Isolamento de ácidos nucleicos

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DESCRIÇÃO
Isolamento dos ácidos nucleicos: coleta, transporte e armazenamento de amostras; extração e
quantificação de DNA e RNA; síntese de cDNA; desenho experimental.
PROPÓSITO
Compreender as etapas para o isolamento dos ácidos nucléicos, a partir do desenho experimental até a
sua extração e quantificação é o primeiro passo para obtenção de amostras de qualidade para a
realização dos métodos moleculares, garantindo, assim, resultados fidedignos.
OBJETIVOS
MÓDULO 1
Descrever o desenho experimental e as fases pré-analíticas do isolamento dos ácidos nucleicos
MÓDULO 2
Descrever os procedimentos de extração e quantificação do DNA e RNA e síntese do cDNA
INTRODUÇÃO
A Biologia Molecular é responsável por estudar as moléculas que realizam a manutenção da vida. São
elas: DNA, RNA e proteínas, que têm como função principal, considerando o dogma central da Biologia,
armazenar informações e enviar essas informações para a síntese das proteínas que realizaram as funções
celulares, respectivamente.
Atualmente, os inúmeros avanços obtidos na área médica, na ciência animal e vegetal, são resultado da
elaboração de técnicas moleculares que nos proporcionaram novas formas de estudar o DNA e o RNA.
Técnicas essas que estão em constante evolução.
No entanto, antes de analisar o material genético propriamente dito, é necessário extrair esse material das
células. Para isso, é essencial que a coleta, o armazenamento, o transporte e o processo extrativo sejam
realizados de maneira satisfatória e que tenhamos uma quantidade de material genético suficiente, de
qualidade, livre de contaminantes e íntegro para realizar a análise.
Você imagina como é feito o processo extrativo? Será que a extração de DNA ou RNA empregam a
mesma metodologia? E o que é cDNA e qual sua importância?
Vamos juntos, ao longo desta jornada, explorar todos esses questionamentos, visitando a coleta, transporte
e armazenamento do material para análise molecular (fase pré-analítica). Após essa fase, vamos aprender
sobre as técnicas de extração de DNA e RNA, quantificação, análise da pureza e, por fim, a síntese do
cDNA. Além disso, estudaremos o desenho experimental e entenderemos a sua aplicabilidade, etapas e
importância no desenvolvimento e conhecimento científico!
MÓDULO 1
 Descrever o desenho experimental e as fases pré-analíticas do isolamento dos ácidos
nucleicos
 
Fonte: Shutterstock.com
1 – DESENHO EXPERIMENTAL
O desenho experimental é um planejamento de um estudo realizado em algumas etapas e é uma
ramificação do método científico, que é a ferramenta mais poderosa de todas para o avanço tecnológico
da humanidade e muda até mesmo a forma que pensamos nas coisas do dia a dia.
Veja a aplicação desse método em uma atividade do nosso cotidiano:
Leonardo tem o hábito de assistir ao telejornal todos os dias. Enquanto assistia ao programa, viu que o
prefeito da sua cidade participou de uma pequena entrevista e fez algumas afirmações sobre o
funcionamento da prefeitura naquele trimestre.
Primeiro, Leonardo deve parar, pensar sobre tal afirmação e aplicar o método científico, observando o
que foi falado e questionando “Será que é verdade o que o prefeito falou?”
Em seguida, ele estabelecerá hipóteses: “É verdade que tal coisa aconteceu” ou “É mentira que tal coisa
aconteceu”.
A próxima etapa é realizar um experimento, que nesse caso é a busca de fontes confiáveis de notícia, com
credibilidade, para identificar se o que o político falou é verdade ou não, analisar o discurso e, finalmente,
Leonardo poderá tomar a sua conclusão baseado no método científico.
Pronto! Agora ele pode validar a hipótese “É verdade” ou “É mentira” ao invés de simplesmente aceitar a
afirmação dita.
O método científico foi utilizado para produzir quase tudo que existe, indo do aparelho em que você está
lendo este texto até a cadeira em que está sentado(a). Nós utilizamos esse método muitas vezes de forma
inconsciente, mas temos que ter em mente que ele existe e que devemos pensar sempre de forma
criteriosa.
Resumindo, as etapas do método científico são: observação, questionamento, hipótese, experimento,
análise dos resultados e conclusão.
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 Método científico. Fonte: EnsineMe.
OBSERVAÇÃO
A partir da observação de algum evento – por exemplo, a existência do DNA –, podemos nos
perguntar (questionar): “Eu gostaria de purificar o DNA para estudar melhor como ele é construído,
tem alguma forma de fazer isso?”.
HIPÓTESE
A partir dessa pergunta, estabelecemos uma hipótese: “Se eu aplicar um reagente específico e fizer
um determinado procedimento, será que consigo o DNA purificado?”.
EXPERIMENTO
Depois vamos para a bancada, onde o experimento é feito, e a partir da análise dos resultados, as
conclusões são obtidas.
Agora que já entendemos o método científico, podemos falar sobre desenho experimental. Ele é um
conjunto de etapas que devem ser realizadas para conduzir uma hipótese utilizando o método científico,
com objetivo de estabelecer um resultado confiável e reprodutível.
A reprodutibilidade é um dos pontos mais importantes da ciência.
 EXEMPLO
Vamos entender melhor com um exemplo:
Sua equipe do laboratório desenvolveu uma nova técnica de quantificação de DNA. Você deverá escrever sua
metodologia passo a passo, com detalhes dos tipos de solventes necessários, as concentrações, pressão,
temperatura de incubação etc. Os dados devem ser claros para que quando outra pessoa ler essa metodologia
(por exemplo, alguém do outro lado do mundo, cinco anos depois) ela consiga chegar no mesmo resultado,
considerando que todas as condições e manipulação foram realizadas conforme o descrito.
As etapas do desenho experimental, são:
1. DEFINIR A RELAÇÃO CAUSA-EFEITO
Estabelecer o problema existente, os objetivos do trabalho e metas a serem cumpridas.
2. PLANEJAMENTO
Com o projeto estabelecido, preparar a instrumentação e avaliar possíveis problemáticas do experimento.
3. EXECUÇÃO
Realizar as medições e técnicas planejadas.
4. ANÁLISE E INTERPRETAÇÃO
Após a execução, analisar os dados coletados de forma criteriosa e científica.
5. FORMULAR AS CONCLUSÕES
A partir da análise e interpretação dos resultados, devemos concluir se a relação causa-efeito se mostrou
existente e responder aos objetivos do trabalho definidos na etapa 1, fechando dessa forma o ciclo do
desenho experimental.
A partir do desenho experimental, pretendemos dizer de que modo ou por que causas o fenômeno é
produzido. Assim, a partir da ideia de relação de causa-efeito em que se acredita que existe uma relação
entre a construção da causa e o efeito observado, formulamos as hipóteses a serem testadas, temos os
vários tratamentos (variáveis independentes) e executamos o experimento e observamos os resultados
(variáveis dependentes). Se o experimento for bem elaborado e planejado, podemos formular conclusões a
respeito da relação de causa-efeito para a hipótese estabelecida.
HIPÓTESES
Hipóteses são afirmações provisórias, enunciadas de forma curta e objetiva, que serão verificadas
para ser ou não demonstradas. Seguem teorias já existentes.
1.1 – VARIÁVEIS DEPENDENTES E
INDEPENDENTES
Mas o que são variáveis dependentes e independentes? Para responder a essa pergunta, aprenderemos
alguns conceitos essenciais para o desenho experimental!
Sempre que fazemos um experimento, queremos verificar os seus resultados. Todos os resultados
(outputs) são originados a partir das entradas do experimento (inputs).
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ENTRADAS DO EXPERIMENTO
A palavra entrada corresponde a todos os valores inseridos em determinado modelo, ou seja, em um
modelo experimental em que valores são dados, as entradas são todos estes valores.
 
