Aula Prática 3- Eletroforese (3)

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ELETROFORESE
EM GEL
Aula Prática 03 - Biologia Geral e Aplicada II
Professora: Dra. Maria Bernadete Amâncio Varesche
Técnica: Juliana Custódio
Monitores: Camila A. Menezes
 Caroline F. Granatto
 Danilo H.D. Rocha
	 Marina M. Gomes
 Vitor A. Lourenço 
O QUE É ELETROFORESE?
A eletroforese é uma TÉCNICA DE SEPARAÇÃO de moléculas
O princípio da técnica é a aplicação de um campo elétrico para promover a migração de moléculas, que apresentem carga elétrica, através de uma matriz (gel polimérico) responsável pela separação das moléculas de acordo com o seu tamanho.
POR QUE UTILIZAR?
EXTRAÇÃO DE DNA
ELETROFORESE
CENTRIFUGAÇÃO DE AMOSTRAS DE SANGUE
OBTENÇÃO DE FRAGMENTOS ISOLADOS DE ÁCIDOS NUCLÉICOS E DE PROTEÍNAS
APLICAÇÕES
A eletroforese é utilizada em inúmeros processos de biologia molecular e análises clínicas, entre eles:
Ciência forense: para comparar o DNA encontrado no local do crime com o de suspeitos;
Genética: teste de paternidade, diferenciação de espécies e engenharia genética;
APLICAÇÕES
Indústria alimentícea: detecção de fraudes em alimentos de origem animal;
Microbiologia ambiental: detecção de bactérias e fungos e avaliação da diversidade de populações;
Microbiologia aplicada à saúde: diagnóstico e prognóstico de doenças, sexagem fetal e diagnóstico pré-natal e testes de respostas à medicamentos;
APARATO EXPERIMENTAL PARA ELETROFORESE
Tempo de corrida : tempo em que ocorre a separação de moléculas por eletroforese
Solução tampão
SEPARAÇÃO DE PROTEÍNAS E ÁCIDOS NUCLÉICOS
Pólo positivo (+)
Pólo negativo (-)
AMOSTRA
AMOSTRA
PROTEÍNAS
DNA
Daltons (Da)
FATORES QUE INFLUENCIAM A MIGRAÇÃO DO DNA NO GEL
 A carga elétrica negativa devido ao grupo fosfato; 
Tamanho da molécula de DNA: o DNA migra em uma taxa inversamente proporcional ao número de pb (pares de base);
Voltagem aplicada, concentração do gel e tampão;
 
GEL POLIMÉRICO
 Meio sólido onde ocorre a separação das biomoléculas, constituído por agarose ou poliacrilamida; 
A escolha do tipo de matriz depende do tamanho de fragmentos que se deseja separar: 
Gel de agarose utilizado para fragmentos de 0,1-50 kb 
Gel de poliacrilamida para fragmentos de até 1kb
Quanto maior a concentração, menores serão os poros da malha e maior será a resolução do gel;
 GEL DE AGAROSE
Agarose: derivado do ágar, é um polímero linear composto por L-galactose e D-galactose
Não-tóxico, rápido e fácil de preparar!!
 Após o aquecimento, filamentos de agarose formam a matriz para separação do DNA;
Separação de fragmentos de 100 pb a 50000 pb; 
Sensibilidade baixa: em uma mesma banda pode haver fragmentos de tamanhos muito diferentes 100 a 3000 pb
 GEL DE AGAROSE
GEL DE AGAROSE
1 kb  1000 pb
GEL DE POLIACRILAMIDA
Poliacrilamida : rede polimérica formada pela reação entre acrimalida e bisacrilamida;
GEL DE POLIACRILAMIDA
Melhor resolução do que o gel de agarose: podem ser separados fragmentos de DNA com 1 pb (par de base) de diferença; 
Mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500pb);
Mais trabalhoso e a acrilamida é neurotóxica !!!
 
Agarose
Poliacrilamida
1909
Michaelis observou movimentação de proteínas com a aplicação de campo elétrico
1949 
Linus Pauling e colaboradores publicaram na revista Science o fracionamento eletroforese da hemoglobulina S em papel de filtro 
1953
Willians e Grabar utilizaram gel de ágar para separação de proteínas. Foi publicada a estrutura do DNA por Watson e Crick
1959
Elaboração do gel de acrimalida, que posteriormente foi aprimorado 
1937 
Arne Tiselius relatou o fracionamento de proteínas por eletroforese em meio líquido, método introduzido ao diagnóstico clínico.
1970
Padronização e industrialização do gel de agarose, permitindo incluí-lo na rotina laboratorial para amostras de sangue, soro, hemolisado e ácidos nucléicos 
BREVE HISTÓRICO DA ELETROFORESE
 
