relatorio de toxicologia e análises toxicológicas IVANI

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UNIVERSIDADE PAULISTA – UNIP 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 TOXICOLOGIA E ANÁLISES TOXICOLÓGICAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 CURSO: Biomedicina DISCIPLINA: Toxicologia e Análises Toxicológicas 
 NOME DO ALUNO: Ivani Alves dos Santos 
 R.A: 0430733 POLO: Ibitinga/SP 
 DATA: 07/03/2023 
 
 
 
 
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 INTRODUÇÃO 
 
 Nos dias 25/02 e 04/03 de 2023 tivemos nossas aulas práticas na 
universidade Unip em Araraquara, ofertadas pela professora Hellen. Aulas divididas 
em 4 aulas, onde dentro delas discutimos alguns roteiros, tais como: Padronização de 
fármacos por Cromatografia em Camada Delgada (CCD), Triagem em Urina por 
Cromatografia em Camada Delgada (CCD) / Extração Líquido/Líquido e Identificação 
de Fármacos por CCD, Identificação de Aflatoxina por Cromatografia em Camada 
Delgada (CCD), Determinação da Carboxihemoglobinemia, Determinação de Nitrito 
em Alimento. 
 A toxicologia é a ciência que estuda os efeitos nocivos produzidos pelas 
substâncias químicas sobre seres humanos, animais e plantas. basicamente, a ação 
adversa resultante da interação de agentes químicos e sistemas biológicos, 
buscando prevenir o aparecimento dos efeitos tóxicos decorrentes dessa interação. 
É uma ciência bastante atual, considerando-se a enorme quantidade de substâncias 
químicas com as quais os organismos vivos entram em contato ao longo de suas 
vidas. É uma ciência multidisciplinar que engloba conhecimentos de Farmacologia, 
Bioquímica, Química, Fisiologia, Genética e Patologia entre outros. Mais 
pormenorizadamente, estuda a interação entre os químicos e os sistemas biológicos 
com o objetivo de determinar quantitativamente o potencial do químico para induzir 
danos, de onde resultem efeitos adversos para os diferentes organismos. Investiga, 
igualmente, a natureza destes efeitos adversos, a sua incidência, o seu mecanismo 
de produção, os fatores que influenciam o seu desenvolvimento e a sua 
reversibilidade. 
 A toxicologia se divide em Toxicologia Ambiental e Ecotoxicologia, que estuda 
os efeitos adversos causados por tóxicos liberados no ambiente. Toxicologia 
Ocupacional, onde se estuda os efeitos dos tóxicos presentes nos ambientes de 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 2 
 
trabalho. Toxicologia de Alimentos, que estuda os efeitos adversos causados por 
substâncias presentes nos alimentos. 
 Quem descobriu a toxicologia foi Mateo José Buenaventura Orfila Rotger 
(conhecido também como Mateu Orfila e Mathieu Orfila), químico e médico 
espanhol, teve um papel importante na história da toxicologia, papel este que o 
nomeou como “pai da toxicologia”. 
 
 AULA 1 
 Padronização de Fármacos por Cromatografia em Camada 
 Delgada (CCD) 
 Objetivo: Tendo como objetivo padronizar o comportamento do fármaco 
na realização de testes rápidos utilizados como triagem da exposição do 
organismo a fármacos ou drogas. 
 
 Materiais e equipamentos utilizados: 
 MATERIAIS QUANTIDADE 
Acetona 100 ml 
Ácido acético 50 ml 
Clorofórmio 500 ml 
Éter de petróleo 100 ml 
Fe (NO3)3.9H2O Nitrato férrico 
nanohidratado 
 40 g 
Iodeto de potássio 4,0 g 
Metanol 100 ml 
NaOH 1 g 
Nitrato de bismuto 2,0 g 
Solução de cloreto férrico 10 g 
Sulfato de sódio 10 g 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 3 
 
 EQUIPAMENTOS QUANTIDADES 
Placas cromatográficas de sílica gel 
(0,25 mm de espessura) 
 1 
Capilar de vidro para aplicação em 
cromatografia 
 2 
Cubas de vidro 1 
Nebulizadores 1 
Bomba a vácuo 1 
 
 
 Técnica: 
 
 Utilizamos ácido salicílico como solução padrão e aplicamos na placa 
cromatográfica, colocando em um Becker contendo o sistema solvente clorofórmio: 
acetona (9:1), como fase móvel. Após deixá-las em temperatura ambiente para a 
completa evaporação do solvente, sob capela, revelamos a cromatoplaca com FeCl3 
(agente cromogênico) e avaliamos o comportamento da mancha. 
 
