Identificação de possíveis parceiros moleculares da célula hospedeira que interajam com a oligopeptidase B de Trypanosoma cruzi

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Identificação de possíveis parceiros moleculares da célula hospedeira que interajam com a oligopeptidase B de Trypanosoma cruzi
João Antonio Alves Nunes1, Flávia da Silva Nader Motta1, 2
1 – Laboratório de Interação Parasito-Hospedeiro, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, Brasília, DF, Brasil.
2 – Faculdade da Ceilândia, Universidade de Brasília, Ceilândia, DF, Brasil.
Resumo
Introdução: A invasão de células pelo Trypanosoma cruzi é um processo altamente eficiente que envolve a participação de vias de sinalização bilaterais, proteínas de superfície e moléculas sinalizadoras clássicas, além de proteases do parasita, como a Oligopeptidase B (OPBTc). Essa enzima é comprovadamente importante para o estabelecimento da infecção pelo protozoário, e vem sendo cada vez mais relatada como fator de virulência em tripanossomatídeos. Apesar disso o papel fisiológico, o mecanismo de ação e o substrato dessa proteína não foram identificados. Tendo isso em vista, o objetivo desse trabalho foi obter os possíveis parceiros moleculares, da célula hospedeira, que interajam com a OPBTc, utilizando para isso o cross-linking químico. 
Metodologia: A proteína recombinante, contendo o C-terminal composto por aminoácidos histidina, foi purificada através de cromatografia de afinidade em coluna contendo agarose-níquel e a pureza da amostra foi verificada através de eletroforese em gel SDS-PAGE seguida por coloração com prata. Cultura de células L6 foram expostas a quantidade adequada da proteína recombinante purificada e posteriormente foi adicionado formaldeído para que ocorresse o cross-linking, seguido de glicina para que houvesse a inativação do formaldeído. Essa cultura de células foi então lisada e centrifugada para que o sobrenadante resultante, contendo os complexos formados através do cross-linking, fosse utilizado. A amostra foi então quantificada e preparada para que fosse então realizado o western blotting com o anticorpo anti-OPBTc. 
Resultados: A OPBTc foi colocada em contato com a célula hospedeira na tentativa de identificar algum ligante para a protease na superfície da célula. Após a interação, foi adicionado formaldeído ao cultivo celular para provocar o cross-linking químico da OPBTc com possíveis ligantes da membrana celular. Posteriormente, as células foram recuperadas, lisadas e o extrato total foi submetido a analise por eletroforese em gel de acrilamida. Para observar se houve a formação de complexos, realizou-se a técnica de western blotting com o anticorpo anti-OPBTc. A revelação do western blotting mostrou a presença de bandas de pesos moleculares maiores que o peso esperado da OPBTc e as mesmas bandas não estavam presentes no controle. Esse resultado indica que a OPBTc pode formar complexos com proteínas presentes na superfície da célula hospedeira.
Discussão/Conclusão: Interações proteína-proteína são fundamentais para todos os processos biológicos e a determinação de interações que possam ocorrer em um organismo ou inter-organismos é de grande valia para entendimento de processos celulares como crescimento e metabolismo celular, interação parasito-hospedeiro, entre outros. Este plano de trabalho mostra a que a OPBTc possivelmente forma complexos com proteínas presentes na superfície da célula hospedeira. Outros experimentos devem ser realizados para corroborar o resultado obtido, além da identificação dos componentes do complexo por meio de espectrometria de massa.
 
Palavras-chave:, Doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, protease, Oligopeptidase B, interação proteína-proteína, cross-linking
Introdução
A doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana, é uma zoonose cujo agente etiológico é o protozoário Trypanosoma cruzi. Essa enfermidade afeta de 16 a 18 milhões de indivíduos, além dos 80 milhões que correm risco de serem infectados na América Latina1. A doença possui altas taxas de morbidade e mortalidade, além de estar associada com altos níveis de pobreza, baixo saneamento básico e desnutrição, caracterizando a doença como negligenciada2, devido a isso a tripanossomíase é de grande importância para a saúde pública, porém os fármacos utilizados no tratamento são muito tóxicos para os usuários e apresentam diversos efeitos adversos, além de não prevenirem a doença em fase crônica, neste cenário a caracterização molecular e funcional dos fatores de virulência do T. cruzi pode servir de base para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas contra a doença3,4.
