Apresentação Coliformes totais e termotolerantes

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COLIFORMES TOTAIS E
TERMOTOLERANTES
AMOSTRAGEM
No recebimento de produtos, o laboratório deve conduzir uma avaliação
inicial para verificar as condições dos itens e determinar a quantidade e o
estado da amostra. Todos os produtos recebidos devem ser devidamente
registrados, permitindo que a análise seja monitorada através de relatórios.
As informações necessárias para registro incluem o nome do produto, data
de recebimento, dados das amostras, origem e o nome da parte
solicitante, juntamente com o tipo de análise a ser realizada.
AMOSTRAGEM
Coletar e preparar as amostras é essencial para análise microbiológica. Como ela
deve ser feita?
•Registrar informações detalhadas sobre as amostras, incluindo origem e
condições;
•Manter amostras na temperatura adequada e evitar mudanças abruptas de
temperatura;
•Realizar assepsia de materiais, equipamentos e ambiente para prevenir
contaminação;
•Pesar as amostras dentro de 45 minutos após o preparo para manter a qualidade
da análise.
PREPARO E SEMEADURA DAS AMOSTRAS
PREPARO E SEMEADURA DAS AMOSTRAS
Ao preparar a amostra, deve-se determinar as características do meio de cultura, como grau de pureza, se o
meio será líquido, sólido ou semi-sólido e o tipo de nutrientes/ágar que será utilizado.
Todo o equipamento utilizado no processo de preparo do meio deve ser devidamente esterilizado. A água
utilizada na lavagem dessas ferramentas não deve conter substâncias que favoreçam ou inibam o
crescimento de microrganismos.
A esterilização do meio de cultura e dos reagentes deve ser feita utilizando calor úmido (autoclave), irradiação
por raios gama/raios-x ou por filtração.
Com o meio pronto e a esterilização feita, deve-se fazer a pesagem em balança, buscando valores o mais
específicos possíveis, já que pequenas alterações podem alterar a forma como o microrganismos se
desenvolverá.
O peso deve ser registrado e o recipiente em que se encontra o meio deve ser rotulado antes de ser
armazenado em local hermético e longe de luz direta.
Todos os meios antes do uso devem ser levados à temperatura ambiente, mas quando utilizados, devem ser
armazenados em temperatura de 2 a 8 graus Célsius.
SEMEADURA DE COLIFORMES TOTAIS E FECAIS
(TERMOTOLERANTES) - ESCHERICHIA COLI
Na preparação da amostra, é essencial garantir que todos os materiais e equipamentos utilizados se encontrem devidamente esterilizados, e que sejam
empregadas técnicas assépticas para evitar a contaminação.
Em seguida é feita a preparação do enriquecimento, o qual consiste em uma amostra de, no mínimo, 1 grama (ou 1 mililitro) do produto a ser analisado,
devidamente homogeneizado. Essa amostra é então dispersa em, no mínimo, 9 mililitros do caldo de enriquecimento. 
Feito isto, é importante fazer uso de um agente solubilizante apropriado para a amostra, sempre monitorando o tempo decorrido entre a inoculação desse
agente e o momento em que ele entra em contato com o caldo de enriquecimento. É crucial observar que o processo de preparação não deve ultrapassar
45 minutos.
As colônias de E. coli geralmente apresentam cor vermelho-tijolo em Ágar MacConkey. A coloração de Gram também permite que sejam observados
bastonetes Gram-negativos, sendo este mais um indício da existência de E. coli no meio. A preparação inicial nesse meio deve ser incubada em caldo em
temperaturas de 32,5 ºC ± 2,5ºC por no mínimo 20h (máximo 72h).
Deve-se estriar uma parcela do caldo de enriquecimento incubado (utilizando alça estéril) sobre a superfície de meio de semeadura, de modo a obter
colônias isoladas para facilitar a visualização. Passado o período de preparação inicial, inverter as placas de Petri e incubar a temperaturas de 32,5 ºC ±
2,5ºC por no mínimo 24h (máximo 48h). Também é possível utilizar o meio Agar Levine eosina azul de metileno (Ágar EMB).
Se for confirmado que as colônias pertencem à E. coli, na documentação deve-se expressar o resultado como: “Presença de Escherichia coli na amostra”,
caso contrário o resultado deve ser expresso como: “Ausência de Escherichia coli na amostra”.