Conclusão: Expressamos os resultados segundo a forma da mancha, cor da 
mancha e Rf, em que: 
 
 Rf = distância percorrida pelo analito 
 distância percorrida pela fase móvel 
 
Obtido um resultado de Rf = 1, já que a distância percorrida pelo analito e a 
distância percorrida pela fase móvel foi a mesma (6,3). Houve padronização, pois 
todas as placas apresentaram a mesma distância 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Foto 1: tirada em sala 
 
 Obs: Após o término da aula, todos os materiais foram descartados conforme 
as normas internacionais de segurança. 
 
 
 QUESTÕES NORTEADORAS 
 
1. Um paciente foi encontrado com hipertermia, zumbido no ouvido, acidose 
metabólica e alcalose respiratória. Em um teste rápido por CCD, o resultado foi 
positivo para exposição a salicilatos. 
 Não, porque a CCD é uma técnica de triagem. Após a confirmação na triagem, 
 deve ser realizada uma análise por técnica confirmatória. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 5 
 
 2. Durante a revelação, ao nebulizar o cloreto férrico, observou-se que a mancha 
característica dessa revelação não foi formada. Proponha sugestões que possam 
justificar e, consequentemente, corrigir essa situação. 
 O ferro do cloreto férrico reage com a hidroxila fenólica do salicilato, gerando cor. 
Quando não há reação cromogênica, possivelmente a solução do cloreto férrico não foi 
preparada adequadamente. Serviço Social 
 
 3. Em uma placa de CCD podem ser aplicados e revelados mais padrões? 
 Sim. Dependendo das substâncias que são reveladas, pode haver vários padrões 
na mesma placa de CCD. Uma das observações relevantes nesse contexto é que a 
aplicação dos padrões ou das amostras deve manter distância adequada entre os 
padrões, para que não haja interferência no desenvolvimento do analito, na placa 
cromatográfica. 
 
 4. Fármacos de caráter ácido podem ser aplicados na mesma placa, juntamentecom os de caráter alcalino? 
Não, uma vez que a extração líquido/líquido separa substâncias de caráter ácido 
com as básicas. 
 
 Aula 2: 
 
 Triagem em Urina por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
 Extração Líquido/Líquido e Identificação de Fármacos por CCD 
 
Objetivo: Teste rápido como triagem da exposição do organismo a fármacos ou 
drogas de abuso e extração de substâncias em material biológico. 
 
Técnica: 
 Fizemos a leitura do Ph da amostra e ajustamos entre 4,0 e 5,0 por meio de 
solução de H2SO4 1%. Colocamos em funil de separação e extraímos com 20 mL 
 
 
 
 
 
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 da mistura clorofórmio: éter (3:1), agitando vigorosamente o funil e aguardamos a 
separação das fases. 
 Filtramos a camada orgânica sobre Na2SO4 1% anidro, a fim de retirar o 
excesso de água, previamente umedecido com a mistura clorofórmio: éter. 
Recolhido o extrato em béquer e repetidos os itens 3 e 4 para recolher o 
filtrado no mesmo béquer. 
 
MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS: 
 
 MATERIAIS QUANTIDADE 
 Acetona 100 ml 
Ácido acético 50 ml 
Clorofórmio 500 ml 
Éter de petróleo 100 ml 
Fe(NO3)3.9H2O Nitrato férrico 
nonahidratado 
 40 g 
Iodeto de Potássio 4,0 g 
Metanol 100 ml 
NaOH 1 g 
Nitrato de bismuto 2,0 g 
Solução de cloreto férrico 10 g 
Sulfato de sódio 10 g 
 
 EQUIPAMENTOS QUANTIDADE 
Funil de separação (125 mL) 2 
Bastão de vidro 1 
Funil de vidro capacidade 100 mL 1 
Béquer 100 mL 2 
Bastão de vidro 1 
Papel Universal pH 2 fitas 
Béqueres 100 mL 3 
Placas cromatográficas de sílica gel 
(0,25 mm de espessura) 
 2 
Capilar de vidro para aplicação em 
cromatografia 
 10 
Cubas de vidro 2 
 Nebulizadores 1 
 
 
 
 
 
 
 7 
Conclusão: A análise do resíduo por cromatografia em camada delgada 
(CCD) não foi avaliada. 
 
 
 
 Imagens tiradas em sala pelo próprio autor 
QUESTÕES NORTEADORAS 
 
1. No procedimento “Extrair com 20 mL da mistura clorofórmio: éter (3:1),” 
qual é o objetivo do clorofórmio? Explique, levando em consideração a 
dissociação do fármaco. 
 Extrair os fármacos que estão na forma molecular. 
 
2. Quais são as características que destacam a urina, o conteúdo gástrico e o 
sangue (plasma ou soro), como amostras biológicas, na toxicologia de 
urgência? 
 
 
 
 
 
 
 
 
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URINA: Amostra biológica de escolha para triagem de fármacos, quando se trata de 
exposição aguda; grande volume disponível, facilidade na coleta, maior 
concentração na urina que no sangue. Inalterados ou na forma de produtos de 
biotransformação. SANGUE: Utilizado para controle terapêutico ou para 
direcionamento analítico, após testar positivo na CCD. CONTEÚDO GÁSTRICO: 
Grande quantidade obtida, os fármacos se encontram na forma inalterada. 
 
3. Caso haja na amostra um analito de carácter ácido, um de caráter anfótero e 
outro de caráter alcalino, em qual fase do sistema heterogêneo líquido/líquido 
estarão cada uma das substâncias. 
 A forma molecular sempre estará no solvente orgânico. Por isso é que se 
acidifica e alcaliniza a amostra, para a extração líquido-líquido. 
 
4. Faça um fluxograma expondo a dinâmica de extração líquido/líquido de 
fármacos de caráter ácido, anfótero e alcalinos. 
 
Polar 
 
 URINA c/ F. Ácido 
 Acidifica a urina 
 forma molecular 
ADD solvente orgânico (apolar) 
 Forma molecular migra para apolar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9 
 
AULA 3 
 
 Identificação de Aflatoxina por Cromatografia 
 em Camada Delgada (CCD) 
 
 
OBJETIVO: 
O objetivo dessa aula foi a identificação de micotoxinas (aflatoxinas B1, B2, G1 e 
G2) presentes 
 em alimentos, sementes, grãos ou rações, com extração por solventes orgânicos e 
Cromatografia em camada Delgada (CCD) 
 A Aflatoxinas são um grupo de micotoxinas estruturalmente semelhantes, 
altamente mutagénicas, que contaminam produtos agrícolas e se desenvolvem 
principalmente em ambientes com temperatura e umidade elevadas. São 
produzidas por fungos do gênero Aspergillus, sobretudo por Aflavus e A. 
Parasiticus. As técnicas mais usadas para a quantificação de micotoxinas são 
as cromatográficas, incluindo Cromatografia em Camada Delgada (CCD), 
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) e Cromatografia Gasosa 
acoplada a Espectometria de Massa (CG/MS). A mais simple s é a CCD, porém 
os outros métodos têm maior sensibilidade e precisão (KAWASHIMA, 2004). 
 
