FeCl3) 5% 
2. Solução de Dragendorff Iodado (DI). 
 Preparação do Dregendorff Iodado (DI): 
 solução A - 2 g de nitrato de bismuto + 25 mL de ácido acético, 
qsp 100 mL de água; 
 solução B - 4,0g de KI, qsp 100 mL de água. 
 Misturar 10 mL da solução A + 10 mL da solução B + 20 mL de 
ácido acético. 
 Completar para 1000 mL, com água. 
 Adicionar 20 g de iodo e agitar por 30 minutos. 
Sistema solvente: 
Cuba ácida: clorofórmio:acetona (9:1) 
Cuba básica: clorofórmio:metanol (4:1) 
Instituto de Ciências da 
Saúde 
CURSO: FARMÁCIA 
DISCIPLINA: TOXICOLOGIA E 
ANÁLISES TOXICOLÓGICAS 
TITULO DA AULA: PADRONIZAÇÃO 
DE FÁRMACOS POR CCD 
 
AULA 
 
1 
 
3 
 
TÉCNICA 
1. Aplicar, por capilaridade, as soluções padrão 1 e 2 em uma cromatoplaca e os 
padrões 2 e 3, em uma segunda cromatoplaca. 
2. Colocar a primeira cromatoplaca em uma cuba de desenvolvimento previamente 
saturada contendo o sistema solvente clorofórmio:acetona (4:1). A segunda 
cromatoplaca deverá ser colocada em uma cuba satura contendo o sistema solvente 
clorofórmio:metanol (9:1). 
Após o desenvolvimento das placas (10 cm), retirá-las das cubas e deixá-las à 
temperatura ambiente para a completa evaporação do solvente, sob capela. 
3. A seguir, revelar a cromatoplaca 1 com FeCl3 e avaliar o comportamento da 
mancha*. Na mesma placa, aplicar DI e avaliar o comportamento da mancha. Na 
segunda placa, aplicar o DI, como agente cromogênico. 
* Expressar os resultados segundo a forma da mancha, cor da mancha e 
hRf. 
 
MATERIAIS QUANTIDADE 
Acetona 100 mL 
Ácido acético 50 mL 
Clorofórmio 500 mL 
Éter de petróleo 100 mL 
Fe(NO3)3.9H2O Nitrato férrico nonahidratado 40 g 
Iodeto de Potássio 4,0 g 
Metanol 100 mL 
NaOH 1 g 
Nitrato de bismuto 2,0 g 
Solução de cloreto férrico 10 g 
Sulfato de sódio 10 g 
 
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE 
Funil de separação (125 mL) 2 
Bastão de vidro 1 
4 
 
Funil de vidro capacidade 100 mL 01 
Béquer 100 mL 02 
Bastão de vidro 01 
Papel Universal pH 02 fitas 
Béqueres 100 mL 03 
Placas cromatográficas de sílica gel (0,25 mm de espessura) 02 
Capilar de vidro para aplicação em cromatografia 10 
Cubas de vidro 2 
Nebulizadores 1 
 
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de 
Segurança: Compostos Mercuriais: Incineração. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5 
 
 
OBJETIVO: Determinar as concentrações de salicilato em amostra de 
plasma para verificar se estão dentro dos padrões da monitorização 
terapêutica 
 
AMOSTRA 
Soro ou plasma (conservar a amostra em congelador quando a análise for feita 
em seguida à colheita). É estável pelo menos, por 6 meses a -18ºC. No caso de 
plasma, colher o sangue com seringa heparinizada. 
MATERIAL 
1. Espectrofotômetro para a região do visível. 
 2. Agitador mecânico (tipo vórtex). 
3. Solução-padrão de salicilato de 5 mg/mL. Dissolver 580 mg de salicilato de 
sódio em 100 mL de água destilada; adicionar gotas de clorofórmio como 
conservante e manter solução sob refrigeração (estável durante 6 meses). 
4. Reativo de Trinder: dissolver, com aquecimento, 40g de HgCl2 em 850 mL de 
água destilada; resfriar, adicionar 120 mL de sol. HCl 1N, 40g de 
Fe(NO3)3.9H2O e completar o volume até 1L com água. Esta solução é estável 
por tempo indefinido. 
 
Obs. Atenção com o mercúrio: aquecimento em capela, sob 
exaustão. Vapores tóxicos! 
 
TÉCNICA 
1. Transferir para tubo de centrífuga 1 mL de soro ou plasma. 
2. Adicionar 5 mL do reativo de Trinder, agitar e centrifugar por 5 minutos (2000 
rpm). 
Instituto de Ciências da 
Saúde 
CURSO: FARMÁCIA 
DISCIPLINA: TOXICOLOGIA E 
ANÁLISES TOXICOLÓGICAS 
TITULO DA AULA: DETERMINAÇÃO 
DE SALICILEMIA 
 
 
AULA 
 
2 
 
6 
 
3. Transferir o sobrenadante para a cubeta do espectrofotômetro e proceder a 
leitura em 540 nm contra branco de reativo. 
4. Determinar a concentração através de uma curva de calibração. 
 
