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Tecnologia do sêmen: Avaliação do comportamento reprodutivo. Libido: Desejo e habilidade em procurar a fêmea. Como o touro identifica a presença da vaca no cio? Através do reflexo de flehmen, identifica o feromônio relacionado ao cio -Métodos de seleção espermática -Criopreservaçao de sêmen -Sexagem de espermatozoides Andrologia veterinária Consiste na avaliação da saúde reprodutiva dos machos para diagnóstico de aptidão para a utilização dos mesmos na reprodução. Com esse exame se chega a conclusão se o animal é apto , inapto ou questionável a reprodução, questionável significa que o animal pode ser reavaliado em outro momento o animal não está descartado, mas no momento não entra para condição de monta. O tempo ideal para realizar o exame andrológico segundo a literatura é a cada 90 dias. Como fazer a seleção de um reprodutor ? Avalia-se as questões fenotípicas, ancestrais e progênie do touro também se avalia a inserção do prepúcio, o ângulo do prepúcio, se é longo, pendular, se o animal tem problema de aprumo, avaliar testículo se esta tudo apresentável, o exame andrológico se observa a saúde em geral do touro, saúde sexual, biometria testicular. Quanto melhor o animal tiver circunferência escrotal, melhor é a quantidade de célula germinativa. O processo de espermatogênese em touro dura mais ou menos 60 a 67 dias O potencial reprodutivo depende das glândulas testicular acessória, vesícula seminal, e preciso realizar ultrassom testicular pra ver se não tem trauma, pontos de fibrose, doença contagiosa, líquido no testículo e edema. Critérios a se avaliar I - SAÚDE HEREDITÁRIA II - SAÚDE GERAL III - SAÚDE SEXUAL IV - CAPACIDADE DE COPULA V - CAPACIDADE FECUNDANTE Avaliação da capacidade reprodutiva do touro Padrão racial: Padrões de raça uniformidade fenotípica. Temperamento: Intranquilidade e temperamento bravio, fatores negativos podem comprometer a monta. Masculinidade: Depende da testosterona, desenvolvimento testicular dos órgãos reprodutivos, comportamento sexual e libido. Estado corporal: O animal não deve ser muito gordo. Conformação aprumos: Tem que verificar porque ele vai sustentar o animal. Avaliação da libido Escala de 0 a 10 Dominância social. Principalmente envolvendo de corte em criação extensiva. A idade é fator de dominação no grupo tempo no rebanho. Se o dominador é infértil ou sub infértil, a taxa de bens pode cair até 50%. (Pode interferir no resultado final da monta, porque se o búfalo/touro dominante for infértil, ele não deixa os demais chegarem perto para montar) Exame clínico Anamnese. Dados relacionados ao indivíduo e outros contemporâneos do rebanho. Maneiro sanitário e nutricional. Montar Natural ou doador de sêmen Frequência de Ejaculação. Número de fêmeas cobertas. Índice de retorno ao cio do lote de fêmeas. Tempo de evolução das Alterações. Tratamentos utilizados Índices, zootécnicos do rebanho. Exame do sistema genital. Inspecção. Escroto. (Testículos? tem que avaliar a circunferência escrotal) Avaliado com o animal em estação. Mobilidade. Sensibilidade. Espessura. Temperatura. Aderência. Exame clínico geral. Inspeção (Sistema nervoso respiratório, circulatório, digestivo e locomotor) Locomotor-aprumos (Casco.) Condição corporal. THALITA P.B. RESUMO 1° SEMESTRE DE BIOTECNOLOGIA DA REPRODUÇAO ✓ Fases: 1 - Espermatocitogênese Espermatogônia até Espermátide • Multiplicação • Crescimento • Maturação 2 - Espermiogênese (Diferenciação) Espermátide até Espermatozoide (SPTZ) Estrutura Espermática e Sêmen Espermatogênese