 Materiais e equipamentos utilizados: 
 MATERIAIS QUANTIDADE 
Celite 
clorofórmio 100 ml 
Metanol 300 ml 
Cloreto de sódio 
Cloreto de potássio 2 g 
Hexano 
 
 
 
 
 
 
 
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 EQUIPAMENTOS QUANTIDADE 
Algodão 1 
Agitador mecânico 1 
Balão volumétrico 25 mL 1 
Banho-maria ou rotavapor 1 
Batão de vidro 1 
Béquer 500 mL 1 
Cubeta para leitura no espectrofotômetro 2 
Erlenmeyer de 25 ou 50 mL 1 
Funil de separação 1 
Lâmpada de luz UV de comprimento de 
onda longo 
 1 
Liquidificador, moinho ou moedor de 
carne 
 1 
Papel de filtro qualitativo2 
Peneira de 20 mesh 1 
Placas cromatográficas de sílica gel 
(0,25 mm de 1 Funil de separação 1 
espessura) 
 1 
Rotavapor 1 
Tubo de ensaio 2 
Papel alumínio 1 
 
Técinica: 
 Preparação da amostra – Triture ou moa, de acordo com a natureza da amostra, 
a fim de que se obtenha massa homogênea, podendo utilizar liquidificador, moinho 
ou moedor de carne. Passe a amostra pela peneira de 20 mesh. Homogeneíze 
novamente e retire uma subamostra de 30 g. 
 
 Extração e purificação – Pese 30 g da amostra previa mente homogeneizada e 
transfira para um frasco Erlemeyer. Adicione cerca de 10 mL de água aquecida a 60 
ºC para facilitar a penetração do solvente orgânico nos tecidos hidrofílicos. 
 
 
 
 
 
 
 
 11 
 
Homogeneíze com bastão de vidro. Adicione 100 mL de clorofórmio, tampe o frasco 
com algodão e agite manualmente por 30 segundos. Prossiga esta ope ração com 
agitador mecânico por mais 30 minutos. Filtre o extrato cloro fórmico em funil de 
vidro com papel de filtro qualitativo. No caso de amostra de amendoim ou derivados, 
adicione pequena quantidade de celite ao funil para acelerar a filtração. 
 Colete 50 mL do extrato em outro frasco Erlenmeyer e evapore em banho-maria 
a 80 º C até que todo o clorofórmio tenha sido eliminado. Re-ssuspender o resíduo 
com 5 0 mL de metanol, transfira quantitativamente para o funil de separação, 
adicione 50 mL da solução de NaCl a 4% e agite lentamente. Extraia as gorduras e 
os demais interferentes com três porções de 50 mL e mexa. Descarte a fração com 
hexano (superior). Recolha o extrato metanólico em béquer ou frasco Erlenmeyer. 
Transfira quantitativamente o extrato metanólico para um funil de separação limpo e 
extraia as aflatoxinas com 50 mL de clorofórmio, agitando o funil de separação 
suavemente por três minutos. Deixe as fases se se pararem e recolha a inferior 
(clorofórmio) em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Repita a operação com mais 50 mL 
de clorofórmio. Recolha o total de clorofórmio juntamente c m o extrato da primeira 
partição e evapore em banho-maria a 80ºC ou rotavapor a 50 °C a 60 °C. O resíduo 
deve ser transferido quantitativamente com clorofórmio para um frasco Erlenmeyer 
de 25 o u 50 mL e evaporado sob corrente de nitrogênio. Para efetuar a 
cromatografia em camada delgada, dissolva o resíduo em clorofórmio em 
quantidade adequada, normalmente entre 200 a 500 µL e utilize banho de ultrassom 
por cerca de 30 segundos para assegurar total dissolução das aflatoxinas. Triagem 
das micotoxinas por cromatografia em camada delgada – Aplique em placa de sílica 
gel, 5 a 10 µL da amostra e alguns pontos de cada padrão, separadamente, fazendo 
sobrepor no segundo ponto do padrão 5 µL da amostra. Desenvolva o 
cromatograma em cuba previamente preparada para garantir a saturação com 
tolueno -acetato de etila- ácido fórmico (50:40 :10). Remova a placa depois de 12 cm 
de desenvolvimento do solvente e seque. Observe o cromatograma sob lâmpada de 
luz UV de comprimento de onda longo. 
 
 
 
 
 
 12 
Conclusão: 
 
 O ensaio de identificação de aflatoxina foi executado com sucesso, pois 
a amostra respondeu com o mesmo tempo do padrão conhecido usado no ensaio. 
Podemos observar a direita de ambas as imagens o padrão de aflatoxina e a 
esquerda amostra utilizada no ensaio. Como o resultado só é visível a luz UV, foi 
feito um ponto de marcação para a resposta de cada analito, assim conseguimos 
observar o resultado positivo do ensaio. É possível observar machas acima tanto do 
anilíto quando da amostra de aflotoxina. 
 