Fonte: DesignPrax/Shutterstock.com
Considerando que eu quero extrair o DNA com sucesso, meu input vai ser o material coletado, por
exemplo, o raspado da face interna da bochecha, e o output vai ser o DNA extraído desse material.Os inputs são suscetíveis às diversas variáveis. Elas são agrupadas em dois grupos: variáveis
dependentes e variáveis independentes.
VARIÁVEIS INDEPENDENTES
São aquelas que podemos controlar e modificar e possuem um certo efeito sobre a variável dependente.
VARIÁVEIS DEPENDENTES
Medem o efeito do que está sendo avaliado, dependem da variável independente.
 EXEMPLO
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O experimento será medir a concentração plasmática do meu colesterol. As variáveis independentes, ou seja,
as que eu posso controlar, seriam: Fiz jejum? Me alimentei bem? Usei algum medicamento nos últimos dias?
Essas perguntas irão influenciar diretamente no resultado do colesterol encontrado, ou seja, na minha variável
dependente, que nesse caso é a concentração de colesterol dosada no soro.
1.2 – HIPÓTESE NULA E HIPÓTESE
ALTERNATIVA
Após os resultados do nosso experimento, baseado nos dados coletados e processos realizados, como
garantir que o dado obtido em uma amostra pode ser generalizado para toda a população e verificar se a
hipótese inicial estava correta?
AMOSTRA
Subconjunto de pessoas, itens ou eventos de uma população selecionados para analisar e fazer
inferências.
POPULAÇÃO
Uma população é um conjunto de pessoas, itens ou eventos sobre os quais você quer fazer
inferências.
 RESPOSTA
Para tentar responder a essas perguntas, os cientistas utilizam modelos estatísticos e testes de hipóteses para
analisar os dados e testar a validade desses resultados. Por meio da inferência estatística, os testes de
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hipótese são utilizados para tomar a decisão de aceitar ou rejeitar uma hipótese estabelecida no início do
desenho experimental.
Existem dois tipos de hipóteses: a hipótese nula (H0) e a hipótese alternativa (H1).
HIPÓTESE NULA
Indica que não há uma relação causa-efeito.
HIPÓTESE ALTERNATIVA
Afirma que existe uma relação causa-efeito, ou seja, rejeita a hipótese nula.
Vamos entender melhor a partir de um exemplo:
Para provar que existe um padrão, ou seja, uma relação causa-efeito, vamos estudar se, ao falar com um
papagaio, ele repete exatamente o que eu falo. Nesse caso, minha hipótese inicial, aquela que eu quero
provar, é que o papagaio repete o que eu falo.
Para isso, o experimento será falar várias vezes para o papagaio a palavra Vasco e observar o que ele diz.
Como resultado, podemos esperar que ele repita a mesma palavra (Vasco) ou não (Flamengo, ou qualquer
outra palavra diferente de Vasco). Assim, teremos duas hipóteses: a hipótese nula (aquela em que não há
relação causa-efeito), que ele não repete o que falamos, ou seja, ao ouvir Vasco, ele diz Flamengo.
Quando isso acontece, dizemos que a H0 é verdadeira; E a hipótese alternativa (aquela que confirma a
relação causa-efeito), em que ele repete o que estamos falando, ao ouvir Vasco, ele repete Vasco. Nesse
caso, rejeitamos a H0 e a H1 é verdadeira.
 Hipóteses nula e alternativa. Fonte: EnsineMe.
1.3 – TIPOS DE ERROS
Todos os experimentos e análises de resultados são passíveis de erros de interpretação e/ou do processo
realizado. Os erros são causados quando temos uma interpretação errônea dos dados, o que nos leva a
rejeitar uma hipótese verdadeira (falso positivo) ou não rejeitar uma hipótese falsa (falso negativo). Os
erros podem ser classificados como tipo 1 e 2, de acordo com a hipótese que será rejeitada.
///////
A hipótese nula é
verdadeira
A hipótese nula é falsa
Decisão
Decidimos
rejeitar a
hipótese nula.
Erro tipo 1 (rejeição de
uma hipótese nula
verdadeira)
Decisão correta
Aceita-se a
hipótese nula.
Decisão correta
Erro tipo 2 (não rejeição ou
aceitação de uma hipótese nula
falsa)
 Erros do tipo 1 e 2.
Vamos voltar ao exemplo anterior para entender melhor esses erros:
Como aprendemos anteriormente, ao falar para o papagaio a palavra “Vasco” e ele repetir “Flamengo” ou
qualquer outra palavra além de “Vasco”, a hipótese nula é verdadeira (sem relação causa-efeito). No
entanto, quando falamos “Vasco” para o papagaio e ele repete outra palavra, enviesados para a obtenção
de uma relação de causa-efeito, rejeitamos a H0, mesmo ela sendo verdadeira. Temos um erro do tipo 1
ou falso positivo. Nesse tipo de erro, a hipótese nula é verdadeira (ou seja, ele não repetiu a palavra
Vasco) e nós a rejeitamos (pois entendemos Vasco).
Vimos também que quando falamos Vasco e ele repete Vasco, a H0 é falsa. Qualquer outra palavra dita
pelo papagaio torna a H0 verdadeira, pois ele não repetiu a palavra que queríamos (Vasco). No entanto, se
ao falar Vasco ele repetir a exata palavra Vasco, e nós entendermos “Asco” por engano, vamos entender
que a H0 é verdadeira, porém, neste caso, a hipótese nula é falsa, uma vez que ele de fato repete a palavra
“Vasco”. Esse é um erro do tipo 2 ou falso negativo: aceitamos uma H0 verdadeira (pois entendemos
que ele disse Asco), mas, na verdade, a hipótese nula era falsa (ou seja, ele disse “Vasco”).
 VOCÊ SABIA
Esses conceitos podem ser utilizados em qualquer desenho experimental e são muito comuns na área médica,
principalmente em testes de diagnóstico clínico, onde kits de diagnóstico demonstram resultado positivo para
uma doença inexistente ou resultado negativo, quando na verdade há presença de doença.
Assista ao vídeo abaixo e entenda melhor o desenho experimental.
1.4 – SELEÇÃO DE PARTICIPANTES
A seleção dos participantes, população de estudo, deve ser a mais representativa possível, para termos
uma menor chance de errar ao generalizar os resultados.
A seleção de participantes de um estudo também pode ser chamada de amostragem, que pode ser não
probabilística ou probabilística.
A não probabilística ocorre quando a probabilidade da seleção de cada participante não é conhecida, a
seleção da amostra depende do julgamento do pesquisador e esta pode ser feita pela amostragem por
conveniência (o pesquisador escolhe quem está disponível) ou julgamento (o pesquisador escolhe quem
ele acha interessante).

Já na amostragem probabilística, cada elemento da população possui a mesma probabilidade de ser
selecionado para compor a amostra. Nesse caso, a probabilidade da seleção de cada participante é
conhecida. Por exemplo, em uma amostra aleatória simples com 10 participantes, a chance de um deles
ser escolhido é 1/10, ou seja, 10%.
A amostragem probabilística pode ser:
AMOSTRAGEM ALEATÓRIA SIMPLES
Participantes são selecionados aleatoriamente em uma determinada população. Em uma população de 12
participantes, eu escolho 9 de forma aleatória, ou seja, ao acaso. Isso poderia ser realizado por sorteio,
por exemplo.
 Amostragem aleatória simples. Fonte: Bakhtiar Zein/Shutterstock.com.
AMOSTRAGEM SISTEMÁTICA
O primeiro participante é selecionado a partir de um número preestabelecido e os outros participantes são
escolhidos seguindo um mesmo coeficiente.
Por exemplo, em uma população com 13 participantes, vamos padronizar um coeficiente de 3. Além disso,
vamos utilizar a fórmula 1 + (K x N), onde K é meu coeficiente e N o número do participante.
Se definimos o primeiro participante como o número 1 (poderia ser qualquer outro), quais seriam os outros
participantes?
O segundo participante será o número 1 + o coeficiente (3) X a quantidade de participantes já
escolhidos, assim teríamos 1 + 3 (coeficiente) X 1 (número já selecionado). Ou seja, o participante
seria o número 4.
O terceiro participante será o número 1 + 3 x 2 = 7.
O quarto 1 + 3 x 3 = 10.
O quinto 1 + 3 x 4 = 13, fechando, assim, a amostra.
 Amostragem sistemática. Fonte: Bakhtiar Zein/Shutterstock.com.
Com os conceitos básicos sobre desenho experimental estabelecidos, podemos seguir para as próximas
etapas da fase pré-analítica do isolamento de ácidos nucleicos. Os conceitos aprendidos neste tópico são
valiosos e podem ser utilizados em qualquer situação da vida, seja ela profissional ou do nosso cotidiano.
2 – COLETA, TRANSPORTE E
ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS
DESTINADAS AOS TESTESMOLECULARES
 