Fonte: ANVISA
IMAGEM 1 –
ESCHERICHIA
COLI EM ÁGAR
MACCONKEY
Dois tipos: plaqueamento por profundidade e semeadura em superfície.
Plaqueamento por profundidade envolve adicionar amostra diluída em meio sólido.
Utilizar técnicas assépticas durante o preparo!
Plaqueamento em superfície requer a distribuição da amostra diluída sobre meio sólido.
TIPOS DE
PLAQUEAMENTO
•Utilizar diluição contada.
•Misturar a amostra com meio de cultura.
•Após a incubação, contar as colônias em placas.
•Calcular o resultado em Unidades Formadoras de Colônias (UFC) por
grama ou mililitro.
•Registrar os resultados apropriadamente.
CONTAGEM EM
PLACA
 Coliformes são grupos de bactérias indicadoras de contaminação
e são formados pelos gêneros Escherichia, Citrobacter,
Enterobacter e Klebsiella (família Enterobacteriaceae).
 Eles são encontrados naturalmente no meio ambiente como no
solo, na água e nos dejetos humanos ou de animais. A sua presença
por si só não implica que a água/alimento esteja comprometida,
mas pode indicar a presença de bactérias potencialmente
patogênicas.
 São capazes de fermentar a lactose com produção de gás,
quando incubados a 35-37° por 48h.
COLIFORMES TOTAIS
 Os coliformes termotolerantes estão presentes especificamente
no intestino e nas fezes de animais de sangue quente e são
considerados uma indicação de contaminação de fezes. Fazem
parte desse grupo os gêneros Enterobacter e Klebsiella (origem não
fecal) e a cepa patogênica de origem fecal, Escherichia coli, que é o
principal indicativo.
 São capazes de fermentar a lactose em 24 horas a temperaturas
mais altas, entre 44,5 e 45,5°C
COLIFORMES TERMOTOLERANTES
As principais cepas patogênicas de E. coli possuem os seguintes grupos: 
E. coli enterotoxigênica (ETEC);
E. coli enteropatogênica (EPEC);
E. coli enteroinvasiva (EIEC);
E. coli enteroagregativa (EAEC);
E. coli difusamente aderente (DAEC);
E. coli produtora verotoxina (VTEC).
CEPAS PATOGÊNICAS DA E. COLI
 O método do substrato cromogênico define como coliformes totais bactérias na forma
de bastonetes, gram negativas, não formadoras de esporos, aeróbias ou anaeróbias
facultativas, são reconhecidos como coliformes totais que alteram a coloração do meio. São
uma alternativa mais rápida do que o método tradicional de plaqueamento. O resultado para
Escherichia coli é positivo quando as cavidades positivas apresentam além da
coloração amarela, fluorescência azul sob luz ultravioleta. O número total de coliformes
é o número total de colônias vermelhas e azuis combinadas.
COMO IDENTIFICAR OS COLIFORMES?
USO DA TABELA DE NÚMERO MAIS
PROVÁVEL (NMP): 
 Para o uso da tabela de número mais provável (NMP) , usa-se a técnica de Tubos Múltiplos para a análise
de coliformes totais ou termotolerantes (E. coli) em 100ml de água (NMP/100 ml). A metodologia permite a
quantificação por “número mais provável” de microrganismos presentes na amostra de água e alimentos baseado
na frequência de resultados positivos.
 Assim, podem ser analisadas na obtenção de informação sobre a população presuntiva de coliformes (teste
presuntivo) ,sobre a população de coliformes totais (teste confirmatório) e sobre a população de coliformes
termotolerantes/origem fecal. 
 
MÉTODO PRESUNTIVO 
•Positivos: reação ácida (amarelado) ou aprisionamento
de bolhas
•Caldo Lauril de sulfato de sódio 
•35°C
•1 a 2 dias
MÉTODO CONFIRMATÓRIO
•Espécies de bactérias: E.coli,
enterobacter etc
•Mesmo princípio 
•Caldo verde brilhante
MÉTODO COMPLEMENTAR 
•1 dia máximo 
•Banho Maria ou tubos variados 
•Caldo com E.coli
•44,5°C
Obrigado.