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Técnicas de Semeadura:
Isolamento de um Micro-organismo:
O isolamento visa a obtenção de uma cultura pura, composta por colônias isoladas de um
único micro-organismo, separando-o de outros presentes no material original.
Finalidades do Isolamento:
● Identificação do micro-organismo: A mera observação de características
morfológicas não é suficiente para a identificação e classificação de
micro-organismos. Para tal, diversas características são avaliadas, como:
○ Características bioquímicas
○ Características sorológicas
○ Características de patogenicidade
○ Entre outras
O estudo de tais características depende do micro-organismo que se pretende identificar.
Semeadura:
Consiste na inoculação ou plantio de um micro-organismo em um meio de cultura, a partir de
um material contaminado.
Repique:
Consiste na transferência de um micro-organismo de um meio de cultura para outro,
considerando-se:
● O esgotamento nutricional do meio original.
● O acúmulo de metabólitos tóxicos no meio.
● A dinâmica de crescimento bacteriano em sistema fechado.
Meios de Cultura:
Definição e Função:
Os meios de cultura são preparações nutritivas que fornecem as condições ideais para o
crescimento e desenvolvimento de micro-organismos em laboratório. São compostos por uma
base rica em nutrientes, como peptona, extrato de carne ou de levedura, e podem ser
solidificados com agar, gelificantes ou outros agentes.
Tipos de Meios de Cultura:
Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com sua consistência, finalidade e
composição.
1. Consistência:
● Sólidos: Possuem agar (1,5-2%) e permitem a formação de colônias visíveis a olho
nu, facilitando o isolamento e a identificação de diferentes micro-organismos.
Exemplos: Agar Mueller Hilton, Meio Salmonella-Shigella (SS), Agar Sangue, Agar
Chocolate.
● Semi-sólidos: Contêm 0,2 a 0,5% de agar e são usados para avaliar a motilidade
microbiana. Exemplo: Mobilidade Indol Ornitina (MIO).
● Líquidos (Caldos): Não possuem agente solidificante e servem para aumentar a
quantidade de microrganismos e realizar testes bioquímicos. Exemplo: Brain Heart
Infusion (BHI).
2. Finalidade:
● Transporte e Conservação:Mantêm a viabilidade dos micro-organismos durante o
transporte e armazenamento da amostra. Exemplo: Agar nutriente.
● Crescimento e Isolamento: Permitem o crescimento e a seleção de um único tipo de
micro-organismo a partir de uma amostra complexa. Exemplo: Agar chocolate.
● Identificação: Diferenciam espécies microbianas com base em características
específicas, como a fermentação de açúcares ou a produção de enzimas. Exemplo:
Agar tríplice açúcar ferro (TSI).
● Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos: Avaliam a suscetibilidade de um
micro-organismo a diferentes antibióticos. Exemplo: Agar Mueller Hilton.
3. Composição:
● Quimicamente Definidos: Formulação precisa com quantidades exatas de cada
componente. Úteis para estudos específicos e padronização de resultados.
● Complexos: Contêm ingredientes de composição desconhecida, como extratos de
carne ou de levedura. Mais utilizados em laboratórios de rotina pela praticidade e
menor custo.
Fatores Importantes na Escolha do Meio de Cultura:
● Tipo de micro-organismo a ser cultivado.
● Finalidade do cultivo: isolamento, identificação, teste de sensibilidade, etc.
● Características desejadas do meio: seletividade, diferencial, etc.
Classificação dos Meios de Cultura:
1. Quanto à sua Finalidade:
1.1. Meio Enriquecido:
● Definição: Caldo ou meio sólido com alto teor de nutrientes para promover o
crescimento de microrganismos exigentes.
● Preparo: Adição de nutrientes extras a um ágar nutriente.
● Exemplos:
○ Agar-sangue: Ágar nutriente + 5% de eritrócitos de carneiro (favorece o
crescimento de bactérias fastidiosas como Haemophilus influenzae e
Streptococcus pneumoniae).
○ Agar-chocolate: Ágar nutriente + hemoglobina em pó (favorece o crescimento
de Neisseria meningitidis e Haemophilus influenzae).
● Aplicações:
○ Cultivo de microrganismos com necessidades nutricionais complexas.
○ Isolamento de patógenos de amostras clínicas.
○ Estudos de patogenicidade microbiana.
1.2. Meio Seletivo:
● Definição: Permite o crescimento de um microrganismo de interesse enquanto inibe o
crescimento de outros.
● Mecanismo de ação: Inibição por:
○ Composição: Fatores específicos que impedem o crescimento de
microrganismos indesejáveis.
○ pH: Ajustado para favorecer ou desfavorecer o crescimento de diferentes
grupos de microrganismos.
○ Antibióticos: Adicionados para inibir o crescimento de bactérias específicas.