 
 
 Imagens tiradas pelo próprio autor, 2023 
 
 QUESTÕES NORTEADORAS 
 
 1. Durante o método de extração das aflatoxinas, em um dos momentos, se 
orienta: “adicione 100 mL de clorofórmio”. Explique por que esse solvente 
orgânico é utilizado para essa extração e se a água fervente seria suficiente 
para essa extração. 
 As aflatoxinas são lipossolúveis. Assim, são extraídas por solventes orgânicos. 
 
2. Observe parte do procedimento analítico: “Observe o cromatograma sob 
lâmpada de luz UV de comprimento de onda longo”. Explique por que o 
método solicita que a análise seja realizada nesse espectro, ou seja, no UV. 
 
 
 
 
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 As duplas ligações das aflatoxinas, quando submetidas à radiação UV, por 
ressonância, fluorescem. 
 
3. No procedimento “Recolha o total de clorofórmio juntamente com o extrato 
da primeira partição e evapore em banho-maria a 80 ºC”, há risco de perda do 
analito por degradação, por conta dessa elevada temperatura? Justifique sua 
resposta. 
 As aflatoxinas toleram elevadas temperaturas 
 
AULA 4 
 
 Determinação da Carboxihemoglobinemia 
 
 Objetivo: 
 Determinar os níveis de carboxihemoglobina de amostras biológicas para 
verificar se estão dentro dos limites máximos permitidos 
 
 MATERIAIS QUANTIDADE 
 Amostra de sangue 2 mL 
 KH2PO4 3 g 
 K2HPO4 3 g 
 Hidrossulfito de sódio 25 mg 
 Água destilada 1 L 
 
 EQUIPAMENTO QUANTIDADE 
 Espectrofotômetro 01 
Cubeta para leitura no 
espectrofotômetro 
 
 01 
Tubo de Ensaio com tampa Capacidade 
10 mL 
 03 
Pipeta Capacidade 5 mL 02 
Vórtex para Agitação 01 
 
 
 
 
 
 
 
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 Recebemos o material biológico em aula, pois ele deveria ser colhido antes e 
no final da jornada de trabalho do individuo que foi submetido a exposição da 
carboxihemoglobina. 
 Logo após, colocamos 0,1 ml de amostra e 12 ml de solução hemolisante em 
tubo de ensaio, e deixamos em temperatura ambiente por 10 minutos. Depois 
diluímos 0,2 ml do hemolisado com 2,3 ml de solução diluente, tampamos e 
deixamos em temperatura ambiente por mais 10 minutos. 
 
Lemos em 420 e 432 nm. de absorbância: 
Absorbância (Abs) 
Conclusão: O Índice Biológico Permitido (IBMP) é de 3,5% e o Valor de 
Referência (VR) é < 1%, ambos para não fumantes. 
Resultado obtido com o analito da amostra retirada no início da jornada de trabalho. 
 420 432 (Comprimento de onda) 
 0,747 0,484 0,747 = 1,543 
 0,484 
1- (1,543 . 1,333) x100= -1,057 = 45,7% 
1,543 (0-8543) -19939+1 -2,312 
%Hbco = 45,7% 
 
Resultado obtido com o analito da amostra retirada no final da jornada de trabalho. 
 420 432 (Comprimento de onda) 
 0,674 0,386 0,674 = 1,746 
 0,386 
%Hbco= 1-(1,476. 1,333) x 100= -1,327 x100 = 53,4%1,746(-0,8543)-1,9939+1 -2,486 
 -1,492 
 -3,486 
%Hbco= 53,4% 
Determinamos o valor de %COHb = 53,4% e concluímos que o resultado 
 
 
 
 
 
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obtido através da amostra analisada em aula, está totalmente fora do Índice 
Biológico Permitido (IBMP). 
 