Fonte: Natali _ Mis/Shutterstock.com
Atualmente, o mercado dos testes moleculares está em intensa expansão. O marketing feito pelos
laboratórios, as divulgações promovidas por celebridades, as regulações nos preços dos testes, o
desenvolvimento de marcadores e os kits acessíveis, entre outros fatores colaboram para o crescimento
desse ramo de mercado.
São várias as empresas fazendo testes utilizando material genético para diferentes fins, por exemplo,
indicar a ancestralidade e a origem genética e apontar marcadores genéticos para doenças, além dos
testes laboratoriais para diversos tipos de infecções (incluindo COVID-19).
 SAIBA MAIS
Num passado recente, pensar nesse tipo de tecnologia de diagnóstico era deixado para filmes de ficção
científica, aqueles onde um médico high-tech coleta o sangue do paciente, passa em uma máquina e depois de
alguns segundos um papel é impresso indicando todas as doenças e quais medicamentos utilizar.
Hoje em dia esse tipo de abordagem é real, ou pelo menos bem parecido com filmes, pois a população tem
acesso aos testes de forma mais fácil e barata. É importante ressaltar que no Brasil existem algumas empresas
com esse perfil!
Sempre que pensamos nos testes moleculares, automaticamente temos a ideia de perfeição, por se tratar
de tecnologia de ponta, pela propaganda ser sempre bem feita e por ser algo muito misterioso, de
entendimento distante do senso comum. Apesar de muitos acharem que os resultados de testes genéticos
são absolutos, isso não é uma verdade: eles estão sujeitos a erros assim como qualquer teste de
laboratório e a maioria desses erros ocorrem justamente na fase pré-analítica (que compreende desde a
coleta do material até o cadastro e armazenamento das amostras no laboratório, antes da análise
propriamente dita).
 VOCÊ SABIA
Diferentes amostras biológicas podem ser coletadas para os testes moleculares, como sangue, escarro,
amostra de tecidos, um fio de cabelo, dentre outras. A partir dessas amostras, podemos detectar a presença
tanto do nosso material genético (DNA/RNA) quanto o de microrganismos, conseguindo verificar e quantificar a
presença de vírus, bactérias, protozoários; analisar a predisposição ou estado de doenças genéticas; e fazer os
famosos testes de paternidade. Além disso, é amplamente utilizado em perícias médicas: o jornalista Tim
Lopes foi identificado com auxílio dos testes moleculares.
JORNALISTA TIM LOPES
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Arcanjo Antonino Lopes do Nascimento, conhecido como Tim Lopes, foi um repórter investigativo
brasileiro. Ele desapareceu em 2 de junho de 2002, porém sua morte somente foi confirmada no mês
seguinte, após exame de DNA dos fragmentos de ossos encontrados em um cemitério clandestino.
É importante destacar que além das amostras biológicas, os testes moleculares podem ser realizados a
partir de cultura de células e de microrganismos. Nesses casos, também é essencial os cuidados com a
fase pré-analítica, para um resultado de qualidade.
A coleta e manipulação de todas essas amostras, assim como na coleta de qualquer material biológico,
deve ser realizada seguindo todas as normas de biossegurança, com utilização dos Equipamentos de
Proteção Individual, para evitar contaminação.
Além disso, as amostras devem estar devidamente identificadas com o nome do paciente e data da coleta,
assinatura de quem coletou e um código numérico para dupla verificação. Amostras que não estiverem
identificadas corretamente ou aquelas que apresentem características que impossibilitem o teste, como a
presença de hemólise no tubo de sangue, devem ser descartadas.
Alguns tipos de testes possuem critérios específicos de acordo com o procedimento realizado. É
obrigação do laboratório deixar evidente para os pacientes os critérios de aceitação e exclusão de
amostras para cada tipo de ensaio.
 
Fonte: angellodeco/Shutterstock.com
A quantidade de material genético extraído depende diretamente do local de coleta, do número de células
presentes e pode variar conforme a idade do paciente, além de depender diretamente das condições de
transporte e armazenamento.
 ATENÇÃO
Em algumas ocasiões, um resultado negativo em um exame pode ser resultado de um erro durante a fase pré-
analítica, uma vez que o material genético tem que estar viável para conseguir realizar as técnicas moleculares
que envolvem sua amplificação. É sempre preferível trabalhar com amostras frescas para melhorar o
rendimento.
Veja alguns cuidados para extração de amostras de DNA e RNA:
EXTRAÇÃO DE DNA
Para extração de DNA, a coleta deve seguir alguns cuidados, pois, no nosso organismo, existem
moléculas capazes de degradar o DNA, como as desoxirribonucleases (DNases) que necessitam de íons
metal para a sua atividade. Então, para inativação da enzima, pode ser necessária a utilização de agentes
quelantes como o EDTA. Ela também é inativada pelo calor durante 10 minutos a 65°C.
EXTRAÇÃO DE RNA
A coleta de amostras para a extração de RNA requer mais cuidados. O RNA é uma molécula altamente
instável e que apresenta grande fragilidade e se degrada rapidamente pela ação de ribonucleases
(RNase). Essas enzimas não precisam de cofator para se ativar, são estáveis, ficando ativas mesmo após
a fervura e autoclavagem, e estão presentes em uma série materiais biológicos e na nossa pele. É muito
importante a adição de agentes estabilizadores de RNA o mais rápido possível e que o recipiente
utilizado seja certificado como Ribonucleases (RNase) free, ou seja, livre de agentes degradantes de RNA,
estéril, e sempre deve ser manipulado com luvas!
ESTABILIZADORES DE RNA
Os agentes estabilizadores de RNA são reagentes que visam inativar enzimas capazes de degradar
o RNA.
Vamos agora conhecer a peculiaridade de algumas amostras destinadas à extração do DNA/RNA.
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Fonte: Phonlamai Photo/Shutterstock.com
2.1 – SANGUE E ASPIRADO DE MEDULA ÓSSEA
Amostras de sangue e aspirado de medula óssea precisam ser armazenadas junto a agentes
anticoagulantes para manter a estabilidade da amostra, impedindo a coagulação sanguínea. Entretanto, a
heparina (agente anticoagulante amplamente utilizado) é um potente inibidor de algumas técnicas
moleculares, dentre elas o famoso PCR (Polymerase Chain Reaction).
PCR
O PCR é a técnica utilizada para amplificar a quantidade de material genético e que é fundamental
para as análises posteriores ou até pode ser utilizada como ferramenta principal de diagnóstico.
 VOCÊ SABIA
A impossibilidade do uso de heparina fez com que outros anticoagulantes fossem preferíveis, normalmente são
utilizados o EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) ou o ACD (citrato de dextrose) para estas amostras.
A coleta de amostras com o anticoagulante EDTA, apesar de ser mais utilizada e indicada para amostras de
sangue, também pode interferir em algumas metodologias, já que o EDTA pode inibir drasticamente a atividade
da DNA polimerase se estiver em excesso.
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Quando o objetivo é a análise do DNA, o sangue total é estável por até 24 horas em temperatura ambiente.
Na temperatura de 2°C a 8°C é estável por até oito dias. De forma diferente, o plasma fica estável apenas
5 dias na temperatura de 2°C a 8°C, suportando tempos maiores se for congelado e a amostra deve ser
transportada em ambiente refrigerado.
Além disso, se congelada, é necessário que não haja ciclos de congelamento-descongelamento. Para
análise de RNA viral, o sangue deve ser centrifugado e o plasma transferido para outro tubo estéril e livre
de RNases em até quatro horas da coleta.
Para as amostras de aspirado de medula óssea, a seringa deve conter EDTA e após a coleta o aspirado
pode ser armazenado por até 72 horas na temperatura de 2°C a 8°C. Caso seja necessário um maior
tempo para o processamento, os eritrócitos precisam ser removidos e a amostra congelada a -20°C,
assim a estabilidade do material permanece por meses.
Atenção: ela só pode ser congelada após a remoção dos eritrócitos! SAIBA MAIS
1. Para a extração de RNA após a coleta, esta deve ser colocada imediatamente em solução estabilizante de
RNA. Caso não tenha essa solução e não seja congelada, ela deve ser transportada em gelo seco e analisada
em até 4 horas.
2. O grupamento heme presente nas hemoglobinas pode inibir a reação de PCR, então amostras que tenham
algum tipo de hemólise não são satisfatórias para análise. Além disso, caso haja necessidade de remoção dos
eritrócitos, esta deve ser feita de forma cuidadosa, para evitar a hemólise e liberação do grupo heme e causar
problemas nos testes moleculares.
 
Fonte: Jose Luis Calvo/Shutterstock.com
2.2 – AMOSTRA DE TECIDOS
As amostras de tecido são preferíveis quando os agentes etiológicos estão alojados no tecido e/ou o
diagnóstico das possíveis infecções seja difícil por meio da simples coleta de sangue. Além disso, essas
amostras são a de escolha durante as autópsias e para a análise de tecidos tumorais para comparar o
DNA das células tumorais com as normais.
 SAIBA MAIS
Para garantir uma boa análise, é recomendado coletar de 1 g a 2 g de tecido-alvo. No entanto, a quantidade
pode variar de acordo com o tecido.
Apenas para termos uma ideia, 10 mg de tecido fornece cerca de 10 µg de material genético. Essa quantidade
já é suficiente para análise, mas sempre devemos trabalhar com uma margem de segurança, pois possíveis
perdas de material podem ocorrer.
Para tecidos, o ideal, após a coleta por biópsia, é o rápido congelamento em nitrogênio líquido (-196°C) ou
manter esse tecido em solução de preservação de ácidos nucleicos. Não é recomendável manter esse tipo
de material em temperatura ambiente por muito tempo.
Amostras pequenas devem ser embrulhadas em gaze umedecidas com salina para evitar ressecamento,
além da solução de preservação de ácidos nucleicos. Tecidos sólidos apresentam muitas endonucleases e
devem ser processados ou congelados o mais rápido possível!
 ATENÇÃO
Tecidos de biopsia embebidos em fixadores utilizados para a preservação de tecidos para exame
histopatológico não devem ser empregados para os exames de biologia molecular!
A estabilidade do tecido depende do tipo de tecido coletado.
Observe a estabilidade do DNA nas seguintes condições:
Mantido em banho de gelo triturado ou refrigerado em temperatura entre 2°C e
8°C
Até 24h
Congelado a -20°C
Duas
semanas
Congelado a -70°C Dois anos
Se houver impossibilidade de congelar ou usar a solução preservadora, a amostra deve permanecer em
ambiente com gelo, inclusive no transporte e ser processada em 24 horas para o isolamento do DNA.
Quando a amostra for coletada para a extração do RNA, essa amostra deve ser rapidamente congelada
em nitrogênio líquido (-196°C) antes de ser congelada a -70°C, processada em no máximo uma hora após
a coleta ou colocada em solução estabilizadora do RNA. No momento da extração, as amostras não
podem ser descongeladas, e sim homogeneizadas diretamente em solução adequada para a extração
(chamado agente de extração, geralmente isotiocianato de guanidina). Os tubos de coleta também devem
ser livres de RNases, estéreis e apenas manipulá-los com luvas, para evitar a degradação do RNA.
Normalmente, na temperatura de -20°C as RNases ainda estão ativas, assim, é recomendado manter as
amostras para análise de RNA em temperaturas ≥ -70°C.
 