A invasão de células pelo T. cruzi é um processo eficiente que envolve a participação de vias de sinalização bilaterais, proteínas de superfície e moléculas sinalizadoras clássicas, que resultam na entrada ativa do parasita na célula hospedeira5, além disso também participam do processo proteases do tripanosomatídeo6. Uma dessas proteases é a Oligopeptidase B (OPBTc), originalmente descrita por Santana, et al. 1992, como Tc120. Essa enzima participa do processo de invasão gerando um agonista que ativa a fosfolipase C da célula hospedeira resultando na formação de inositol trifosfato (IP3) e, consequentemente, na liberação intracelular de Ca2+ 8. A liberação intracelular desse íon promove modificações no citoesqueleto da célula hospedeira e promovem o recrutamento e fusão dos lisossomos ao local de ligação do parasita, facilitando sua entrada. Ao contrário de muitos outros parasitas intracelulares, o T. cruzi se beneficia do pH ácido dessa organela, ativando processos fisiológicos essenciais que resultam em diferenciação e auxiliam no escape do sistema imunológico9. Ainda não é possível afirmar se geração do agonista ocorre no citoplasma do T. cruzi ou no meio extracelular pela OPBTc secretada4.
Diversos experimentos já demonstraram a relevância da OPBTc para a doença de Chagas. A utilização de anticorpos específicos contra essa enzima foi capaz de neutralizar a ação do parasita inibindo a sinalização de Ca2+ em células hospedeiras6. O parasita mutante opb -/-, incapaz de produzir a proteína, apresentou significativa redução na capacidade infectante in vitro e de estabelecer a infecção em camundongos10. Além disso, a OPBTc recombinante purificada foi capaz de restaurar a sinalização de Ca2+ no mutante10. Mais recentemente a proteína foi caracterizada de forma bioquímica e biofísica destacando a organização molecular na forma de um dímero estável e reforçando sua possibilidade para aplicação terapêutica3. Como demonstrado, diversos esforços foram realizados para compreender as propriedades estruturais e funcionais da OPBTc, porém o seu papel fisiológico e seu substrato natural ainda permanecem desconhecidos.
Um tema comum que permeia a investigação biológica é que a maioria das proteínas, geralmente, funciona como componente de complexos que contêm outras macromoléculas específicas para realizar processos biológicos montando uma rede de interações capaz de conectar múltiplas e diferentes etapas celulares11. Interações proteína-proteína são fundamentais para todos os processos biológicos e a determinação de interações que possam ocorrer em um organismo ou inter-organismos é de grande valia para entendimento de processos celulares como crescimento e metabolismo celular, interação parasito-hospedeiro, entre outros.
Tendo isso em vista, este plano de trabalho teve como objetivo a identificação dos possíveis parceiros moleculares da célula-hospedeira que possam interagir com a OPBTc, de tal forma que seja possível solucionar o mecanismo de ação e participação dessa enzima na patogenia da doença de Chagas.
Materiais e Métodos
Purificação da OPBTc: A proteína recombinante com cauda Histidina no C-terminal foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna contendo Agarose-níquel3. Brevemente, E. coli BL21 (DE3) crescida durante toda noite a 28°C induzida com 0,5 mM de IPTG foi lisada com BugBuster (Novagen) e o extrato solúvel submetido a cromatografia de afinidade. Após lavagem extensiva da coluna com tampão variando a concentração de imidazol, a enzima foi eluídacom tampão contendo 250 mM de imidazol. A pureza da amostra foi verificada por eletroforese em gel SDS-PAGE seguida por coloração com prata.
Cultura de células L6: Células L6 com baixa confluência foram cultivadas e mantidas em meio Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com soro fetal bovino inativado 5% (v/v) e com gentamicina (100μg/mL) em estufa a 37ºC com CO2 (5%).