QUESTÕES NORTEADORAS: 
 
 1. Equívocos pré-analíticos, ou seja, os equívocos cometidos antes da 
análise toxicológica, não é incomum. Para evitar esses equívocos prioriza-se 
trabalhar com profissionais experientes e manter a equipe de analistas 
informada. Imaginemos que um laboratório de análise toxicológica coletasse o 
sangue do trabalhador, para análise de HbCO, no início da jornada. O que você 
espera desse resultado analítico? Justifique sua resposta. 
 Poderia dar um falso-negativo, uma vez que não teria havido exposição 
ocupacional, ao longo do dia. 
 
 2. Imagine que a solução diluente utilizada na técnica tenha tido algum 
problema de qualidade. Que tipo de interferência analítica haveria, caso você 
identificasse essa situação? Explique. 
 Não haveria a redução de elementos cromóforos e consequentemente, haveria 
resposta analítica inconsistente. Serviço Social 
 
 3. Discorra sobre o risco de intoxicação de um trabalhador que apresenta 
como nível de HbCO igual a 3,0%. Ele apresenta risco de intoxicação? 
 Não, porque o preconizado é acima de 3 ½. Com 3,0% não apresenta risco. 
 
 4. Discorra sobre o risco de intoxicação de uma pessoa não exposta 
ocupacionalmente ao CO e que apresenta como nível de HbCO igual a 3,0%. 
Ele apresenta risco de intoxicação? 
 Sim, como esta pessoa não está exposta ao risco de intoxicação, o nível está 
muito acima do esperado, pois neste caso se considera 1,0%. 
 
 
 
 
 
 
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 Aula 5 
 
 Determinação de Nitrito em Alimento 
 
Objetivo: 
 Determinar os teores de nitrito como conservante em amostra de salsicha 
para verificar se estão dentro dos Limites Máximos Permitidos segundo a Legislação 
 Alimentos industrializados apresentam maior durabilidade, devido à 
presença de aditivos alimentares com finalidade de conservação desse 
produto, como é o caso do nitrito de sódio que é adicionado em produtos 
cárneos para conferir a cor vermelha e sabor característico, alé m de prevenir 
alterações desagradáveis e atuar como conservante, principalmente contra o 
crescimento e a produção de toxina do Clostridium botulinum. O maior 
problema associado à ingestão do ni trito de sódio está relacionado com o seu 
potencial efeito tóxico em indivíduos expostos, o que depende tanto da 
quantidade ingerida quanto da suscetibilidade do organismo. O excesso 
desses íons causa danos à saúde humana, e é preocupante sob o ponto de 
vista toxicológico, uma vez que o nitrito é convertido em N -nitrosaminas, e 
possui ação carcinogênica após a digestão. 
 
AMOSTRA UTILIZADA: 
Salsicha 
 
Os reagentes e soluções utilizados neste experimento foram: 
Solução I 
Tetraborato de sódio decahidratado 
(Na2B4O7. 10 H2O)......................................50 g 
 Água destilada até completar 1 L 
Solução II 
Ferrocianeto de potássio trihidratado 
K4Fe(CN)6 . 3H2O.......................................................106 g 
Água destilada até completar 1L. 
 
 
 
 
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Solução III 
Acetato de zinco dihidratado 
 Zn(CH3COO)2..................................................................220 g 
Ácido acetico glacial........................................................30 mL 
Água destilada até completar 1 L. 
 
Reagente Cromogênico. 
Solução de alfa-naftol: aquecer 360 mL de água destilada e 50 mL de ácido acético 
a 50 *C. Transferir esta solução para um frasco escuro contendo 0,25 g de ácido 
sulfanílico. Agitar até dissolver, adicionar 0,20 g de alfa-naftol agitando bem. Esfriar 
a temperatura ambiente e adicionar 90 mL de solução de NH4OH a 10%. O pH 
desta solução deverá ser 4,0 + 0,5. 
Solução tampão: em 500 mL de H2O destilada adicionar 20 mL de HCl 
concentrado. Agitar e adicionar 50 mL de NH4OH concentrado e diluir com água 
destilada até 1000 mL. O pH obtido é de 9,6 - 9,7. 
Solução padrão de nitrito: 0,25 g NaNO2 em 500 mL H2O. 
 