Fonte: Andrey_Popov/Shutterstock.com
2.3 – CÉLULAS BUCAIS
A coleta das células bucais para a extração de DNA ou RNA pode ser realizada por meio de um raspado
de células da parte interna da boca utilizando um swab ou a partir do bochecho. Para extração de RNA
essa amostra deve ser inserida em um tubo contendo solução estabilizante de RNA/DNA. De forma
diferente, amostras para extração de DNA podem ser secas ou estabilizadas e transportadas à
temperatura ambiente. As amostras estabilizadas dentro do tubo possuem validade de até uma semana
em temperatura ambiente, podendo ser transportadas sem maiores cuidados.
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SWAB
Cotonete estéril, específico para coleta de exames microbiológicos.
 VOCÊ SABIA
Alguns swabs mais longos também podem ser utilizados para coletar material presente na orofaringe e na
nasofaringe para o diagnóstico de algumas doenças, em que o agente infectante colonize as vias respiratórias,
como o novo coronavírus e o vírus influenza.
 
Fonte: solar22/Shutterstock.com
Atualmente, as empresas enviam os kits de coleta para o paciente realizar o procedimento em casa: o
swab deve ser esfregado na parte interna da bochecha, cerca de 10 vezes de cada lado e, em seguida,
inserido no tubo que vem no kit contendo a solução estabilizante. Os erros mais comuns que ocorrem
nesse tipo de abordagem são: o paciente descartar a solução estabilizante, a contaminação do swab com
restos de alimentos, batom e em outros casos até mesmo o paciente não identificar corretamente o tubo.
Deve-se evitar a coleta desse material após refeições, pois não é tão raro encontrar, nas amostras
encaminhadas para o laboratório, o DNA de galinha nos testes onde supostamente era para ser feita a
detecção de DNA de um ser humano.
2.4 – COLETA DE LÍQUIDO
CEFALORRAQUIDIANO (LÍQUOR OU LCR)
O LCR quando coletado para análise do DNA deve ser coletado em frascos estéreis, transportado na
temperatura de 2°C a 8°C e, caso não seja processado rapidamente, congelado na temperatura a partir de
-20°C. Para análise de RNA, se o processamento não for realizado em até 4 horas, essa amostra deve ser
congelada. No entanto, caso a amostra tenha eritrócitos, esses devem ser removidos antes do
congelamento.
Outras amostras também são utilizadas para a extração de DNA/RNA. Para conhecer mais sobre esse
assunto, visite a revisão Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico molecular,
presente no Explore mais!
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. ESTUDAMOS AS DIFERENÇAS ENTRE HIPÓTESE NULA E HIPÓTESE
ALTERNATIVA E OS POSSÍVEIS ERROS GERADOS A PARTIR DA
INTERPRETAÇÃO ERRADA DESSAS ANÁLISES. O ERRO TIPO 1 CONSISTE EM:
A) Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é falsa.
B) Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é verdadeira.
C) Não rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula e a alternativa são falsas.
D) Rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é falsa.
E) Rejeitar a hipótese nula, uma vez que a hipótese nula é verdadeira.
2. O ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS BIOLÓGICAS É FUNDAMENTAL PARA
UMA BOA ANÁLISE. COM BASE NO QUE ESTUDAMOS, QUAL SERIAM AS
MELHORES CONDIÇÕES PARA ARMAZENAMENTO DE UMA AMOSTRA DE
TECIDO, POR MAIS DE 1 SEMANA, PARA A EXTRAÇÃO DE RNA?
A) Após a coleta, manter em temperatura ambiente.
B) Após a coleta, um rápido congelamento em nitrogênio líquido (-196°C), seguido do congelamento a
-70°C.
C) Após a coleta, colocar o tecido em um pote com formol, congelar em nitrogênio líquido (-196°C),
seguido do congelamento a -70°C.
D) Após a coleta, manter na temperatura de 2°C-8°C por 24 horas.
E) Após a coleta, colocar o tecido em um pote com formol, congelar em nitrogênio líquido (-196°C),
seguido do congelamento a -20°C.
GABARITO
1. Estudamos as diferenças entre hipótese nula e hipótese alternativa e os possíveis erros
gerados a partir da interpretação errada dessas análises. O erro tipo 1 consiste em:
A alternativa "E " está correta.
 
O erro tipo 1 acontece quando rejeitamos a hipótese nula, sendo esta verdadeira, ou seja, não aceitamos
que não existe relação causa-efeito. Sendo assim, temos um resultado falso-positivo. Um resultado falso-
positivo é quando, por exemplo, assumimos que um paciente tem uma doença, quando na verdade ele não
tem.
2. O armazenamento de amostras biológicas é fundamental para uma boa análise. Com base no
que estudamos, qual seriam as melhores condições para armazenamento de uma amostra de
tecido, por mais de 1 semana, para a extração de RNA?
A alternativa "B " está correta.
 
O RNA tende a uma maior estabilidade quando primeiro congelado em nitrogênio líquido(-196°C), e
depois em -70°C. Na temperatura de -20°C, as RNases que ainda estão presentes no tecido podem
degradar o RNA ao longo do tempo. Além disso, amostras de tecidos para análise de material genético
não podem ser fixadas em soluções fixadoras como o formol!
MÓDULO 2
 Descrever os procedimentos de extração e quantificação de DNA e RNA e síntese de cDNA
1 – EXTRAÇÃO DO DNA E DO RNA A PARTIR
DAS AMOSTRAS COLETADAS
Agora que conhecemos todas as etapas pré-analíticas, estamos prontos para colocar a mão na massa!
Vamos então estudar de fato como é feita a extração do DNA e do RNA a partir das amostras coletadas
para a obtenção do nosso material genético.
No entanto, antes de começarmos a estudar a extração, é interessante relembrar que qualquer técnica ou
procedimento utilizado no laboratório – seja ele qual for – é como fazer um bolo, e por isso devemos seguir
uma determinada receita.
 
Fonte: vchal/Shutterstock.com
 
Fonte: HQuality/Shutterstock.com
No laboratório, chamamos a receita de POP (procedimento operacional padrão) e temos que ter os
ingredientes (os reagentes) e os utensílios para fazer o bolo (os materiais e instrumentos). Ler a receita e
fazer o bolo é um processo mecânico, qualquer pessoa com um mínimo de conhecimento e que saiba
como manusear os instrumentos consegue seguir o passo a passo, e dependendo da experiência, vai
conseguir ter um resultado satisfatório.
No fim do procedimento, pode ser que saia um bolo maravilhoso ou pode ser que não saia. Dessa forma,
percebemos que é importante saber qual é a função de cada componente do bolo para entendermos o
processo como um todo. Caso o bolo saia pequeno, faltou fermento, se ele saiu seco é porque faltou leite,
e assim temos uma noção de causa-efeito. O inverso também é válido: podemos saber tudo sobre como
funcionam os ingredientes do bolo, o nome da levedura usada no fermento, a temperatura ideal para assar
o bolo, qual a importância de cada componente na construção do bolo, mas se não soubermos como
mexer o bolo ou como ligar o forno, o processo simplesmente não funciona!
Assim como fazer um bolo, é de suma importância primeiro entender os conceitos teóricos da extração do
DNA e depois ver como funciona o passo a passo da técnica.
 ATENÇÃO
Antes de iniciar nos procedimentos, é importante ressaltar que após a obtenção de nossa amostra, devemos
sempre tomar cuidado onde ela será manipulada e com a preparação dos reagentes, evitando, assim, a
contaminação com materiais genéticos de outros organismos, ou até mesmo com enzimas que podem vir a
degradar o nosso material de estudo e gerar resultados falhos.
2 – PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO DE DNA
As células eucariontes possuem uma membrana celular, formada por uma bicamada fosfolipídica, além de
diversos elementos dispersos no citoplasma, como as proteínas, os carboidratos, as organelas, os lipídios
e os elementos minerais (sódio, potássio, sais, magnésio, entre outros). Além disso, a célula eucarionte
também possui uma membrana nuclear e dentro do núcleo estão as proteínas, DNA e RNA
majoritariamente.
Para a extração do DNA, todos os outros elementos são considerados contaminantes, até mesmo o RNA.
Assim, a estratégia básica da extração de DNA é, então, separar o DNA de todos esses outros elementos
que não são DNA. Existem algumas formas diferentes de se fazer isso, mas alguns procedimentos devem
ser feitos independentemente da forma de extração.
 
