PVH prova II - João A

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Disciplina de Princípios de Virologia Humana
Primeiro semestre de 2019
Segunda prova
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Responda as questões a seguir. Embora o email de envio seja prova de sua identidade, peço que preencha o nome e número de matrícula acima para facilitar a montagem da planilha de notas e menções.
Questão 1: na busca por novos agentes terapêuticos, tem havido grande interesse por compostos com ação epigenética; ou seja, drogas que levam à alteração do padrão de modi-ficação de cromatina e, conseqüentemente, do padrão de expressão das regiões afetadas. 
Responda por que se pensa que substâncias que modificam a ação de enzimas modificadoras de histonas po-deriam atuar no controle de herpesvírus, papilomavírus e adenovírus. 
Resposta: Os herpesvírus, papilomavírus e adenovírus são vírus de dupla fita de DNA que são bastante conhecidos por se dirigirem ao núcleo para que ocorra sua replicação. Dessa forma uma vez que o genoma desses vírus se encontra no núcleo da célula hospedeira, ele é capaz de interagir com as histonas. Muitas das vezes essa interação condensa o genoma viral e torna esse inativo por um tempo dentro da célula hospedeira. A utilização de substâncias que modificam a ação de enzimas modificadoras de histonas é pensado ser útil no combate a infecção por esses vírus, pois como o genoma viral deles interage com as histonas essas drogas os afetariam diretamente. Por exemplo: o uso de substâncias que modificam a ação da Histona desacetilase pode fazer com que as histonas continuem acetiladas e o genoma viral continue reprimido e condensado. 
Você pensaria que estas substâncias teriam boa ação contra poxvírus, a julgar apenas pelo mecanismo de-las? Justifique.
Resposta: Essas drogas epigenéticas não seriam tão uteis para controlar a infecção de poxvírus, pois esses vírus, apesar de serem de dsDNA, não se dirigem ao núcleo da célula, portanto não interagem com as histonas e não estarão sujeitos a modificações epigenéticas. Eles possuem outro mecanismo de replicação independente das proteínas celulares, onde esses montam “fábricas” citoplasmáticas de replicação. 
A atenção de vários grupos de pesquisa recaiu recentemente sobre inibidores das histonas metil-transferases EZH2 e EZH1, conhecidos conjuntamente como EZH2/1, que são res-ponsáveis por introduzir metilações do tipo H3K27me3 (histona H3 metilada na lisina-27 na posição 3). 
Pesquise a função dessa metilação e explique por que inibidores de EZH2/1 poderiam ser interessantes como complemento à terapia antirretroviral convencional. Inclua a descrição de um experimento que reforça esse potencial, com referência. 
Resposta: A Lisina 27 da Histona 3 desempenha um papel essencial na regulação da expressão gênica. Uma metilação na posição 3 dessa Lisina (H3K27me3) induz a formação de heterocromatina local, portanto induzindo o silenciamento gênico. Os inibidores de EZH2/1 poderiam ser interessantes para complementar a terapia antirretroviral, pois os retrovírus são conhecidos por se integrar ao genoma e induzirem um auto silenciamento epigenético, através de HDACs e de H3KMTs, dessa forma o vírus entra em estado latente. Sendo assim os inibidores de EZH2/1 seriam úteis para evitar que o vírus entre no estado latente, evitando assim que esse se esconda do sistema imune do hospedeiro. O experimento de Friedman et al (2011) reforça o potencial dos inibidores da EZH2/1, sendo que na ocasião os pesquisadores utilizaram duas linhagens de células humanas contendo um pro-vírus latente derivado do HIV-1. Em ambas as células os pesquisadores promoveram o silenciamento do gene EZH2, sendo que para isso utilizaram um shRNA, que iria induzir o silenciamento pós-transcricionalmente. O resultado observado foi que o silenciamento do gene EHZ2 induzia uma maior ativação transcricional dos pro-vírus derivado do HIV-1.
FRIEDMAN, Julia et al. Epigenetic silencing of HIV-1 by the histone H3 lysine 27 methyltransferase enhancer of Zeste 2. Journal of virology, v. 85, n. 17, p. 9078-9089, 2011.
Um grupo de pesquisadores formulou, para o HHV-1 (vírus do herpes simples 1, ou HSV-1) a hipótese de que inibidores de EZH2/1, como a droga GSK126, induziriam reativação da replicação viral em células com vírus latente, pela desrepressão do elemento regulador da expressão dos genes ligados à produção de vírions. Ao testarem a hipótese, para sua sur-presa, descobriram que a inibição das metil-transferases reduzia a replicação, e não apenas de HHV-1, mas de HHV-5 (CMV), adenovírus 5 e de ZIKV. 
O que a inibição da replicação de ZIKV sugeriu aos pesquisadores sobre o mecanismo de supressão viral induzida por estas drogas? Como eles testaram esta hipótese? Cite pelo menos um experimento, com referên-cia. 