INTERPRETAÇÃO 
Os níveis terapêuticos de salicilato estão acima de 100 mg/L de soro; os 
valores tóxicos encontram-se acima de 200 mg/L e os letais, acima de 500 mg/L. 
Nota: a presença de fenotiazínicos pode interferir nos resultados. 
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 
MORAES, R.F.L. Determinação de salicilemia em crianças portadoras de 
artrite reumatóide juvenil por colorimetria e espectrofluorimetria. São Paulo, 
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP, 1986. (Dissertação de Mestrado). 
MATERIAIS QUANTIDADE 
Salicilato de sódio 580 mg 
Água destilada 1100 mL 
HgCl2 (cloreto mercúrico) 40g 
Ácido Clorídrico 10 mL 
Fe(NO3)3.9H2O Nitrato férrico decahidratado 40 g 
Soro 10 mL 
 
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE 
Espectrofotômetro para a região do visível 1 
Agitador mecânico (tipo vórtex). 1 
Centrifuga 1 
Tubo de ensaio 2 
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 1 
Micropipeta Capacidade 1000 µL 1 
Micropipeta Capcidade 500 µL 1 
 
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de 
Segurança: Compostos Mercuriais: Incineração. 
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OBJETIVO: identificação de micotoxinas presentes em alimentos, 
sementes, grãos ou rações para estimar a intensidade de exposição do 
organismo humano. 
 
PROCEDIMENTO: 
1. Extração: pesar 50 g de amendoim em um erlenmeyer de 500 mL. Adicionar 
270 mL de metanol e 30 mL de solução de cloreto de potássio 4%. Agitar 
mecanicamente por 30 minutos. Filtrar em papel de filtro (Obs.: a quantidade 
mencionada é suficiente para toda a turma e não para cada grupo). 
2. Extração líquido-líquido: em um funil de separação de 500 mL, transferir 
150 mL do filtrado anterior. Adicionar 150 mL de água e extrair 3 vezes ( por 1 
minuto) com 20 mL de clorofórmio. Juntar os extratos clofórmicos e evaporar à 
secura no rotavapor ou em chapa de aquecimento, na capela. Lavar a parede do 
frasco do rotavapor ou béquer (no caso de evaporação na chapa de aquecimento) 
com clorofórmio e transferir o lavado para o balão volumétrico de 25 mL. Conservar 
em geladeira, envolto em papel alumínio. 
3. CCD: aplicar, em pontos diferentes de uma mesma cromatoplaca o extrato 
obtido de aflatoxina. Colocá-las nas cubas de desenvolvimento contendo o sistema 
solvente clorofórmio - acetona (4:1). Após o desenvolvimento das placas (10 cm), 
retirá-las das cubas e deixá-las à temperatura ambiente para a completa evaporação 
do solvente. Observar a presença da aflatoxina, quando exposta ao transluminador 
de UV. 
MATERIAIS QUANTIDADE 
Cloreto de potássio 2 g 
Clorofórmio 100 mL 
Metanol 300 mL 
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE 
Instituto de Ciências da 
Saúde 
CURSO: FARMÁCIA 
DISCIPLINA: TOXICOLOGIA E 
ANÁLISES TOXICOLÓGICAS 
TITULO DA AULA: IDENTIFICAÇÃO 
DE AFLATOXINA POR CCD 
 
AULA 
 
3 
 
8 
 
Balão volumétrico 25 mL 1 
Bastão de vidro 2 
Béquer 500 mL 1 
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 2 
Erlenmeyer 500 mL 1 
Espectrofotômetro para a região do uv 1 
Funil de separação 500 mL 1 
Papel de filtro 2 
Placas cromatográficas de sílica gel (0,25 mm de espessura) 1 
Rotavapor 1 
Tubo de ensaio 2 
Papel alumínio 
 
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de 
Segurança. 
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Instituto de Ciências da 
Saúde 
CURSO: FARMÁCIA 
DISCIPLINA: TOXICOLOGIA E 
ANÁLISES TOXICOLÓGICAS 
TITULO DA AULA: DETERMINAÇÃO 
DA METEMOGLOBINEMIA 
 
