relatório purificação e quantificação

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RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS 
Discente: Bruna Luiza Gomes Lopes da Silva 
Data: 26/07/2023 
Aula/Experimento: Técnicas de Clonagem - Purificação e Ligação 
 
1. Liste os materiais e reagentes utilizados: 
Para a purificação: 
- Acetato de sódio (NaAc) 3M pH 5.2: precipita ácidos nucleicos; o sódio, que tem carga 
elétrica positiva, interage com o DNA, que tem carga elétrica negativa, o precipitando 
- Etanol absoluto (EtOH): precipita ácidos nucleicos. 
- EtOH 70% (gelado): precipita ainda mais os ácidos nucleicos. 
- Água (H2O) nuclease-free: ressuspende o DNA que está no fundo do tubo. 
- DNA: conteúdo que queremos purificar 
Para a ligação: 
- T4 DNA Ligase: enzima que liga o inserto no vetor, catalisando a ligação fosfodiéster entre 
eles 
- Ligase 10x Buffer: possui cofatores e estabilizantes de pH da T4 DNA ligase, para que ela atue 
em condições ideais 
- Inserto: material amplificado na etapa anterior 
- H2O: meio de atuação dos reagentes 
- Vetor pGEM-Teasy: se liga ao inserto através de uma ligação fosfodiéster, formando um DNA 
plasmidial recombinante 
2. Descreva qual ou quais os objetivos do experimento realizado: 
O objetivo da purificação do DNA realizada é realizar o descarte de agentes envolvidos na PCR, 
como primers, nucleotídeos não utilizados, porque precisamos que a DNA ligase, enzima que 
será utilizada posteriormente na ligação identifique somente o DNA. Dessa forma, a 
purificação isola o DNA. Além disso, nesse processo o DNA é precipitado, o que também 
aumenta a sua concentração. 
Já o objetivo da ligação é unir o inserto ao vetor através de uma ligação fosfodiéster, formando 
um DNA plasmidial recombinante. Com isso, podemos manipular esse DNA. 
 
3. Descreva a metodologia empregada no experimento: 
Primeiro, nós tivemos que precipitar o DNA. Para isso, tínhamos um tubo contendo 69uL de 
DNA, no qual adicionamos 1/10 de acetato de sódio (NaAc) 3M ph 5.2 em relação ao volume 
da amostra, ou seja, adicionamos 6,9uL de NaAc. Após isso, temos no total 75,9uL no tubo. 
Seguindo o protocolo, devemos acrescentar 2,5 volumes de etanol absoluto (EtOH), o que 
seria equivalente a 189,75uL, mas que arredondamos pra 190uL e adicionamos à amostra. 
Misturamos o tubo por inversão e após isso levamos a amostra para a geladeira. 
Após 5 minutos, retiramos a amostra da geladeira e a levamos para centrífuga, juntamente 
com as amostras dos outros grupos, tendo cuidado com o balanceamento correto. Deixamos a 
amostra rodar por 5 minutos na velocidade 12000g. Depois dessa centrifugação, tivemos 
dificuldade de observar o precipitado, mas prosseguimos com o protocolo e desprezamos o 
sobrenadante. Adicionamos EtOH 70% gelado para lavar o precipitado. Após isso, levamos a 
amostra à centrífuga mais uma vez por 5 minutos na velocidade 12000g. Quando a 
centrifugação terminou, mais uma desprezamos o sobrenadante, ficando com o precipitado, o 
qual novamente tivemos dificuldade de observar, o que nos fez crer que o experimento deu 
errado. Mesmo assim, continuamos, e secamos o precipitado por um tempo. Ressuspendemos 
o DNA em água nuclease-free. 
Após isso, iniciamos o processo de ligação, e a proporção inserto/vetor utilizada foi 3:1. 
Adicionamos a um tubo 1uL do vetor pGEM-Teasy. Retiramos da geladeira a enzima T4 DNA 
Ligase, e acrescentamos 0,5uL dela ao tubo. Pipetamos na amostra 2,5uL de água, 1uL de 
Ligase 10x Buffer, e por fim, 5uL do inserto. A ligação acontece a aproximadamente 20ºC. 
4. Descreva os resultados e a discussão: 
A razão A260/A280 indica a pureza do DNA, sendo A260 a absorbância de DNA e A280 a 
absorbância de proteínas. É ideal que ela esteja entre 1,8 e 2, porque significa que há 
praticamente o dobro de ácido nucleico em relação à proteína. 
Amostra 1: A razão A260/A280 é 1,05, distante do ideal, o que significa que a purificação 
provavelmente não aconteceu da maneira correta, tendo mais proteínas do que o desejado. 
Amostra 2: Amostra ideal para fazer a ligação por ter a razão A260/A280 entre 1,8 e 2. Isso 
significa que há praticamente o dobro de ácido nucleico em relação à proteína, ou seja, ela 
possui o DNA mais purificado das três. 
Amostra 3: A razão A260/A280 é 0,75, muito distante do ideal, ou seja, o DNA não está puro e 
há presença de outros componentes que contaminam a amostra.