Cross-linking com formaldeído: Células L6 previamente cultivadas foram tripsinizadas e posteriormente inativadas com DMEM gelado. As células foram acondicionadas em falcon, e o meio de cultura juntamente com a tripsina foi retirado por centrifugação – 1.800 x g por 3 min a TA. 2 controles foram previamente permeabilizados com 0,2ul de Triton X-100 e foram deixados em incubação por 10 min a 4ºC, e em seguida as amostras foram centrifugadas – 1.800 x g por 3 min - e lavadas 2 vezes com 1 mL de Tris 25mM pH8 NaCl 150mM. Células L6 foram expostas ou não a 100ug de OPBTc durante 15 min em 1 mL de Tris 25mM pH8 NaCl 150mM. Após a interação, uma nova centrifugação foi feita – 1.800 x g por 3 min – e o tampão contendo ou não a OPBTc foi retirado e adicionou-se formaldeído na concentração final de 1% (volume final de 1 mL), que foi incubado em temperatura ambiente por 10 min. A solução de fixação foi removida novamente por centrifugação sob as mesmas condições anteriores e 0,125M de glicina foi adicionado às células para que o formaldeído fosse completamente inativado. Este procedimento teve uma duração de 5 min, e logo depois a glicina foi removida por centrifugação – 1.800 x g por 3 min - e as células foram lavadas 2 vezes com 1 mL de PBS gelado.12
Obtenção do extrato de células L6 após cross-linking com formaldeído: As células foram lisadas em 1 ml RIPA buffer (50mM Tris HCl, pH 8,0, 150mM NaCl, 1% NP40, 0.5% desoxicolato de sódio, 0.1% SDS, 1mM EDTA, inibidor de protease) por cada 1x108 células durante 60 minutos em gelo. Após a lise, as células foram centrifugadas durante 30 minutos a 20000 g e 4°C para remover os detritos insolúveis. O sobrenadante foi usado diretamente ou armazenado a -80°C 12.
Western Blot: A amostra de interesse foi separada por SDS-PAGE e transferida para uma membrana de nitrocelulose (Amershan™ Potran® Supported, GE Healthcare) em sistema MiniProtean®3 Cell (BioRad) de acordo com o estipulado pelo fabricante. A membrana contendo a amostra de interesse foi bloqueada com TBS (Tris buffered saline – 50mM e 150mM NaCl) e leite 5% (v/v) durante 1h. Após o bloqueio, adicionou-se TBS leite 1% (v/v) contendo o anticorpo específico de interesse e a membrana foi sensibilizada 12h a 4ºC. Após esse passo, a membrana foi lavada com TBS Tween 20 0,1% (v/v) por 4 vezes durante 5 min. Em seguida adicionou-se o anticorpo secundário – goat-anti mouse IgG horseradish peroxidase conjugated (1:30000) em TBS leite 1% (v/v) e este foi incubado por 2h a temperatura ambiente. Antes da revelação, a membrana foi lavada 7 vezes com TBS Tween 20 0,1% (v/v) por 5 min (cada lavagem). Para a revelação, utilizou-se o substrato quimioluminescente de peroxidase (ECL™ Prime Western blotting detection reagente, GE Healthcare) de acordo com o descrito pelo fabricante e a visualização foi realizada no equipamento ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).
Resultados e Discussão
Na tentativa de identificar algum ligante para a protease na superfície da célula, a OPBTc foi colocada em contato com a célula hospedeira L6 previamente tratada (ou não) com 0,2% de triton (quantidade suficiente para permeabilizar a membrana plasmática sem que a mesma seja desfeita). A interação foi feita durante 15 min em TA. Após a interação, foi adicionado 1% formaldeído ao cultivo celular para provocar o cross-linking químico da OPBTc com possíveis ligantes da membrana celular. Posteriormente, as células foram recuperadas, lisadas e o extrato total foi submetido a análise por eletroforese em gel de acrilamida (Fig 1).
Figura 1. SDS-PAGE para análise do extrato de células L6 + OPBTc após cross-linking com formaldeído. Poços “+”: presença de OPBTc; Poços “-“: ausência de OPBTc. 
Após a observação do perfil eletroforético do extrato celular após interação com a enzima, o próximo passo foi a realização da técnica de western blot na tentativa de observar a formação de complexos. Com o anticorpo anti-OPBTc foi possível observar a presença de bandas de pesos moleculares maiores que o peso esperado da OPBTc (Fig 2 – pellet) e as mesmas bandas não estavam presentes no controle. Esse resultado indica que a OPBTc pode formar complexos com proteínas presentes na superfície da célula hospedeira.
Figura 2. Western Blot para observação de complexos proteicos após interação células L6 + OPBTc seguido de cross-linking com formaldeído. Poços “+”: presença de OPBTc; Poços “-“: ausência de OPBTc. C+: 40 ng de OPBTc. A membrana foi sensibilizada com o anticorpo anti-OPBTc.
Interações proteína-proteína são fundamentais para todos os processos biológicos e a determinação de interações que possam ocorrer em um organismo ou inter-organismos é de grande valia para entendimento de processos celulares como crescimento e metabolismo celular, interação parasito-hospedeiro, entre outros..
Conclusão
Este plano de trabalho mostra a que a OPBTc possivelmente forma complexos com proteínas presentes na superfície da célula hospedeira. Outros experimentos devem ser realizados para corroborar o resultado obtido, além da identificação dos componentes do complexo por meio de espectrometria de massa.
Referências Bibliográficas
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