AULA 
 
4 
 
OBJETIVO: Determinar os teores para se verificar se estãodentro das 
normas da monitorização biológicas do Ministério do Trabalho 
PROCEDIMENTO: 
1) Transferir 3,0 mL da amostra de sangue hemolisada e já tamponada para um 
tubo de centrífuga, adicionar 1 gota de Triton X-100 e agitar até completa hemólise. 
Se necessário, centrifugar. 
2) Transferir o sobrenadante, com o auxílio de pipeta Pasteur para outro tubo de 
ensaio pequeno. Deste tubo, transferir 2,4 mL do sobrenadante para uma cubeta ou 
tubo de ensaio pequeno ( I ) e 0,2 mL do sobrenadante para outra cubeta, esta 
contendo 2,2 mL de reativo ferricianeto-fosfato ( II ). 
3) Efetuar as leituras das duas cubetas (AI e AII) em 632 nm, contra ar. 
4) Adicionar 80 µL de solução de cianeto neutralizada às duas cubetas e, após 1 
minuto, efetuar novamente a leitura das absorbâncias (AIII e A IV). 
5) Calcular a % de MeHb na amostra, expressando em percentagem de 
metemoglobina total, a partir da seguinte fórmula: 
 
% MeHb = __AI – AIII x 100 
 (AII – AIV) x 12 
DADOS 
O valor de referência de metemoglobina é < 2,0% e o IBMP é igual a 5%, segundo a 
NR7. 
 
MATERIAIS QUANTIDADE 
Amostra de Sangue 6 mL 
 
10 
 
K3Fe(CN)6 5 g 
NaOH 0,5 M 7 mL 
KH2PO4 0,5 M 10 mL 
NaCN a 10% 1 mL 
Ácido acético a 12%. 1 mL 
Triton X-100 
Água Destilada 
0,5 mL 
1L 
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE 
Espectrofotômetro 01 
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 01 
Béqueres 100 mL 03 
Bageta de Filtro 01 
Papel Universal pH 02 fitas 
Pipeta Capacidade 5 mL 02 
Pipeta Capcidade 10 mL 02 
Pipeta Capacidade 1 mL 02 
 
 
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 
HEGESH, E; GUENE, N; COHEN, S.; BOCHEKOVSKY, R.; SHUVAL, H.I. – A 
sensitive micromethod for the determination of methemoglobin in blood. 
Clin.Chim.Acta., Amsterdam, 30:679-82, 1970. 
 
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de 
Segurança. 
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Instituto de Ciências da 
Saúde 
CURSO: FARMÁCIA 
DISCIPLINA: TOXICOLOGIA E 
ANÁLISES TOXICOLÓGICAS 
TITULO DA AULA: DETERMINAÇÃO 
DA CARBOXIHEMOGLOBINEMIA 
 
AULA 
 
5 
 
OBJETIVO: Determinar os níveis de Carboxiemoglobina de amostras 
biológicas de indivíduos não expostos ocupacionalmente para verificar se 
estão dentro dos limites máximos permitidos 
 
AMOSTRA 
 A amostra de sangue deve ser colhida no final da jornada de trabalho em 
vacutainer heparinizado e conservada a 4ºC por no máximo uma semana. Para os 
fumantes devem ser colhidas duas amostras, antes e após a jornada de trabalho. 
 
MATERIAL 
 Sol. Tampão pH= 6,85: KH2PO4/K2HPO4 0,1M. 
 Sol. Hemolisante: diluir o tampão com água de 1:10. Preparar 
semanalmente. 
 Sol diluente: dissolver 25 mg de hidrossulfito de sódio em 20 mL de sol. 
Tampão. Preparar antes do uso. 
 
PROCEDIMENTO: 
1. Em tubo de ensaio com tampa, colocar 0,1 mL de sangue e 12 mL de sol. 
Hemolisante. Agitar, deixar em repouso por 10 minutos. 
2. Diluir 0,2 mL do hemolizado com 2,3 mL de solução diluente. Tampar. 
3. Deixar a temperatura ambiente por 10 minutos. Ler a absorvâncias a 420 e 432 
nm, usando como branco a solução diluente. 
 
 
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CÁLCULO DA CARBOXIEMOGLOBINA 
 
% COHb = 1 – ( AR . F1) x 100 
 AR ( F2 – F1 ) – F3 + 1 
 
SENDO: AR = Abs. 420 
 Abs. 432 
 
 F1 = Abs. Hb 432 
 Abs. Hb 420 
 
 F2 = Abs. HbCO 432 
 Abs.HbCO 420 
 
 F3 = Abs. HbCO 420 
 Abs. Hb 420 
 
ONDE: F1 = 1,3330; F2 = 0,4787; F3 = 1,9939 
 
MATERIAIS QUANTIDADE 
Amostra de Sangue 2 mL 
KH2PO4 3g 
K2HPO4 3 g 
Hidrossulfito de sódio 25 mg 
Água destilada 1 L 
 
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE 
Espectrofotômetro 01 
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 01 
Tubo de Ensaio com tampa Capacidade 10 mL 03 
Pipeta Capacidade 5 mL 02 
Vórtex para Agitação 01 
 
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 
BEUTLER, E & WEST. C. – Simplified determination of carboxihemoglobin. Clin. 
Chem, 30(6):871-4. 1984. 
 