 Obedecendo ao procedimento fizemos a padronização com as seguintes etapas: 
(1) Transferir alíquotas de 1, 2, 4, 8 e 16 mL da solução padrão de nitrito de sódio 
em 5 diferentes balões volumétricos de 100 mL; adicionar 5 mL do tampão e 
completar com H2O destilada, q.s.p. 100 mL, a cada um dos balões. (2) Transferir 
10 mL de cada alíquota da solução (1) para 5 diferentes balões volumétricos de 100 
mL e completar com H2O destilada, q.s.p. 100 mL, a cada um dos balões. Manual 
de Estágio (3) Transferir 5 mL de cada uma das soluções (2) em tubos de vidro e 
acrescentar 10 mL de reagente cromogênico, 5 mL de água destilada e 5 mL da 
solução tampão a cada um dos diferentes tubos. (4) Deixar em banho de H2O a 30 
ºC por 30 minutos. (5) Leitura espectrofotométrica em 474 nm, contra um branco. 
Obs.: O branco se constituirá de 10 mL do reagente cromogênico em 10 mL de água 
e 5 mL tampão (deixar em banho de água a 30 ºC por 30 minutos). 
 Depois de fazer a padronização, fizemos a desproteinização com o seguinte 
passos: Pesar 10 g do alimento homogeneizado em um béquer de 150 mL. 
 
 
 
 
 
 18 
agitando frequentemente. Deixar esfriar a temperatura ambiente. Adicionar 2 mL da 
solução II (ferrocianeto de potássio) e 2 mL da solução III (acetato de zinco). Agitar 
vigorosamente após cada adição. Transferir a amostra para um balão volumétrico de 
100 mL. Deixar o balão em repouso por 30 minutos a temperatura ambiente. 
Completar o volume com água destilada, q.s.p. 100 mL. Agitar o conteúdo do balão 
vigorosamente e filtrar em papel livre de nitritos. Determinar a concentração de nitrito 
presente nesta solução. 
 Em seguida fizemos a determinação de nitrito Pipetar 10 mL da solução 
desproteinizada da amostra de alimento para um tubo de ensaio. Adicionar 5 mL da 
solução tampão e 10 mL da solução de alfa-naftol. Deixar em banho de água a 
30*C, durante 30 minutos, esfriar a temperatura ambiente: ler em 474 nm. Calcular o 
valor de nitrito presente na amostra, usando a curva padrão previamente 
estabelecida. 
 
 INTERPRETAÇÃO 
 
 Segundo a Portaria no 1.004 de 11 de dezembro de 1998 da Secretaria de 
Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde, a quantidade residual máxima de 
nitritos e nitratos em produtos cárneos, excetuando -se o charque brasileiro, é 
de 150 mg/Kg e 300 mg/Kg, respectivamente, expressos como sal de sódio. 
 
 
 MATERIAIS QUANTIDADE 
Acetato de zinco dihidratado - 
Zn(CH3COO)2 
 220 g 
Ácido acético 50 mL 
Ácido sulfanílico 0,25 g 
Ácido acetico glacial 30 mL 
Água Destilada 2 L 
Alfa naftol 0,20 g 
Amostra de salsicha 10 g 
Ferrocianeto de potássio trihidratado 
(K4Fe(CN)6 . 3H2O 
 106 g 
 
 
 
 
 19 
HCl 20 mL 
NaNO20,25 g 
NH4OH 50 mL 
NH4OH a 10% 90 mL 
Tetraborato de sódio decahidratado 
(Na2B4O7. 10 H2O) 
 50g 
 
 
 EQUIPAMENTOS QUANTIDADE 
Bageta de vidro 01 
Banho de água fervente 01 
 Béqueres 100 mL 03 
Cubeta para leitura no 
espectrofotômetro 
 01 
Espectrofotômetro 01 
Funil de vidro capacidade 100 mL 01 
Papel de Filtro 02 
Papel Universal PH 02 fitas 
Pipeta Capacidade 1 mL 02 
Pipeta Capacidade 10 mL 02 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 20 
 
 FOTOS: Preparo da curva de calibração, para análise de nitrito da salsicha. Fonte: próprio autor. 
 