Fonte: Waraporn Kraitavin/Shutterstock.com
A partir da amostra de células, a primeira etapa a ser realizada é o rompimento da parede celular (quando
as células são de origem vegetal ou fungos), da membrana plasmática e da membrana nuclear, liberando,
assim, o material genético. Podemos fazer isso de diversas formas, a saber: com o uso de detergentes
capazes de desestabilizar a membrana celular e nuclear, abrasão física, ação de enzimas capazes de
degradar a membrana e/ou parede celular, pressão osmótica e aquecimento, entre outras.
Quando a intenção é extrair o DNA, junto ao rompimento das membranas é importante adicionar uma
enzima capaz de destruir outras proteínas (proteinases), principalmente para inativar todas as DNases,
impedindo a degradação do DNA. Em seguida, para remover o RNA, que neste caso é um contaminante,
basta adicionar RNAse no meio. Nessa etapa já removemos lipídios, proteínas e o RNA, mas ainda faltam
os carboidratos e os elementos minerais.
Existem algumas formas de se realizar essa etapa, vamos conhecer as 3 principais. São elas:
ADIÇÃO DE SOLVENTE ORGÂNICO
Podemos usar um solvente como o fenol ou o clorofórmio. É importante lembrar que já degradamos
lipídeos e RNA, rompemos as membranas e, se for o caso, a parede celular. Mas o que acontece?
O fenol ou clorofórmio tornam essas moléculas (assim como os carboidratos e todos os elementos
minerais) insolúveis. Após a adição dos solventes, seguida da centrifugação, formam-se duas fases:
 
Fonte: EnsineMe.
1. Fase aquosa: DNA
Na fase superior, o DNA, que não é solubilizado nos solventes (fenol ou clorofórmio), vai permanecer na
fase aquosa.
2. Fase orgânica
Todos os outros elementos irão para a fase orgânica (inferior), como proteínas, lipídeos, RNA degradados,
carboidratos e outros elementos minerais solúveis em fenol/clorofórmio.
Assim, com auxílio de uma pipeta, podemos transferir a fase aquosa com o DNA para outro tubo.
 SAIBA MAIS
O RNA degradado se torna insolúvel, pois complexa com os outros elementos do citoplasma. Se estiver
íntegro, ele pode ir para a fase aquosa, dependendo do pH do solvente orgânico.
SOLUÇÃO CONCENTRADA DE NACL
O cloreto de sódio concentrado é capaz de precipitar os elementos degradados do citoplasma, deixando o
DNA íntegro na fase aquosa. Assim, basta centrifugar e remover a fase aquosa do pellet precipitado, ou
seja, recuperar apenas o sobrenadante, pois nele estão nossas substâncias de interesse.
COLUNA DE ADSORÇÃO DO DNA
O DNA possui carga total negativa vinda do grupamento fosfato. Assim, podemos adicionar uma coluna
com carga positiva (normalmente é utilizada uma coluna de sílica) no nosso tubo e centrifugar. Dessa
forma, o DNA vai ficar retido na coluna devido à sua carga negativa e os outros elementos irão passar
direto pela coluna, ficando no fundo do tubo. Para remover o DNA da coluna, usamos um tampão de
eluição carregado negativamente em grande quantidade. Normalmente, são usados os tampões Tris-HCl
ou o EDTA. Eles irão competir com o DNA pela ligação na coluna de adsorção e, como estão em grande
quantidade, ganham a competição e se aderem à coluna expulsando o DNA. O procedimento é feito
também por centrifugação, porém o material que sairá da coluna será rico em DNA.
 SAIBA MAIS
Se estiver íntegro, o RNA pode ser purificado dessa forma!
PELLET
Pequena porção precipitada de uma solução.
Após a obtenção do DNA por qualquer um desses métodos supracitados, precisamos eliminar qualquer
resíduo que por um acaso ainda esteja misturado ao DNA. Para isso, adicionamos isopropanol, que
precipita apenas o DNA. Após centrifugação, como o DNA encontra-se precipitado, nosso DNA puro
encontra-se no pellet.
 VOCÊ SABIA
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O pellet fica bem aderido no fundo do tubo, podemos lavar o tubo com etanol 70%, por exemplo, para remover
todos os reagentes e secar o tubo, que o DNA continua aderido ao tubo.
A etapa final consiste em ressuspender DNA, em água ou em tampão de eluição, basta adicionar um
pouco do líquido escolhido e forçar a quebra do pellet, no final de todo o protocolo teremos um tubo
contendo apenas o DNA puro.
 
Fonte: Cozine/Shutterstock.com
RESSUSPENDER DNA
Ressuspender é a técnica que possibilita que um pellet volte a ficar em solução.
 SAIBA MAIS
O processo de extração de DNA nos plasmídeos é bem semelhante ao processo geral de extração de DNA. No
entanto, depois da lise da membrana e precipitação das proteínas citoplasmáticas, é adicionada uma solução
de NaOH com pH bastante básico a ponto de desnaturaro DNA cromossomal e o também o próprio DNA
plasmidial. Em seguida, é adicionado uma solução ácida neutralizadora que regenera o DNA plasmidial, mas
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não o cromossomal. Assim, podemos então separar por centrifugação, pois o DNA do plasmídeo fica em
suspensão enquanto o DNA cromossomal precipita.
Agora que sabemos os princípios teóricos da extração do DNA, vamos simular uma situação em que
estamos no laboratório e temos que extrair o DNA de uma amostra coletada. Para isso, vamos utilizar o
protocolo desenvolvido pela EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária) (Adaptado de
OLIVEIRA et al., 2007).
Vamos ver se você consegue identificar e entender o passo a passo de um POP utilizado em uma situação
real. Parece desafiador, mas não se assuste, vamos juntos.
A primeira etapa é conferir todos os reagentes que vamos precisar. São eles:
Tampão de digestão.
Solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (25:24:1).
Microtubos de polipropileno; Frascos e bastões esterilizados.
Solução Tampão TE (tris-HCL 10 mM; EDTA 1 mM com pH 8.0; tris = hidroximetil aminometano).
Etanol 70%; Etanol absoluto; Acetato de amônio 7,5 M; Micropipetas de 1 mL, 200 μL, 100 μL e 10
μL.
Centrífuga.
Isopor com gelo.
Vidraria de laboratório; Banho-maria a 50°C.
SOLUÇÃO TAMPÃO
Solução tampão é uma solução em que o pH permanece em uma determinada faixa de pH, mesmo
após a adição de substâncias ácida ou básica, a não ser que o “tamponamento” seja extrapolado.
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javascript:void(0)
javascript:void(0)
javascript:void(0)
javascript:void(0)
TAMPÃO DE DIGESTÃO
No POP da EMBRAPA, o tampão de digestão é formado por NaCl 100 mM; Tris-HCl com pH 8.0 10
mM; EDTA, com pH 8.0 25 mM; SDS 0,5% (usado como detergente) e proteinase K 0,1 mg/mL.
Fonte: OLIVEIRA et al., 2007.
ÁLCOOL ISOAMÍLICO
O álcool isoamílico serve para prevenir a formação de espuma quando a mistura é agitada,
facilitando a separação da fase orgânica da aquosa.
(25:24:1)
O número 25:24:1, consiste em partes por um todo, ou seja, 25 partes de fenol, 24 partes de
clorofórmio e uma parte de álcool isoamílico.
TAMPÃO TE
O nome tampão TE vem do nome “T”ris “E”DTA.
Após conferimos todo o material, vamos começar a extração do DNA de um tecido de origem animal, e
que por isso não apresenta parede celular.
Lembre-se de que nossa amostra depois da coleta tem que estar armazenada no gelo, para manter a
temperatura entre 2°C‒8°C.
Se o tecido for duro, devemos macerar, usando um bastão de vidro, e se tiver grande quantidade de
líquidos, a amostra deve ser centrifugada para remover o líquido em excesso. Na primeira etapa da
extração, adicionamos o tampão de digestão, na concentração de 1,2 mL de tampão para cada 100 mg de
tecido.
Em seguida, devemos deixar o tubo em banho-maria a 50°C por cerca de 8 a 16 horas, para garantir a
digestão completa das membranas plasmáticas e nucleares e proteínas. No final, o material apresentará
um aspecto viscoso.
 SAIBA MAIS
O tempo de incubação no banho-maria varia de acordo com o tamanho da amostra.
A segunda etapa é a extração do DNA com fenol e precipitação dos compostos indesejáveis. Para isso, o
tubo é retirado do banho-maria e esperamos ele chegar a 37°C para adicionar 5 μL de RNase, e depois
incubamos por 15 minutos sob leve agitação.
 SAIBA MAIS
A adição de RNase é opcional, deve ser empregada quando o RNA é considerado um contaminante.
Em seguida, a solução de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico é adicionada na proporção de 1:1 com a
quantidade de amostra do tubo, ou seja, para cada 500 μL de material, adicionamos 500 μL de solução de
fenol. É importante atentarmos para o pH da solução de fenol, pois em pH abaixo de 7.0 o DNA é
degradado e vai para a interface, região entre a fase orgânica e a fase aquosa, mas é preconizado para
extração de RNA. Resumindo: a solução de fenol com pH em torno de 7.0 é usada para extração de DNA e
em pH entre 4,5 e 5,5 é usado na extração de RNA, que veremos a seguir.
Após a adição do fenol, homogeneizamos e centrifugamos o tubo por dez minutos a 1.700 g. Uma vez com
as fases aquosa e orgânica bem definidas, separamos a fase aquosa contendo o DNA e descartamos a
fase orgânica com todos os contaminantes.
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G
A unidade g descrita no procedimento equivale à aceleração da gravidade na superfície da Terra.
 ATENÇÃO
Nessa etapa, é importante separar bem as fases, pois o fenol pode ser um contaminante, então é recomendado
centrifugar duas vezes.
A terceira fase é a purificação do DNA por meio da precipitação com etanol. Antes de usarmos o etanol
em si, adicionamos meio volume de acetato de amônio 7,5 M e dois volumes de etanol absoluto.
 COMENTÁRIO
Neste POP do EMBRAPA, o etanol é utilizado como agente precipitante do DNA, entretanto poderíamos utilizar
o isopropanol também.
 SAIBA MAIS
A unidade volume é usada para padronizar as quantidades em qualquer sistema, supondo um volume de 500 μL
de fase aquosa, meio volume significa 250 μL e dois volumes significam 1.000 μL.
O acetato de amônio facilita a precipitação do DNA pelo etanol e o etanol absoluto, além de concentrar o
DNA, também ajuda a remover os resíduos remanescentes de fenol e clorofórmio. Centrifugamos a
amostra a 1.700 g por cerca dois minutos. Após a centrifugação, será possível visualizar o pellet bem
aderido ao fundo do tubo. Removemos toda a solução alcoólica e depois vamos ressuspender o pellet em
etanol 70%. Centrifugamos novamente a 1.700 g por dois minutos e tiramos o sobrenadante (uma dica é
deixar o tubo aberto por um tempo, para o etanol evaporar por inteiro). Agora com o pellet limpo, a fase
final é a adição do tampão TE, para facilitar a dissolução do DNA, ou ainda podemos deixar o tubo em
banho-maria a 50°C por algumas horas.
 COMENTÁRIO
Vale lembrar que nesse exemplo estamos extraindo o DNA a partir de amostras de tecidos. No entanto, existem
variações do protocolo. Mesmo que a amostra também seja proveniente de tecido, o protocolo pode ser
modificado, com a utilização de outros reagentes. Entretanto, esse é o procedimento básico e em geral usado
em laboratórios para extração de DNA.
3 – PROCEDIMENTOS DE EXTRAÇÃO DE RNA
O procedimento de extração de RNA é bem parecido com o método de extração de DNA, mesmo o RNA
sendo mais frágil e demandando mais cuidados. Todo material que entra em contato com a amostra deve
ser tratado com soluções neutralizadoras de RNase e possuir a característica de ser RNase free. Além
disso, a amostra deve sempre ser refrigerada em nitrogênio líquido ou gelo para evitar a ação de alguma
RNase remanescente.
Vamos agora rever as três etapas do protocolo de extração de DNA, ressaltando quais são as diferenças
entre a extração do DNA e RNA.
PRIMEIRA FASE – QUEBRA DA MEMBRANA
Pode ser feita de forma mecânica ao invés de utilizar o tampão de digestão, usando um pistilo, bastão ou
sonicador. Esta técnica apresenta uma vantagem: por ser mais rápida, diminui a chance de degradação
do RNA.
SONICADOR
Aparelho capaz de utilizar energia das ondas sonoras para agitar partículas.
SEGUNDA FASE – EXTRAÇÃO DO RNA
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Não são utilizadas as RNases. A solução de fenol/clorofórmio na extração de RNA deve ter pH ácido (entre
4,5 e 5,5) para que o RNA fique na fase aquosa e o DNA fique na interface (essa fase intermediária só é
formada durante a extração do RNA devido ao pH ácido).
TERCEIRA FASE – PURIFICAÇÃO DO RNA
É muito parecida com a do DNA, a diferença está no armazenamento: para RNA é preferível utilizar
nitrogênio líquido.
 