● Exemplos:
○ MacConkey: Inibe o crescimento de bactérias gram-positivas e permite o
crescimento de bactérias gram-negativas (fermentadoras de lactose: colônias
rosas; não fermentadoras: colônias incolores).
○ Agar Manitol Salgado: Permite o crescimento de bactérias que toleram
concentrações elevadas de sal (ex: Staphylococcus aureus).
○ Agar Thayer-Martin e Martin-Lewis:Seletivos para Neisseria gonorrhoeae
(ágar-chocolate + nutrientes extras + antimicrobianos).
● Aplicações:
○ Isolamento de microrganismos específicos de uma amostra complexa.
○ Diagnóstico de doenças infecciosas.
○ Controle de qualidade microbiológica em alimentos e água.
1.3. Meio Diferencial:
● Definição: Permite a distinção entre diferentes microrganismos que crescem no
mesmo meio.
● Mecanismo de ação: Diferenciação por:
○ Características de crescimento:Coloração, forma, textura, tamanho das
colônias.
○ Reações bioquímicas: Produção de enzimas, pigmentos, outros metabólitos.
● Exemplos:
○ Eosina Azul de Metileno (EMB):Diferencia entre Escherichia coli (colônias
verde-metálicas com brilho) e Enterococcus faecalis (colônias
marrom-acinzentadas).
○ Agar XLD: Diferencia entre Salmonella spp. (colônias pretas) e Shigella spp.
(colônias incolores).
Tipos de Meios de Cultura:
1. Ágar Sangue (AS):
● Composição: Rico em nutrientes, com adição de sangue (geralmente de carneiro ou
cavalo).
● Função:
○ Diferencial para a hemólise:
■ Hemólise beta: lise completa dos glóbulos vermelhos (halo
transparente).
■ Hemólise alfa: lise parcial (halo esverdeado).
■ Hemólise gama: ausência de lise (sem halo).
○ Permite o crescimento de diversos microrganismos:
■ Gram-positivos (Staphylococcus, Streptococcus, etc.).
■ Gram-negativos (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, etc.).
● Aplicações:
○ Diagnóstico de diferentes tipos de infecções bacterianas.
○ Estudo da capacidade hemolítica de microrganismos.
2. Ágar Chocolate (AC):
● Composição: Enriquecido com sangue cozido, peptona e outros nutrientes.
● Função:
○ Não seletivo, permite o crescimento de:
■ Bactérias aeróbias e facultativas (ex: Haemophilus, Neisseria).
○ Favorece o crescimento de microrganismos fastidiosos que exigem nutrientes
específicos.
● Aplicações:
○ Isolamento e identificação de bactérias exigentes, como Haemophilus
influenzae e Neisseria meningitidis.
○ Diagnóstico de doenças respiratórias, meningites e outras infecções.
3. Ágar MacConkey (MC):
● Composição: Contém sais biliares e cristal violeta que inibem o crescimento de
Gram-positivos.
● Função:
○ Seletivo para Gram-negativos:
■ Permite o crescimento de Escherichia coli, Salmonella spp., Klebsiella
pneumoniae, etc.
○ Diferencial para a fermentação da lactose:
■ Colônias lactose-positivas: cor avermelhada.
■ Colônias lactose-negativas: cor inalterada (transparente).
● Aplicações:
○ Diagnóstico de enterobactérias e outras bactérias Gram-negativas.
○ Diferenciação entre E. coli e outras enterobactérias.
○ Investigação de diarreias, infecções urinárias e outras doenças.
4. Ágar Salmonela-Shigella (SS):
● Composição: Contém lactose, sais biliares, verde de malaquita e tiosulfato de sódio.
● Função:
○ Seletivo para Salmonella e Shigella:
■ Inibe o crescimento de outras enterobactérias e Gram-positivos.
○ Diferencial para a utilização de lactose e produção de H2S:
■ Colônias lactose-positivas: cor rósea.
■ Colônias lactose-negativas: cor inalterada (transparente).
■ Produção de H2S: coloração negra.
● Aplicações:○ Isolamento e identificação de Salmonella spp. e Shigella spp.
○ Diagnóstico de salmonelose, shigelose e outras infecções entéricas.
5. Ágar Thayer Martin Modificado (TMM):
● Composição: Enriquecido com hemoglobina, suplementos de NAD e VCNT, além de
antibióticos para inibir a maioria das bactérias.
● Função:
○ Seletivo para Neisseria meningitidis e Neisseria gonorrhoeae:
■ Colistina, vancomicina e nistatina inibem o crescimento de
enterobactérias e Gram-positivos.
○ Permite o crescimento de N. meningitidis e N. gonorrhoeae, mesmo em
amostras com flora mista.
● Aplicações:
○ Isolamento e identificação de N. meningitidis e N. gonorrhoeae.
○ Diagnóstico de meningite meningocócica, gonorreia e outras infecções por
Neisseria spp.