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de 
Segurança. 
 
 
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Instituto de Ciências da 
Saúde 
CURSO: FARMÁCIA 
DISCIPLINA: TOXICOLOGIA E 
ANÁLISES TOXICOLÓGICAS 
TITULO DA AULA: DETERMINAÇÃO 
DE NITRITO EM ALIMENTO 
 
AULA 
 
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OBJETIVO: Determinar os teores de nitrito como conservante em 
amostra de salsicha para verificar se estão dentro dos Limites Máximos 
Permitidos segundo a Legislação Brasileira preconizados pelo Ministério 
da Agricultura 
PROCEDIMENTO: 
Padronização 
(1) Alíquotas de 1,2,4,8,16 ml da solução padrão de nitrito de sódio; adicionar 
5 ml do tampão em 100 ml de H2O. 
(2) Solução a ser utilizada: 
 10 ml de cada alíquota em 100 ml de H2O. 
(3) Adicionar 5 ml de cada solução (2) em 10 ml de reagente cromogênico e 5 
ml de H2O + 5 ml tampão 
(4) Deixar em banho de H2O a 30
oC por 30 minutos. 
(5) Leitura espectrofotométrica em 474 nm. 
OBS.: O branco se constituirá de 10 ml do reagente cromogênico em 10 ml de 
água + 5 ml tampão. 
Desproteinização 
Pesar 10g do alimento homogeneizado em um béquer de 150 ml. Adicionar 5 
ml da solução I (bórax) e cerca de 
40 ml de água destilada, a temperatura acima de 70 C. Aquecer em banho de 
água fervente por 15 minutos, agitando frequentemente. Deixar esfriar a 
temperatura ambiente. Adicionar 2 ml da solução II (ferrocianeto de potássio) 
e 2 ml da solução III (acetato de zinco). Agitar vigorosamente após cada 
adição. 
 
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Transferir a amostra para um balão volumétrico de 100ml. Deixar o balão em 
repouso por 30 minutos a temperatura ambiente. 
Completar o volume com água destilada. Agitar o conteúdo do balão 
vigorosamente e filtrar em papel livre de nitritos. Determinar a concentração 
de nitrito presente nesta solução. 
Determinação de nitrito 
Pipetar 10 ml da solução desproteinizada da amostra de alimento para um 
tubo de ensaio. Adicionar 5 ml da solução tampão e 10 ml da solução de alfa-
naftol. 
Deixar em banho de água a 30 C, durante 30 minutos, esfriar a temperatura 
ambiente: ler em 474 nm. 
Calcular o valor de nitrito presente na amostra, usando a curva padrão 
previamente estabelecida. 
MATERIAIS QUANTIDADE 
Acetato de zinco dihidratado - Zn(CH3COO)2 220 g 
Ácido acético 50 mL 
Ácido sulfanílico. 0,25 g 
Ácido acetico glacial 30 mL 
Água Destilada 2 L 
Alfa naftol 0,20 g 
Amostra de salsicha 
 
10 g 
Ferrocianeto de potássio trihidratado (K4Fe(CN)6 . 3H2O 106 g 
HCl 20 mL 
NaNO2 0,25 g 
NH4OH 50 mL 
NH4OH a 10%. 90 mL 
Tetraborato de sódio decahidratado (Na2B4O7. 10 H2O) 50g 
EQUIPAMENTOS QUANTIDADE 
Bageta de vidro 01 
Banho de Água fervente 01 
Béqueres 100 mL 03 
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Cubeta para leitura no espectrofotômetro 01 
Espectrofotômetro 01 
Funil de vidro capacidade 100 mL 01 
Papel de Filtro 02 
Papel Universal PH 02 fitas 
Pipeta Capacidade 1 mL 02 
Pipeta Capacidade 10 mL 02 
 
BIBLIOGRAFIA 
LARA, W.H.; TAKAHASHI, M.Y.; SILVEIRA, N. - Determinação de nitritos e 
nitratos em conservas de carne. Rev.Inst.Adolfo Lutz, 38(2):161-166, 1978. 
MORIE, G.P. et al. - Determination of Nitrate and Nitrite in Mixture with Nitrate 
ion eletrode. Ana.Clin.Acta., 60:397-403, 1972. 
ARAUJO, A.C.P. - Determinação de nitratos e nitritos em alimentos destinados a 
população infantil (Dissertação de Mestrado) apresentada a Faculdade de Ciências 
Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, 1988 
 
Descarte do material utilizado conforme Normas Internacionais de 
Segurança.