Fonte: EnsineMe.
EXTRAÇÃO DE DNA/RNA
1. Amostra inicial com as células digeridas
 
Fonte: EnsineMe.
ADIÇÃO DE SOLUÇÃO FENOL/CLOROFÓRMIO
2. Centrifugação da amostra, formando duas fases: orgânica (em amarelo no fundo do tubo) e aquosa (em
azul acima da fase orgânica). No tubo A temos DNA e RNA dissolvidos na fase aquosa e no tubo B o DNA
degradado fica na interface.
 
Fonte: EnsineMe.
3. A fase orgânica édescartada, permanecendo apenas a fase aquosa no tubo.
 
Fonte: EnsineMe.
ADIÇÃO DE ACETATO DE AMÔNIO E ETANOL ABSOLUTO
4. Após centrifugar, ocorre a formação de um pellet no fundo do tubo. Todo o líquido restante é descartado.
 
Fonte: EnsineMe.
5. O pellet é ressuspendido em tampão TE e agora o DNA ou RNA pode ser armazenado.
Assista ao vídeo abaixo e conheça a importância do DNA na Biologia Molecular, entendendo como o
material genético obtido será utilizado.
4 – ARMAZENAMENTO DO DNA E DO RNA
PURIFICADOS
Após o isolamento (purificação), o DNA e o RNA precisam receber cuidados imediatos. Para o DNA,
devemos armazená-lo em um tubo de plástico (preferencialmente de propileno) vedado a fim de evitar
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evaporação, hidrofóbico, em uma temperatura abaixo de 0°C. Dessa forma, diminuímos a atividade
biológica das DNases.
PLÁSTICO
O DNA tem afinidade por vidro, por isso o uso de tubos de plástico.
PROPILENO
Tipo de polímero que não interage com o DNA.
O DNA purificado é mantido em solução tampão tris-EDTA, com pH 7,2. A validade do DNA nestas
condições é bastante alta. Confira:
Temperatura ambiente Até 26 semanas
Temperaturas baixas de 2°C a 8°C 1 ano
Congelado a -20°C 7 anos
Congelado a -70°C +7 anos
 ATENÇÃO
O DNA purificado é bastante resistente, uma vez que a sua solução não contenha água, pois a água quando
congela forma cristais que podem danificar os materiais orgânicos.
Após a extração do RNA, ele deve ser armazenado como um precipitado em etanol a 70% congelado na
temperatura de -70°C. Alguns estudos mostram que após 2 meses, mantido na temperatura de -20°C, o
RNA não perde sua integridade. No entanto, é importante destacar que na temperatura de -20°C ainda
temos uma atividade RNases, sendo assim mais recomendado o congelamento em temperaturas de -70°C
ou inferior. Assim como no DNA, os tubos devem ser de plástico estéril e manuseados com luvas limpas
por uma solução de água com dietilpirocarbonato (composto capaz de eliminar RNases dos tubos) ou
então por tubos com garantia de serem RNase-free.
O etanol auxilia na precipitação do RNA, ajudando a concentrá-lo. Dessa forma, o RNA fica menos
suscetível a agentes degradantes.
5 – QUANTIFICAÇÃO, ANÁLISE DE PUREZA E
INTEGRIDADE DO MATERIAL MOLECULAR
A extração do DNA/RNA é sem nenhuma dúvida um dos processos mais importantes da Biologia
Molecular, pois esses materiais servem de matéria-prima para diversas outras técnicas da Biologia
Molecular, como a reação da cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento, clonagem, hibridização, entre
outras. Uma boa extração determina a qualidade do resultado dessas técnicas. O controle de qualidade da
extração é dado pela quantificação, pureza e integridade desses materiais.
Vamos entender melhor esses procedimentos?
 