Meio de Cultura Descrição Função Finalidade
Ágar Sangue (AS)
Rico, não seletivo, diferencial para
hemólise
Permite o crescimento da maioria
dos Gram positivos e Gram
negativos, com diferenciação pela
hemólise (beta, alfa ou gama)
Diagnóstico de diferentes tipos de
bactérias, incluindo estreptococos,
estafilococos e enterobactérias
Ágar Chocolate (AC) Rico, não seletivo
Permite o crescimento da grande
maioria das bactérias aeróbias e
facultativas, incluindo
Haemophilus, Neisseria,
Branhamella catarrhalis e
Moraxella
Diagnóstico de patógenos
respiratórios exigentes, como
Haemophilus influenzae e Neisseria
meningitidis
Ágar MacConkey (MC)
Seletivo para Gram negativos,
diferencial para lactose
Permite o crescimento de Gram
negativos, com diferenciação pela
fermentação da lactose (colônias
rosa) ou não fermentação (colônias
incolores)
Diagnóstico de enterobactérias, como
Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae e Salmonella spp.
Ágar Salmonela-Shigella (SS)
Seletivo para Salmonela e Shigella,
diferencial para lactose e H2S
Permite o crescimento de
Salmonella e Shigella, com
diferenciação pela fermentação da
lactose (coloração rósea) e produção
de H2S (coloração negra)
Diagnóstico de salmonelose e
shigelose
Ágar Thayer Martin Modificado
(TMM)
Seletivo para N. meningitidis e N.
gonorrhoeae, enriquecido
Permite o crescimento de N.
meningitidis e N. gonorrhoeae,
inibindo o crescimento de
enterobactérias e Gram positivos
Diagnóstico de meningococcemia e
gonorreia
Tipos de Técnicas de Semeadura:
1. Estria:
● Objetivo: Obtenção de crescimento bacteriano e/ou observação de propriedades
bioquímicas.
● Procedimento:
○ Semeadura geralmente da base para a extremidade do meio (estriamento).
○ Pode ser feita de forma uniforme.
● Aplicações:
○ Crescimento bacteriano.
○ Observação de funções metabólicas.
2. Picada:
● Objetivo: Observação de funções metabólicas de microrganismos (bactérias).
● Procedimento:
○ Inocular o microrganismo no centro do meio de cultura com agulha
bacteriológica.
● Aplicações:
○ Estudo de funções metabólicas.
3. Esgotamento:
● Objetivo: Obtenção de colônias isoladas para diferenciação de microrganismos.
● Procedimento:
○ Transferir o material com alça em movimentos de "zig-zag" pela superfície do
meio.
● Aplicações:
○ Isolamento de microrganismos.
○ Diferenciação por morfologia colonial.
4. Espalhamento em Placa:
● Objetivo: Obtenção de tapete uniforme (swab) ou colônias isoladas (alça de
Drigalski).
● Procedimento:
○ Espalhar o material (suspensão bacteriana) na superfície da placa.
● Aplicações:
○ Crescimento bacteriano uniforme.
○ Isolamento de microrganismos (com diluição).
5. Profundidade ou Incorporação (Pour-Plate):
● Objetivo: Contagem de microrganismos e isolamento de colônias.
● Procedimento:
○ Diluir a amostra em meio líquido.
○ Distribuir em placa de Petri.
○ Solidificar e incubar.
● Aplicações:
○ Contagem de microrganismos.
○ Isolamento de colônias.
6. Difusão:
● Objetivo: Observação de propriedades bioquímicas e crescimento bacteriano.
● Procedimento:
○ Adicionar microrganismos em meio líquido com alça ou agulha de platina.
● Aplicações:
○ Testes microbiológicos.
○ Enriquecimento de microrganismos.
7. Diluição:
● Objetivo: Quantificação de microrganismos.
● Procedimento:
○ Diluir a suspensão em série.
○ Semear amostras de cada diluição.
● Observação:
○ Utilizada apenas quando a semeadura em placas for inviável.
Técnica Objetivo Procedimento Aplicações
Estria Crescimento bacteriano e
propriedades bioquímicas
Semeadura da base para a
extremidade do meio
Crescimento e funções
metabólicas
Picada Funções metabólicas Inocular no centro do
meio
Estudo de funções
metabólicas
Esgotamento Isolamento de
microrganismos
Transferir o material em
"zig-zag"
Isolamento e
diferenciação
Espalhamento em Placa Tapete uniforme ou
colônias isoladas
Espalhar o material na
superfície da placa
Crescimento uniforme ou
isolamento
Profundidade/Incorporaçã
o
Contagem e isolamento Diluir, distribuir,
solidificar e incubar
Contagem e isolamento
Difusão Propriedades bioquímicas
e crescimento
Adicionar
microrganismos em meio
líquido
Testes microbiológicos e
enriquecimento
Diluição Quantificação Diluir em série e semear Quantificação de
microrganismos