ETAPAS
Preparação do gel;
Adição do tampão de corrida na cuba; 
Preparação e aplicação da amostra; 
Corrida; 
Fotodocumentação e análise 
ETAPAS: PREPARAÇÃO DO GEL
1- Aqueça uma solução de tampão TA (ou tampão Borax) com 0,8% de agarose até que a agarose esteja totalmente fundida. Geralmente um minuto de fervura é o suficiente. Pode-se observar que houve fusão total pelo fato de não mais existir grumos no líquido.
ETAPAS: PREPARAÇÃO DO GEL
2- Transfira a solução de agarose ainda quente para a forma de gel. Certifique-se de que o pente (régua) com os dentes que formarão os pocinhos no gel está bem posicionado. Cuide para que os dentes da régua não toquem o fundo da forma, pois é necessário que fique agarose no fundo do pocinho (caso contrário, o pocinho ficará furado e a amostra sairá do gel).
3- Depois que o gel endurecer, descole-o com cuidado da forma e remova-o, com a ajuda de uma espátula, para a cuba de eletroforese. Tenha o cuidado de colocar os pocinhos do gel (ponto de aplicação das amostras) para o lado em que vai ser ligado o eletrodo negativo. Cubra o gel com 2 a 3 cm de tampão TA.
ETAPAS: ADIÇÃO DO TAMPÃO
Função da solução tampão TA:
1- Equilibrar o pH do sistema
2- Promover a passagem de corrente elétrica, já que o gel é mau condutor elétrico
ETAPAS: APLICAÇÃO DA AMOSTRA E CORRIDA
Padrão
Amostra 1 
Amostra 2 
Pólo Negativo (-)
Pólo Positivo (+)
1200 pb
200 pb
1000 pb
600 pb
800 pb
400 pb
“Peneira molecular” = separação da molécula por tamanho
 4- Com a ajuda de uma micropipeta ou uma seringa de insulina aplique as amostras até encher cada pocinho. 
5 - Depois de aplicadas as amostras, ligue a corrente elétrica.
Moléculas maiores
Moléculas menores
Eletroforese em Gel
ETAPAS: FOTODOCUMENTAÇÃO E ANÁLISE
 Aplicação do corante Brometo de etídio (no gel, tampão ou após a corrida);
 Transluminador de UV
ATIVIDADE PRÁTICA:
ELETROFORESE EM CORANTES DE BOLO
Cores Primárias
Cores Secundárias = Mistura de duas cores primárias
ATIVIDADE PRÁTICA:
ELETROFORESE EM CORANTES DE BOLO
	COR	VERMELHO	AZUL	AMARELO	PRETO	VERDE
	Nome comercial 	amaranto	azul brilhante	tartrazina	Amaranto + azul brilhante + tartrazina	tartrazina 
+ azul brilhante
	Fórmula	C20H11N2Na3O10S3	C37H34N2Na2O9S3	C16H9N4Na3O9S2	-	-
	Massa molar	604,46361	792,84314	534,35781	-	-
Corantes de bolo apresentam carga elétrica negativa em pH básico !!
1. Gel solidificado na cuba com destaque nos pocinhos (slots) formados.
2. À esquerda, retirada da amostra da tampa do frasco com a seringa. Ao centro, aplicação da amostra no gel e à direita, lavagem da seringa antes de aplicar outra amostra. 
3. Adição da solução tampão na cuba. A adição da solução na cuba deve ser executada lentamente para evitar que as amostras (corantes) se misturem com a solução tampão, se difundindo fora dos slots do gel. 
4. Corrida eletroforética com corantes. A figura da esquerda mostra o início da corrida eletroforética. No lado direito, o gel após 30 min de corrida, onde podemos observar a separação dos pigmentos constituintes do corante preto (slot de cima), corante vermelho (slot do meio) e corante azul (slot de baixo).
O corante vermelho possui menor peso molecular comparado ao amarelo e azul !!
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Desenvolvimento de um kit didático de eletroforese para o ensino prático de Biologia Molecular na educação básica e superior. Disponível em: https://www.researchgate.net/publication/320342544_Desenvolvimento_de_um_kit_didatico_de_eletroforese_para_o_ensino_pratico_de_Biologia_Molecular_na_educacao_basica_e_superior (acesso em 28/09/20).
LORETO, E. L. S. e SEPEL, L. M. N. Atividades Experimentais e Didáticas de Biologia Molecular e Celular. 2a Ed., Sociedade Brasileira de Genética. Ribeirão Preto. SP. 81p., 2003b.
NAOUM, P.C. Eletroforeses- Hemoglobinopatias, protéinas séricas, lipoproteínas e DNA. Disponível em: http://www.ciencianews.com.br/arquivos/ACET/IMAGENS/livros/acesso_gratuito/Livro_completo%20-%20Eletroforese.pdf (Acesso em: 28/09/20). 
VÍDEOS
https://www.youtube.com/watch?v=vL3EfRx78P0https://www.youtube.com/watch?v=dLsBVRwpFEE
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-electrophoresis/v/gel-electrophoresis-dna
https://www.youtube.com/watch?v=G3nluTRu6xk
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