Resposta: A inibição da replicação do ZIKV sugeriu aos pesquisadores que os inibidores de EHZ2/1 modulavam de alguma forma a resposta imunitária e que essa por sua vez seria a responsável pela supressão viral. Para testar essa hipótese os pesquisadores infectaram camundongos por via ocular com o vírus HSV-1 e trataram esses utilizando um placebo, um inibidor da replicação do DNA viral (ACV) e o inibidor da EHZ2/1 (GSK126). Posteriormente, as amostras do local de infecção foram colhidas e coradas com imunofluorescência com a finalidade de detectar as células infectadas e o recrutamento de neutrófilos para o local. Como resultado os pesquisadores observaram que os camundongos infectados com HSV-1 e tratados com a GSK126, por via tópica, apresentaram uma elevada quantidade de neutrófilos. Esse resultado elucidou o mecanismo de supressão viral, sendo que o EHZ2/1 modula a resposta imunitária e convoca neutrófilos para o sítio da infecção. 
ARBUCKLE, Jesse H. et al. Inhibitors of the histone methyltransferases EZH2/1 induce a potent antiviral state and suppress infection by diverse viral pathogens. MBio, v. 8, n. 4, p. e01141-17, 2017.
Valor da questão: seis pontos.
 Questão 2: pesquise a literatura e apure pelo menos um mecanismo de oncogênese direta (ou seja, excluída a genotoxicidade da inflamação crônica) para cada um dos vírus abaixo: 
a) HHV-4 
Resposta: O vírus de Epstein-Barr, também conhecido como HHV-4, está associado com diferentes tipos de câncer e possui diferentes mecanismos de transformação celular. Um desses mecanismos está relacionado com a proteína viral LMP1 (Latent Membrane Protein 1). Essa proteína é essencial para evitar a apoptose de células B infectadas, isso ocorre, pois, essa proteína funciona como análogo ao receptor do fator de necrose tumoral constitutivamente ativo e consequentemente essa ativa muitas cascatas sinalizadoras intracelulares, sendo elas: a via MAPK, PI3K/AKT, JNK e NFk-B. A ativação dessas vias leva a transcrição de fatores que promovem a proliferação celular desordenada, a fuga dos mecanismos apoptóticos e ao ciclo celular desordenado que são características de transformações malignas. 
RAAB-TRAUB, Nancy. Novel mechanisms of EBV-induced oncogenesis. Current opinion in virology, v. 2, n. 4, p. 453-458, 2012.
b) HIV-1 
Resposta: Alguns estudos demonstraram que o vírus HIV-1 pode estar relacionado com processos oncogênicos de forma indireta pela ação de citocinas provenientes da infecção do vírus as células do sistema imune. Porém, um trabalho recente elucidou um mecanismo de oncogênese direta mediado pelo HIV-1, esse mecanismo está relacionado com a produção da proteína estrutural viral p17 mutada. A produção das proteínas p17 virais mutadas pelo vírus HIV é responsável por interagir com o receptor p17R nas células B e induzir a ativação da via de sinalização da PI3K/AKT, essa via por sua vez é responsável pela proliferação exacerbada das células B, características de um linfoma, pela inibição das vias apoptóticas e pela desregulação do ciclo celular. 
GIAGULLI, Cinzia et al. A single amino acid substitution confers B-cell clonogenic activity to the HIV-1 matrix protein p17. Scientific reports, v. 7, n. 1, p. 6555, 2017.c) HCV 
Resposta: O vírus da Hepatite C (HCV) está associado com hepatocarcinomas (HCC), e os principais mecanismos de oncogênese direta do vírus estão relacionados com a proteína core C e com a proteína não estrutural (NS5A). A proteína core C do vírus HCV é uma proteína estrutural e componente do capsídeo viral. Essa proteína pode interagir com diversos fatores transcricionais nucleares, como: p21/WAF1, NFkB e também já foi dita responsável pelo sequestro citoplasmático de LZIP, que é um importante fator transcricional da célula. Além disso, foi descrito que a proteína core C promove a proliferação celular através de uma regulação positiva que essa exerce sobre os níveis de expressão da ciclina-E. Porém, a oncoproteína mais bem descrita na transformação é a NS5A, que é reconhecidamente capaz de interagir com a proteína p53 e impedir que essa atue como fator de transcrição consequentemente impedindo a apoptose mediada por p53 e a expressão dos reguladores do ciclo celular, tornando esse descontrolado e permitindo a proliferação celular desordenada. Outra via importante de participação da NS5A é em sua interação com a caspase 3, prevenindo a célula da apoptose mediada por TNF-a. 