Fonte: Rattiya Thongdumhyu/Shutterstock.com
QUANTIFICAÇÃO
Na quantificação determinamos a quantidade de DNA/RNA extraído da amostra inicial. A técnica mais
utilizada é a fluorometria. Nesta técnica, uma pequena alíquota da amostra é transferida para outro tubo,
onde é adicionada uma solução e um agente fluorescente capaz de se ligar entre as bases do DNA e RNA.
Quando o agente fluorescente (fluoróforo) se liga a algo (DNA ou RNA), ele emite fluorescência e assim
podemos medir, com ajuda de um aparelho (fluorímetro), a quantidade de fluorescência da amostra.
A quantidade de fluorescência da amostra é diretamente proporcional, ou seja, quanto maior for a
fluorescência, maior é a quantidade de DNA ou RNA.
Uma vantagem dessa técnica é que ela é simples e, após a quantificação, sabemos se temos a
quantidade de material suficiente para as próximas etapas. Além disso, podemos utilizar diferentes
agentes fluorescentes: um específico para DNA e outro específico para RNA. Assim, podemos quantificar o
quanto temos de cada um desses materiais moleculares.
 Quantificação do DNA fluorescente. Na foto temos o gráfico de duas amostras de DNA diferentes.
Tradução: dsDNA = double-strand DNA; A1=amostra 1; A2=amostra2. Fonte: Yurij
Kot/Wikimedia/Attribution-Share Alike 4.0 International
PUREZA
Na pureza podemos avaliar se um DNA ou RNA apresenta contaminantes. A pergunta aqui é: Será que
com o material extraído temos também fenol, álcool, proteínas, RNA (quando o desejo é DNA) e algum
reagente residual?
Para essa análise, a técnica mais utilizada é a espectrofotometria.
Antes de entender a técnica, é importante lembrar que luz visível é uma pequena parte de todo o espectro
de radiação eletromagnética existente, compreendendo comprimentos de onda entre 380-750 nm. Os
comprimentos de ondas inferiores estão na zona de espectro da ultravioleta (UV) e superiores na zona de
infravermelho. Quando uma luz branca passa por um prisma, ela se decompõe em raios de luz de
diferentes comprimentos de onda, variando do vermelho ao violeta. Em um arco-íris, por exemplo,
enxergamos 7 diferentes cores, cada uma dessas cores representa uma diferente faixa de comprimento de
onda.
 Comprimento de onda no espectro da luz. UV e infravermelho não são visíveis. Fonte:
Fulvio314/Wikimedia/Attribution-Share Alike 4.0 International
Além disso, é importante relembrar que todo o composto químico apresenta a capacidade de absorver,
transmitir ou refletir a luz em um determinado comprimento de onda.
Assim, a espectrofotometria tem como princípio básico utilizar a capacidade das moléculas orgânicas de
absorverem (absorbância) ou transmitir (transmitância) luz em determinado comprimento de onda, em um
equipamento chamado de espectrofotômetro.
A partir dela, podemos identificar os componentes em uma solução, pois as biomoléculas apresentam
espectros característicos ao UV, visível ou infravermelho. Por exemplo, já é estabelecido que as proteínas
absorvem comprimentos de onda de 280 nm; o RNA e DNA absorvem no comprimento de onda de 260 nm
e o fenol e outros constituintes no comprimento de onda de 230 nm.
 SAIBA MAIS
Além da possibilidade de indicar a biomolécula presente, podemos quantificá-la. Na prática, a quantidade de luz
absorvida é diretamente proporcional à concentração da substância, assim, quanto maior for a concentração,
maior é a absorção de luz (medido pela densidade óptica – OD).
Confira o passo a passo para a realização dessa técnica:
ETAPA 01
Primeiro, precisamos indicar para o aparelho onde nossa amostra está diluída em um procedimento
parecido com a tara da balança. Para isso, apenas o tampão usado na extração é colocado em uma
cubeta transparente e limpa e no aparelho ajustamos o comprimento de onda desejado.
ETAPA 02
Quando a luz incide na cubeta, apenas uma quantidade consegue ultrapassar a amostra e o aparelho
consegue quantificar a luz que é absorvida (absorbância) e isso gera um valor.
ETAPA 03
Como, nesse momento, apenas temos o tampão, informamos ao aparelho que esse é nosso controle e que
essa leitura não deve ser considerada, zerando o aparelho.
ETAPA 04
Em seguida, colocamos a amostra com o material purificado em outra cubeta transparente e limpa e
medimos a luz absorvida, que representa a quantidade da substância analisada.
 ATENÇÃO
Lembre-se de que isso depende do comprimento de onda que estamos pesquisando (280nm, 260nm ou
230nm)! Novamente, aqui, quanto maior for a absorção de luz, maior a quantidade de determinado material.
Na figura a seguir, vemos um resultado de uma análise espectrofotométrica, mostrando um pico de
absorção da luz no comprimento de onda 260 nm, o que indica a presença de DNA ou RNA.
 Resultado de uma análise de espectrofotometria. Fonte: Vossman/Wikimedia/Attribution-Share Alike
4.0 International
Com os resultados, podemos verificar a pureza a partir da razão (divisão) da densidade óptica (OD) no
comprimento de onda 260 nm pela OD no comprimento de onda 280 nm.
Dizemos que o material genético está puro quando essa relação é maior ou igual a 1,8. Valores inferiores a
esse indicam contaminação com proteínas e que o processo extrativo não foirealizado de forma correta.
Outra forma de verificar essa pureza seria pela razão entre a OD 260 nm OD 230 nm, com material
genético considerado puro quando estiver na faixa entre 1,8-2,2.
INTEGRIDADE
Integridade avalia se o DNA/RNA extraído está íntegro. Essa avaliação é feita a partir da técnica de
eletroforese. A eletroforese é uma técnica com uma enorme quantidade de variações e desdobramentos
e é utilizada para os mais variados objetivos. Aqui iremos nos ater ao princípio básico da técnica e a sua
aplicação no controle da integridade do material que foi extraído.
Esta técnica consiste na migração e separação de moléculas de acordo com a carga após a geração de
um campo elétrico. Ela utiliza diferentes meios de suporte, como fitas ou membranas de poliacetato de
celulose e géis de agarose, que apresentam poros por onde as moléculas devem passar.
 SAIBA MAIS
No nosso organismo, as moléculas apresentam diferentes cargas. O DNA/RNA, devido ao grupamento fosfato,
apresenta carga negativa. Além disso, as moléculas são separadas pelo tamanho.
Para isso, uma pequena quantidade de amostra é aplicada em um gel, geralmente a agarose, inerte (que
não reage com a amostra) em um poço (local de aplicação da amostra). Em seguida, é gerado um campo
elétrico onde um polo do gel fica com a carga negativa (local onde a amostra é aplicada) e outra positiva.
Como o DNA/RNA possui carga negativa, migrará para o polo positivo através do gel. No entanto, esse gel
apresenta poros, conferindo resistência ao movimento das moléculas. Assim, moléculas mais pesadas e
maiores ficarão presas no gel, enquanto as menores e mais leves migram com mais facilidade no gel.
 Esquema da eletroforese para DNA. Fonte: Cecierj.edu.
Após a eletroforese, podemos detectar o DNA/RNA pela coloração (normalmente é utilizado o brometo de
etídio, um corante que intercala no DNA) e visualização de bandas de DNA em um equipamento chamado
transiluminador. Se a amostra estiver íntegra, verificamos apenas uma marca (banda) intensa no gel de
eletroforese. No entanto, caso a nossa amostra esteja fragmentada, essa banda se apresenta “espalhada”
(arraste) ao longo do comprimento do gel, indicando que existem diversos fragmentos, ou seja, o
DNA/RNA não está íntegro.
 
Fonte: Shutterstock.com
BANDAS BEM DEFINIDAS
BANDAS COM ARRASTE
 Gel de eletroforese (DNA fragmentado). Fonte: Mohammed_Al_Ali/Shutterstock.com
6 – SÍNTESE DE CDNA
Como aprendemos anteriormente, existem várias técnicas na Biologia Molecular, PCR, sequenciamento,
clonagem e hibridização que são dependentes da matéria-prima (DNA, na maioria dos casos). Essas
técnicas podem ser utilizadas para diferentes fins, mas nem sempre a simples extração de DNA/RNA é
suficiente para analisar o que se deseja.
Vamos supor que queremos verificar se a expressão de uma proteína x está alta ou baixa nas células de
um tecido. Para isso, extraímos o DNA e o material purificado representa todo o DNA da célula, incluindo o
gene x, responsável pela expressão da proteína x. Entretanto, a detecção do gene x não indica muito sobre
a expressão da proteína, uma vez que não conseguimos saber se ele foi transcrito, se o splicing
alternativo gerou a proteína correta, se o RNAm foi devidamente processado. Neste caso, o ideal é avaliar
o RNAm, já processado, sem a presença de íntrons.
SPLICING ALTERNATIVO
Procedimento realizado pelas células para a maturação do RNA mensageiro (RNAm).
ÍNTRONS
Íntrons são trechos de RNA retirados do RNAm maduro durante o processamento do RNA.
Além disso, algumas técnicas utilizam apenas o DNA para realizar a amplificação e detecção, como PCR.
Por exemplo, queremos ver se uma pessoa tem uma infecção pelo novo coronavírus (Sars-CoV-2), um vírus
de RNA. Nesse caso, a amostra extraída é o RNA viral, mas é inviável a sua detecção, pois precisamos de
grandes quantidades de material, preferencialmente de DNA, por ser mais estável. Logo, o material
precisa ser multiplicado o suficiente para poder ser devidamente analisado. Para isso, usamos a técnica
do PCR, que consiste em amplificar uma amostra de DNA.
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Fonte: anyaivanova/Shutterstock.com
Então fica uma dúvida: como fazer essa análise, pois segundo o dogma central da Biologia, o DNA é
transcrito em RNA e o RNA é traduzido em proteína.
Essa questão foi resolvida por meio de outro vírus, o vírus da imunodeficiência humana (HIV), que
revolucionou a Biologia Molecular. Vamos entender como?
Este é um vírus de RNA, que após a penetração na célula alvo, injeta o RNA viral no citoplasma. Lá, uma
proteína do vírus chamada transcriptase reversa converte o RNA em DNA, esse DNA entra no núcleo e
outra proteína chamada integrase junta o DNA do vírus com o da célula-alvo. Agora, a célula-alvo é capaz
de transcrever o DNA viral (presente no genoma da célula hospedeira) em RNA viral, que forma outro vírus
de HIV, e assim continua o processo de infecção.
 COMENTÁRIO
Nesse processo, algo muito curioso acontece: a transcriptase reversa do vírus é capaz de alterar o dogma
central da Biologia, transformando o RNA em DNA.
E se usássemos essa polimerase na Biologia Molecular para gerar DNA a partir de, por exemplo, um RNA
mensageiro (RNAm)? E assim foi feito.
O DNA obtido a partir do RNA é chamado de cDNA (DNA complementar). Recebe esse nome pois é
complementar ao RNA molde.
A construção do cDNA é feita em um tubo contendo:
 