Espermatocitogênese ✓ Processo Contínuo nos Túbulos Seminíferos Os espermatozoides se formam a partir da espermatogêneses que e um processo continuo que se inicia na puberdade, a espermatogênese só cessa quando o macho morre, a fase chamada de espermatogênese e dividida em 2 fases. Espermatocitogênese: se tem o desenvolvimento das espermatogonia ate elas se transformarem em espermatides Espermiogênese (Diferenciação): consiste na transformação das espermátides em espermatozoides e o processo de formação do espermatozoide E avaliado na lamina para averiguar os efeitos primários e secundários, o animal tem que ter o máximo 30% de alteração Espermiogênese ou Fase de Diferenciação Espermátide arredondada em SPTZ PROVA Espermatogênese " As espermatogônias multiplicam-se através de mitoses até a adolescência, período no qual passam a se multiplicar com maior intensidade. Depois da multiplicação, ocorre a fase de crescimento, em que algumas espermatogônias crescem e duplicam seus cromossomos, transformando- se em espermatócitos I. Os espermatócitos primários sofrerão meiose, dando origem a duas células haploides chamadas de espermatócitos secundários (n) ou espermatócitos II, que sofrerão outra meiose, originando quatro células haploides, chamadas de espermátides. As duas meioses que os espermatócitos sofrem representam a fase de maturação." As espermátides começam a se transformar em espermatozoides. Nessa fase, as espermátides perdem praticamente todo o citoplasma e começam um processo em que desenvolverão, a partir do centríolo, um flagelo. No início do flagelo dos espermatozoides podemos encontrar mitocôndrias que têm a função de fornecer energia" Espermiaçao Quando a espermiogênese completa-se, os espermatozoides são liberados na luz dos túbulos seminíferos. Espermatozoide 1. *Cabeça:* Contém o núcleo celular, que carrega o material genético do espermatozoide (cromossomos). É fundamental para a fertilização do óvulo. 2. *Acrossoma:* Localizado na parte anterior da cabeça, é uma estrutura membranosa que contém enzimas digestivas. Essas enzimas ajudam o espermatozoide a penetrar na camada externa do óvulo durante a fertilização. 3. *Colo (Pescoço):* Conecta a cabeça à peça intermediária. Ele fornece suporte estrutural ao espermatozoide e permite a passagem de nutrientes e outras substâncias necessárias para sua função. 4. *Peça Principal:* Consiste na porção intermediária e na principal do flagelo (cauda) do espermatozoide. A peça principal contém mitocôndrias, que fornecem energia para o movimento do espermatozoide d d l Plasma seminal • Transporte Espermático • Proteção Espermática (Tampão - Neutraliza pH ácido vaginal) • Nutrição Espermática Água, Substâncias Inorgânicas e Orgânicas Atividade Sêmen E a junção do espermatozoide e do plasma seminal conduzido pelas glândulas sexuais acessórias (Testículo e Epidídimo) -as glândulas sexuais acessórias tem função importante que e a formação do plasma sexual, elas nutrem e conduzem eles, nos suínos ele funciona como um tampão cervical, ele fecha a cerviz para que não tenha refluxo do sêmen do suíno que e bem volumoso, dependendo do animal pode ejacular 500ml Cães, suínos e touros Masturbação e a mais utilizada em cães e suínos, não utilizado em touros, fêmea em cio - melhora a qualidade do sêmen, pois o animal tem estimulo sensorial Pode utilizar funil de vidro ou plástico, Becker ou tubo graduado para coleta Tecnologia do Sêmen I ✓ Obtenção ✓ Avaliação ✓ Diluição ✓ Conservação✓ Obtenção ✓ Avaliação ✓ Diluição ✓ Conservação Obtenção do Sêmen OBTENÇAO DO SEMEN -ELETROEJACULADOR -AUXILIO DE FEMEA -MASSAGEM E precisa ser aplicado de forma correta para evitar perda, tem que higienizar retirara as impurezas porque isso pode comprometer a viabilidade do espermatozoide, e preciso um método de coleta que mantenha a saúde dos doadores, estressar menos o animal para ele não ter uma memoria negativa de dor ou desconforto para ele não perder a sua libido, evitar memoria negativa de certa situação que gerou estresse para ele ✓ Métodos de Colheita de Sêmen • Ejaculado sem Perdas ou Impurezas • Viabilidade dos SPTZs não alterada • Manutenção da Saúde e Libido dos Doadores Colheita de Sêmen no Macho ❖ Excitação Mecânica do Pênis ou Masturbação ou Manipulação Digital CÃES ✓ Massagear prepúcio na altura do bulbo cavernoso ✓ Prepúcio retraído e pênis exposto por trás do bulbo ✓ Pênis apertado commoderada pressão entre dedo indicador e polegar, posteriormente ao bulbo ✓ Ejaculação intra-vaginal em gotas -FRAÇOES 1º: Pré-espermática - 0,25-2,0 mL Fluído Prostático - Transparente “Lavagem” do canal uretral Movimentos pélvicos - 1 a 2 min. 2º: Espermática - 0,5-5,0 mL Origem testicular - 30 a 60 seg. Branca e Viscosa = Rica em SPTZs 3º: Pós- espermática - 3,0- 30,0 mL Fluído Prostático - Aquosa - 10 a 45 min. Transporte espermático Neutraliza acidez vaginal ❖ Massagem das Ampolas dos Ductos Deferentes Precisa de fêmea ou manequim Becker com Gaze ✓ Ejaculação Intra-cervical 5 a 10 minutos Ejaculação Bovinos / Bubalinos / Eqüinos Eletroejaculaçao Um eletroejaculador é um dispositivo usado na medicina veterinária para facilitar a ejaculação em animais, com o objetivo de coletar sêmen ou para inseminação artificial. Ele utiliza estimulação elétrica para induzir a ejaculação em animais machos. É comumente usado em programas de reprodução de gado, ovelhas e cabras. 1º fração: Translúcida Líquido Seminal e Poucos SPTZs - “Limpa” o canal uretral ✓Principal método utilizado em búfalos Em búfalos não se usa eletroestimulador Em equino o melhor método e a vagina artificial Início - Estímulos rápidos 200 mA ou 4 volts / 2-3 seg Intensidade e Tempo - Gradativo 300 mA ou 6 volts / 3-10 seg Ejaculação = Variação Individual SUINOS 2º fração: Esbranquiçada e Opaca Rica em SPTZs 3º fração: Líquido Gelatinoso (Glândulas Bulbouretrais) Impede refluxo de sêmen após cópula Bovinos / Ovinos / Caprinos / Felinos Animais Selvagens e de Laboratório Suínos - Pouco utilizado (Gordura) Bubalinos e Equinos - Não indicado ✓ Exige condicionamento ✓ Risco de traumatismo ✓ Não utilizado ✓ Contenção do animal ✓ Limpeza do reto ✓ Massagem Via retal (Segundos a 10 minutos ) 1º Fração: Secreção das Glândulas Sexuais Acessórias 2º Fração: Rica em SPTZs ✓ Indução por corrente elétrica Medula Espinhal 4º Vértebra Lombar Aplicação de corrente elétrica na região da medula espinhal, especificamente na quarta vértebra. Essa estimulação elétrica ativa os nervos responsáveis pela ejaculação, permitindo a coleta de sêmen para fins de reprodução ou inseminação artificial. gerador elétrico Eletroejaculaçao em felinos ( Gatos: e necessário anestesia e sedação ) TOUROS Coleta farmacologica de sêmen felinos A coleta farmacológica de sêmen envolve o uso de medicamentos para estimular a produção de sêmen e facilitar sua coleta quando não e possível obter a ejaculação de forma natural em animais, em felinos o processo e com: Medetomidina (anestésico) ação nos ductos deferentes, auxiliando a ejaculação e chegada do sêmen na uretra Sondagem ( cateterização) sondagem uretral apos o anestésico , apos isso coleta o sêmen no lúmen do cateter