KASPRZAK, Aldona; ADAMEK, Agnieszka. Role of hepatitis C virus proteins (C, NS3, NS5A) in hepatic oncogenesis. Hepatology Research, v. 38, n. 1, p. 1-26, 2008.
d) HTLV-1 
Resposta: O vírus linfotrópico da célula T humana (HTLV-1) possui duas principais proteínas que estão relacionadas com a transformação celular. A proteína viral Tax é responsável por promover a progressão do ciclo celular de forma desordenada, especificamente da fase G1 para a fase S, isso ocorre, pois, essa proteína induz a ciclina-D2 e a CDK-6 através da ativação da via do NFkB, além disso ela também promove a ativação do fator de transcrição E2F e a hiperfosforilação da proteína Rb. Essa mesma proteína também é responsável por inibir a apoptose celular através da ativação da via PI3K/AKT. A proteína HBZ contribui para a regulação da transcrição do RNA viral, porém também possui um importante papel para o vírus na transformação celular, já que essa proteína atua conjuntamente com fatores celulares para expressar genes essenciais para a progressão tumoral. Um exemplo de interação é a que ocorre entre a HBZ e o fator celular JunD, que juntos são responsáveis pela expressão do gene hTERT, que por sua é responsável por formar a enzima Telomerase ativa e promover a imortalização celular. Além de todos esses mecanismos dependentes de oncoproteínas, o vírus HTLV-1 também é capaz de integrar-se ao genoma da célula hospedeira, dessa forma esse vírus pode causar um processo oncogênico a depender da região onde esse irá se inserir, como por exemplo, em caso se inserção dentro da sequência de algum gene supressor de tumor da célula hospedeira.
KANNIAN, Priya; GREEN, Patrick L. Human T lymphotropic virus type 1 (HTLV-1): molecular biology and oncogenesis. Viruses, v. 2, n. 9, p. 2037-2077, 2010.
Inclua detalhes, como nomes das proteínas e mecanismos envolvidos, e referências. 
Valor da questão: quatro pontos. 
Questão extra: (dois pontos a mais em caso de resposta correta) 
arbovírus enfrentam um desafio intrínseco a seu ciclo infeccioso: a necessidade de passar por um artrópode e um vertebrado, alternadamente, para se disseminarem. Com hospedei-ros tão distantes um do outro quanto a anatomia, temperatura corporal, histologia e imuni-dade, pressões seletivas completamente distintas são aplicadas aos vírus por um e por ou-tro. 
Em vista disso, pesquisadores decidiram investigar a dinâmica do vírus do Nilo Ocidental (WNV) em seu ciclo silvestre, cujos hospedeiros vertebrados são aves selvagens e cujos ve-tores são mosquitos de várias espécies do gênero Culex (Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens e Cx. tarsalis). No estudo foi incluído ainda o vetor urbano, Aedes aegypti. 
No estudo, os pesquisadores usaram uma cepa prototípica do vírus, obtida a partir de um hospedeiro vertebrado, para o repasto sangüíneo dos mosquitos. A seguir, eles dissecaram tecidos do mosquito, seqüenciaram os genomas virais encontrados e identificaram muta-ções com relação ao vírus ingerido. A figura a seguir resume os resultados. 
(Os icosaedros negros e coloridos são os vírions. As cores refletem o aparecimento de mu-tantes no tecido por onde os vírus passam – mutantes amarelos apareceram no tubo digestivo e assim por diante. Os fios ondulados na parte inferior são representações esque-máticas dos genomas dos vírus recuperados e os símbolos a eles superpostos demarcam mutações pontuais.). A partir destes resultados, os pesquisadores testaram a viabilidade dos vírus recolhidos da saliva dos mosquitos, em comparação com o vírus original ingerido, em células de fibroblasto de embrião de galinha ex vivo, que é permissiva à replicação de arbovírus. Após colocarem uma mistura do vírus selvagem com os passados pelos mosquitos nas culturas de fibroblastos, eles acompanharam a persistência dos vírus de cada uma das fontes nas células em cultura e obtiveram a figura a seguir. 
WNVic é o vírus original, antes de ter passado pelo mosquito. Cx. quinques é abreviação de Culex quinquefasciatus. Como se vê, todos os vírus que passaram pelo mosquito se tornam menos competitivos pelos fibroblastos do que o original, que passa a predominar na popu-lação. 
Observe as duas figuras e discuta o motivo provável de que apenas o vírus passado em Cx. quinques consegue se manter na competição com o original nos fibroblastos, enquanto que os demais desaparecem rapidamente. 
Resposta: A população de vírus que passou por Cx. quinques é a que apresentou maior índice de mutações por genoma, dessa forma essa população é a que apresenta a maior diversidade genética, quando comparada com as outras populações de vírus que passaram por outras espécies de vetores. Devido a esse fato, a inoculação da população proveniente de Cx. quinques foi a que se manteve mais competitiva, pois essa é a que possui uma maior adaptabilidade tendo em vista a diversidade de genomas maior que possui em sua população. A maior adaptabilidade confere a essa população em específica uma capacidade de se adaptar ao novo meio de cultura de fibroblastos e permite com que essa mantenha-se em competitividade com o vírus original por mais tempo.