 
RESULTADOS DA ABSORBÂNCIA DOS 5 PADRÕES: 
1ml – 0,047 
2ml – 0,077 
4ml - 0,169 
8ml – 0,281 
16ml – 0,516 
 
Cálculo C1 V1 = C2 V2 
1ML= 0,5mg/ml 1ml = C2 100ml 
 C2 = 0,5 = 0,005mg/ml 
 100 
 
2- 0,5mg/ml 2ml = C2 100ml 
 C2 = 1 = 0,01mg/ml 
 100 
3- 0,05mg/ml 4ml = C2 100ml 
 C2 = 2 = 0,02mg/ml 
 100 
4- 0,5mg/ml 8ml = C2 100ml 
 
 
 
 
 21 
 C2= 4 = 0,04mg/ml 
 100 
5- 0,5mg/ml 16ml= C2 100ml 
 C2= 8 =0,08mg/ml 
 100 
 
 
 
Fotos do próprio autor,2023 separação do analito (nitrito) da salsicha. 
 
 
 O resultado da absorbância dos cinco pontos da curva de nitrito foi 
colocado neste gráfico de dispersão para a avaliação de sua linearidade 
através de seu r2, quanto mais próximo de 1 for o r2, maior a linearidade da 
curva quantitativa do método, e nesta curva tivemos o r2 de 0,9954 . 
 
 
 
 
 
 23 
 
A Amostra da salsicha foi preparada e sua absorbância foi lida 
em 474 nm, o resultado da leitura foi de – 0,092 
 Com o resultado da leitura obtido, iremos então calcular a concentração 
de nitrito na amostra da salsicha através de uma fórmula baseada na curva 
analítica anteriormente preparada. A fórmula é Y:0,0311 x0,0254 onde X é o 
valor da absorbância da leitura da salsicha. 
Cálculo: 
(0,092 – 0,0254) x 1000 
 10g x 0,0311 
Abs da amostra foi de 0,092 
Após o cálculo podemos observar que o valor da concentração de 
acordo com a fórmula, resulta em um valor muito acima do permitido, pois 
havia nitrito na amostra maior do que o esperado. 
 
QUESTÕES NORTEADORAS 
1. Os nitritos e nitratos são substâncias químicas adicionadas 
intencionalmente nos alimentos, com alguns fins, como o de realçar as 
propriedades organolépticas do alimento e inibir a proliferação bacteriana. Sob 
a óptica toxicológica, qual é o significado de determinar os níveis desses sais, 
nos alimentos industrializados? 
São responsáveis pela formação do anidrido nitroso, que leva à formação dos 
compostos N-nitrosos, potencialmente carcinogênicos. 
 
 2. Pesar 10 g do alimento homogeneizado em um béquer de 150 mL. 
Adicionar 5 mL da solução I (bórax) e cerca de 40 mL de água destilada, a 
temperatura acima de 70 ºC. Explicar o objetivo da adição do bórax, no 
procedimento. 
O nitrito e nitrato podem ficar ligados a proteínas da carne e 
consequentemente, para serem determinados, se faz necessária a desproteinização. 
 
 
 
 
 24 
2. Transferir alíquotas de 1, 2, 4, 8 e 16 mL da solução padrão de nitrito de sódio. 
Qual é a concentração de nitritos em cada um desses volumes? 
Os resultados obtidos em cada volume foram: 1ml – 0,047, 2ml – 0,077, 
4ml - 0,169 , 8ml – 0,281, 16ml – 0,516. 
 
 
Referencias bibliograficas: 
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 25 
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para posterior determinação cromatográfica. Quím. Nova, 24(1). Fev. 2001. 
 
 
 
KAWASHIMA, L.M. Micotoxinas em Alimentos e bebidas nacionais 
produzidos e comercializados em diferentes regiões do Brasil. Tese 
(Doutorado em Ciência de Alimentos) – Faculdade de Engenharia de 
Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campina s, São Paulo. 110p. 
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Mestrado) – Apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, 1988. 
 
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MORIE, G. P. et al. Determination of Nitrate and Nitrite in Mixture with Nitrate ion eletrode. Ana. Clin. Acta., 
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