por forças capilares Dose- 130 ug/kg IM (SÊMEN DE QUALIDADE) Camisa Peniana equino A camisa peniana equina e um dispositivo utilizado em cavalos para coletar sêmen durante a monta controlada Não recomendado Desvantagem difícil execução, acidentes por queda ou ruptura alem de sêmen contaminado Vagina artificial Composta por um tubo rígido com válvula, mucosa de borracha e tubo de colheita, recoberto por capa térmica através da válvula do tubo coloca-se água a T de 39 a 45 graus C e regula-se a pressão, já a temperatura interna deve estar entre 39 e 42 graus C Equino Bovino Vantagens Melhor higiene Avalia libido, monta e volume do ejaculado, sempre avaliar a monta a ejaculação pois e o volume que produz Desvantagens Utiliza fêmea ou manequim Risco de acidentes Difícil em animal com baixo libido e não condicionado - Apos a coleta levar a amostra imediatamente para avaliação macro ou química etc Esponja na cavidade vaginal equinos/bovinos ovinos/caprinos Apos a monta fazer a retirada da esponja e a lavagem em diluidores Desvantagem SPTZs retidos na esponja, lesões espermáticas ao espremer a esponja Coletor vaginal Reveste a parede vaginal antes da copula Desvantagens demora na adaptação da fêmea possibilidade de queda Coleta de sêmen na fêmea Avaliação do sêmen Macroscópica Volume : E avaliada em relação a concentração espermática para determinar a fertilidade Cor : Alterações significativas na cor podem indicar problemas de saúde ou contaminação bacteriana Aspecto : Deve ser homogenia e sem coágulos ou outras anormalidades Odor : Deve ter odor característico Microscópica Turbilhonamento : Refere-se a capacidade dos espermatozoides de se moverem em um padrão rotativo ou circular quando observado no microscópio Motilidade : Refere-se a capacidade dos espermatozoides de se moverem de forma coordenada e linear Vigor : Refere-se a força e vitalidade do espermatozoide Vivos e mortos : vivos tem capacidade de fertilizar o ovulo, mortos não tem essa capacidade Concentração : Refere-se ao numero de espermatozoides presentes por unidade de volume de sêmen Morfologia : Avaliação da forma e estrutura dos espermatozoides COR Branco ou Amarelo-marfim: Bovino, Caprino e Ovino Branco ou Marfim: Bubalino Branco Acizentado: Equino, Suíno, Cão e Gato Vermelho-vivo = Sangue, ferimento ou Inflamação Marrom/Vermelho-tijolo = Lesão crônica Esverdeada = Pus/Infecção Amarelada = Pus/Urina Sui generis = Fosfato de Espermina Urinoso ou Cítrico = Urina Pútrido = Bactérias Avaliação macroscópica Volume o volume e variável entre especies e indivíduos e sem valor biológico na eletroejaculaçao Aspermia ausência de ejaculação/ esperma, obstrução da vias ejaculatórias Avaliação quimica ODOR ASPECTO OU APARÊNCIA Cremoso (leite condensado): Caprino e Ovino Leitoso: Bovino e Bubalino Aquoso: Carnívoro, Equino e Suíno Aparência coagulada = Infecção Exceto Suíno e Equino = Tampão Realiza analises para determinar a composição química do fluido seminal Medidor elétrico: avalia pH, acidez Bovino e Bubalino: 6,4 - 7,8 Caprino e Ovino: 5,9 - 7,3 Suíno: 6,8 - 7,9 - Equino: 6,2 - 7,8 Cão: 6,3 - 6,8 - Gato: 6,0 - 8,0 Avaliação microscópica Turbilhonamento Bovino, Bubalino e Ovino: 3 Caprino: 4 Equino, Suíno e Carnívoro: Ausente PROVA Bovino, Bubalino e Ovino: 3 Caprino: 4 Equino, Suíno e Carnívoro: Ausente PROVA Motilidade (%) Mov. Circular e Retrógrado: Choque Térmico Mov. Oscilatório: SPTZs velhos Análise Computadorizada de Sêmen (CASA) visualiza, Digitaliza e analisa: • Motilidade Progressiva (%) • Velocidade de Trajeto (VAP) • Velocidade Progressiva (VSL) • Velocidade Curvilínea (VCL) • Amplitude de Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH) • Frequência de Batimentos (BCF) Vigor Intensidade do mov. espermático associado a motilidade Ruminante, Suíno, Equino, Carnívoro: 3 Espermatozoides vivos e mortos (%) Coloração Supra-Vital Corado Sêmen + Corante (1:1) = Esfregaço Corantes: Eosina + Nigrosina Vermelho Congo, Azul de Bromofenol Morfologia espermática SPTZ Vivo -Membrana Íntegra -Corante Não Penetra -Incolor ou Parcialmente Corado SPTZ Morto -Membrana Não Seletiva -Corante Penetra =Corado Concentração Nº SPTZs em milhões / mL (cm3 ) de sêmen (x 106 / mL) Associada: Vol., Turbilhonamento, Motilidade e Vigor Bovino e Bubalino: 350-2000 x 106 Equino: 100-300 x 106 Suíno: 180-300 x 106 Caprino: 200-500 x 106 Ovino: 100-300 x 106 Carnívoro: 20-300 x 106 Câmara de Neubauer: E uma câmara de contagem de células que possui uma grade conhecida como grade de neubauer Esta grade permite contar o numero de espermatozoides em uma pequena área e estimar a concentração espermática no sêmen como um todo Esfregaço corado O leitor da maquina dará todas as patologias encontradas na amostra, para ver no microscópio basta corar com panotico m ) % SPTZs Normais Ovino e Caprino: 80% Bovino, Bubalino, Equino, Suíno e Cão: 70% Gato: 60% Se for contado 100 espermatozoides 70% tem que estar saudável, porem pode variar entre especies como o gato e aceitável ate 40% de patologia, bubalinos e bovinos e aceitável ate 30% Alteraçõesacrossômicas A alteração acrossômica interferem diretamente na fertilidade pois e ele quem faz a digestão das células que envolvem o oócito, também pode estar relacionada com o choque térmico então e importante avaliar a temperatura em banho maria T 33 graus ou 32 graus -Interferem diretamente na fertilidade -Envelhecimento -Choque térmico -Abstinência Hereditário Enrugado, contorno defeituoso, destacado Alterações acrossômicas Knobbed sperm Grânulo persistente na porção anterior Deficiência nutricional Degeneração testicular Hereditário Inserção abaixal Alterações do colo E necessário um microscópio muito eficiente para averiguar esse tipo de alteração Formação de glândulas na cabeça do espermatozoide, e uma alteração adquirida relacionado a traumas ou processo infeccioso Alterações da cabeça Interferem diretamente na fertilidade -Formação de vesículas -Aspecto de diadema -Invaginações na membrana nuclear, provavelmente por alteração da cromatina -Degeneração testicular -Hereditário Gota citoplasmatica proximal ( GCP ) -Degeneração ou Hipoplasia testicular -Disfunção epididimária -Imaturidade sexual Defeitos primários ex: Calda dobrada ou enrolada Alterações da PI e cauda “Cokscrew Defect” = Saca-rolhas -Distribuição irregular das mitocôndrias -Degeneração testicular -Hereditário ( condição que afeta a estrutura da cauda apresentando uma forma curvada ou torcida semelhante a um saca rolha ) “Dag Defect” -Disfunção Epididimária -Aumento de Zinco (DAG significa defeito de ativação acrossoma, nesse defeito a acrossoma uma estrutura da cabeça não e ativada corretamente Gota citoplasmática distal (GCD) -Cauda dobrada -Cauda fortemente dobrada A gota citoplasmática distal é uma pequena gota de citoplasma na extremidade da cauda dos espermatozoides durante sua maturação. Testes funcionais Prova Os diluentes podem ser feitos de líquidos orgânicos ou naturais eles servem para aumentar o volume do ejaculado. Temperatura ambiente (25 a 32ºC) -Avaliam Características Funcionais dos SPTZs -Integridade da Membrana Plasmática e Acrossomal =Fertilização -Alto Potencial Mitocondrial =Produção de ATP ✓ Teste Hiposmótico (HOST) Avalia a integridade funcional dos espermatozoides ✓ Teste de Termoresistência (TTR) Avaliar a capacidade dos espermatozoides de resistir a variação de temperatura ✓ Sondas Fluorescentes Avalia a viabilidade, integridade do DNA, motilidade e interações espermatozoide- ovulo Diluição do sêmen Líquidos Orgânicos ou Naturais ➢ Plasma Seminal ➢ Soro Sanguíneo (Inativado 60ºC/30 min) ➢ Leite Esterilizado (Aquecido a 80ºC) Fator Espermicida: Lactenina ➢ Água de Coco in natura A proteína do leite e importante para a concentração espermática já a agua de coco ajuda na diluição de sêmen de cachorro, pode diluir com soro fisiológico também Andromed, Bioxcell são os mais conhecidos no mercado, também há substancias que já vem pronta para facilitar o processo Constituintes Básicos do Diluidor ❖ Água ❖ Tampão - Evita variação de pH Ex: Citrato de Sódio, TES, TRIS (Mantem o equilíbrio do ph) ❖ Regulador do Equilíbrio Osmótico Ex: Citrato, Sacarose, Lactose ❖ Antibiótico Ex: Estreptomicina, Penicilina, Espectinomicina, Lincomicina (Todo diluidor precisa de um antibiótico para evitar o crescimento bacteriano) ❖ Fonte Energética Ex: Frutose, Glicose ( Espermatozoide necessita de mais açúcar já que ele vai ser diluído) ❖ Desidratante Ex: Glicerol, DMSO, Etilenoglicol, Sacarose ❖ Crioprotetor Ex: Leite (Caseína), Gema (Lecitina) Glicerol, DMSO, Etilenoglicol (Crioprotetor para ecristalizar o espermatozoide ) Prova Sêmen Criopreservado Sêmen Refrigerado Tem 3 formas de utilizar o sêmen in natura: coleta e insemina na femea, muito usada em carnívoros Refrigerado Crio refrigerado -Carnívoros :37ºC / até 60 min 23ºC / até 140 min -Ovinos, Caprinos, Equinos e Suínos :Utilização Imediata -Bovinos e Bubalinos Não Utilizado Sêmen Puro (in natura) Etapas da Criopreservação A diluição e de 1 para 1, Ex: 5ml de diluente para 5ml de ejaculado. Vantagens Viabilidade por mais tempo que o sêmen in natura Desvantagem Aproveitamento tempo limitado ( quanto mais tempo passa mais se perde a qualidade/viabilidade -Bovinos e bubalinos Não refrigerar -Suínos: Muito Utilizada 15 a 18ºC / 72 h ACP® -Ovinos e Caprinos: 15ºC / 12 h ou 5ºC / 24 h Água de Coco, ACP®, PBS, TRIS, TES, Citrato, Leite -Carnívoros 4-5ºC/2-5 dias TRIS, TES Água de Coco ACP® Leite -Equinos 5ºC / 36 h ou 4ºC / 72 h Água de Coco, ACP® PBS, Citrato TRIS, TES 1) Diluição (25-32ºC) 2) Identificação e Envase 3) Refrigeração (4 a 5ºC / 3 a 4 h) 4) Congelação Vapor de N2 (-120 a 150ºC / 20 min) Imersão em N2 (-196ºC) 5) Armazenamento 6) Descongelação Identificação Nome/Nº/Raça do Animal, Central (Laboratório) N° ou Data da Partida (Colheita) Envase Refrigeração (4 a 5ºC / 3 a 4 h) Tempo de equilíbrio período necessário p/ redução gradativa de temperatura (1,0 a 1,2ºC / min) ± 90 min p/ atingir de 4 a 5ºC Congelação Inicialmente no Vapor de nitrogênio (-120 a -150ºC/15 a 20 min) Depois Imersão no nitrogênio (-196ºC) Pequena Retenção de Água Intracelular vai evitar Desidratação Excessiva ( o espermatozoide morre se retirada toda agua dele ) Velocidade de Descongelação do Sêmen Convencional = “Manual” Automatizada = Equipamento Métodos de Congelação Armazenamento do Sêmen ✓ Depende da Velocidade de Congelação e da Quantidade de Água Intracelular Imersão em Nitrogenio liquido -196ºC ✓ Doses em Raques Identificadas ✓ Botijões de Nitrogênio (-196ºC) Nível Nitrogênio liquido = 15 cm Tempo Indeterminado Descongelação do Sêmen Água: 37 a 40ºC / 25 a 30 seg
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