Fonte: LDarin/Shutterstock.com
1) RNA molde: é a sequência de RNA usada para a construção do cDNA.
2) Transcriptase reversa: é a polimerase capaz de transcrever o RNA em cDNA.
3) Nucleotídeos (A, T, C, G): são unidades funcionais para a síntese do cDNA.
4) Íon bivalente de magnésio (Mg2+): é um cofator essencial para o funcionamento da transcriptase reversa.
5) Primers: são pequenos fragmentos de DNA fita simples que se complementam ao RNA para dar início à
transcrição reversa.
6) DNA polimerase: responsável por sintetizar o DNA a partir dos nucleotídeos presentes.
A síntese do cDNA começa pelo anelamento do primer no RNA, seguido pelo acoplamento da
transcriptase reversa e início da sua atividade, formando o cDNA no sentido 5’ – 3’. Uma fez formado o
cDNA, o fragmento de RNA usado como molde é degradado pela RNAse H, um domínio do próprio
complexo da transcriptase reversa.
 Síntese do cDNA. Fonte: Lokeshthimmana/Wikimedia/Atribuição-CompartilhaIgual 4.0 Internacional
Durante a construção do cDNA, uma etapa crítica para termos um cDNA de boa qualidade é a construção
do primer. Existem três estratégias gerais de construção de primers:
OLIGO DT
É o primer formado por vários nucleotídeos do tipo timina que se anela a cauda poli-A do RNAm maduro.
Ele é preferencialmente utilizado quando queremos fazer cDNA de RNAm. Para o oligo dT é importante
que o RNAm esteja íntegro, uma vez que ele se anela na extremidade 3’ do molde. Se o RNAm estiver
fragmentado, o cDNA vai ser feito apenas de um pequeno trecho e talvez seja não funcional.
RANDÔMICO
Este primer é feito de pequenas sequências aleatórias que se anelam a qualquer RNA presente, incluindo
rRNA (RNA ribossomal) e tRNA (RNA transportador). Ele é indicado para amostras de sequência
desconhecida ou de difícil manipulação.
ESPECÍFICO
É o primer construído especificamente para um determinado RNA, sendo utilizado quando se tem um alvo
determinado, por exemplo, diagnosticar um RNA viral. O primer é desenhado de forma complementar ao
RNA viral. Por isso, ao término da reação, só teremos cDNA se o primer encontrar o seu RNA alvo. Para o
primer específico, é fundamental que toda a sequência do DNA/RNA seja conhecida.
CAUDA POLI-A
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A cauda tem esse nome por ser formada de 80 a 250 resíduos de adenina. A cauda serve para
proteger o RNAm de degradação enzimática durante todo o processo de locomoção em direção ao
ribossomo. A cauda poli-A é clivada por endonucleases quando o RNAm encontra o ribossomo.
 ATENÇÃO
É importante ressaltar que ostrês tipos de primers podem ser combinados, formando um primer com um trecho
oligo dT e outro trecho específico. Dessa forma, teremos uma transcrição da porção 3’ de um RNA molde
específico ou oligo dT com um randômico, para tentar formar cDNA de qualquer RNAm do material inicial. A
combinação de primers depende de criatividade do pesquisador e da sua capacidade de otimizar a síntese do
cDNA.
Neste ponto, temos então uma fita de cDNA íntegra, recém-formada pela transcriptase reversa e uma fita
de RNA ligada ao cDNA parcialmente degradada pela RNAse H. Assim, sintetizamos um RNAm maduro,
sem a presença de íntrons. Esses fragmentos de RNA serão utilizados como primers de iniciação pela
DNA polimerase que irá construir o DNA complementar ao cDNA.
Com isso temos finalmente a fita dupla de DNA formada.
 Formação da fita dupla de cDNA. Fonte: EnsineMe.
A construção de cDNA tem como funções principais:
Possibilitar a construção de uma biblioteca genômica, estabelecendo relações de quais genes
podem expressar quais proteínas, o que pode ser aplicado para elaboração de terapias, estudo de
espécies, doenças etc.
Possibilitar a amplificação de RNA pela PCR.
Determinar o nível de expressão gênica de uma determinada proteína no organismo.
O cDNA pode ser utilizado na clonagem, criação de bibliotecas, testes de microarranjo, detecção
de SNP etc.
CLONAGEM
Formação de novos trechos de DNA em outro indivíduo.
BIBLIOTECAS
São responsáveis por identificação e armazenamento de informação gênica.
MICROARRANJO
Serve como uma coleção de DNAs presos em uma superfície sólida, para estudos de genotipagem,
expressão, entre outros.
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SNPS
Do inglês Single Nucleotide Polymorphism, são variações pontuais encontradas ao longo do DNA,
isto é, são diferenças num único nucleotídeo.
VERIFICANDO O APRENDIZADO
1. VIMOS QUE EXISTEM DIFERENTES TÉCNICAS PARA AVALIAÇÃO DA
QUALIDADE DAS AMOSTRAS DE DNA E RNA OBTIDAS. ALÉM DISSO, VIMOS
QUE UMA DAS TÉCNICAS É A MAIS UTILIZADA PARA QUANTIFICAR AS
AMOSTRAS. SOBRE ESSE ASSUNTO, MARQUE A ALTERNATIVA CORRETA:
A) Espectrofotometria: conseguimos quantificar a partir do valor de luz refratada.
B) Eletroforese: quantificamos a partir do tamanho da banda final gerada.
C) Fluorometria: quantificamos a partir da intensidade da fluorescência.
D) PCR: quantificamos a partir da quantidade de DNA final gerado.
E) Precipitação em NaCl: quantificamos a partir do tamanho do pellet gerado.
2. A SÍNTESE DE CDNA É FUNDAMENTAL PARA DETERMINADAS ANÁLISES,
COMO MEDIR A EXPRESSÃO DE DETERMINADO GENE. COM BASE NO QUE
ESTUDAMOS, QUAL DOS ITENS ABAIXO NÃO É NECESSÁRIO PARA A
CONSTRUÇÃO DO CDNA?
A) Transcriptase reversa
B) Nucleotídeos
C) Solução de fenol/clorofórmio
D) RNA molde
E) Mg2+
GABARITO
1. Vimos que existem diferentes técnicas para avaliação da qualidade das amostras de DNA e
RNA obtidas. Além disso, vimos que uma das técnicas é a mais utilizada para quantificar as
amostras. Sobre esse assunto, marque a alternativa correta:
A alternativa "C " está correta.
 
A técnica mais utilizada para quantificação de amostras de RNA e DNA é a fluorometria, a partir da
detecção da fluorescência, podemos inclusive diferenciar o RNA e o DNA com essa técnica. Também
podemos usar a espectrofotometria, mas esta é limitada, uma vez que RNA e DNA se encontram na
mesma faixa de absorção de luz.
2. A síntese de cDNA é fundamental para determinadas análises, como medir a expressão de
determinado gene. Com base no que estudamos, qual dos itens abaixo não é necessário para a
construção do cDNA?
A alternativa "C " está correta.
 
Todos os itens citados são utilizados em algum momento na síntese do cDNA, com exceção da solução de
fenol/clorofórmio. Esta é utilizada na extração de DNA/RNA. A transcriptase reversa faz a fita de cDNA a
partir do RNA, os nucleotídeos são usados para a construção do cDNA, o RNA molde é o que queremos
usar para ter o DNA complementar e o Mg2+ é um cofator da reação da transcriptase reversa.
CONCLUSÃO
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Ao longo desta jornada, aprendemos que é possível usar o método científico para quase todas as ações do
nosso dia a dia. Vimos também que o desenho experimental é uma ramificação do método científico.
Visitamos todas as suas etapas, variáveis, hipóteses, erros e o tipo de amostragem que devemos utilizar
para chegar a uma conclusão confiável.
Com o desenho experimental em mente, partimos para as etapas pré-analíticas de transporte, coleta e
armazenamento do material biológico seguido da extração de DNA e RNA e o controle de qualidade do
purificado obtido.
Por fim, entendemos a importância do cDNA e a técnica de construção do cDNA. Esse foi, sem dúvida um
marco que possibilitou o aprofundamento de diversas técnicas da Biologia Molecular. Ao longo dos anos, a
Biologia Molecular está sendo desenovelada, mostrando a sua face e permitindo que você adentre ainda
mais em seus conceitos. Agora é com você continuar esta jornada!
AVALIAÇÃO DO TEMA:
REFERÊNCIAS
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blood cells. In: J Clin Microbiol, v. 39, p. 485-93, 2001.
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EXPLORE+
Para saber mais sobre os assuntos tratados neste tema, assista:
Ao vídeo Como é feito um TESTE DE DNA?
Ao vídeo Eletroforese horizontal de DNA em gel de agarose.
Leia:
Aprenda a fazer extração de DNA em casa, Hemocentro da FMRP-USP, e conheça a técnica de
extração utilizando cebola e materiais que temos dentro de casa.
O artigo Coleta, transporte e armazenamento de amostras para diagnóstico molecular, de Murilo
Rezende Melo e colaboradores (2010).
CONTEUDISTA
Eldio dos Santos
 CURRÍCULO LATTES
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