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Imunologia Clínica Diagnóstico laboratorial em imunologia: PCR e VHS Prof. Ms. Flávia Soares Lassie Determinar a velocidade de hemossedimentação (VHS); Determinar a Proteína C- reativa, através da aglutinação de partículas de látex; Conhecer os critérios de biossegurança para o descarte. Determinação da Proteína C-Reativa por Aglutinação em Látex Proteína C reativa (PCR) É uma das proteínas de fase aguda (PFA); PFA: são aquelas cuja [ ] sérica aumenta ou diminui pelo menos 25% durante os processos inflamatórios; Os testes baseados em dosagens de PFA: VHS e PCR; VHS: velocidade com que os eritrócitos se sedimentam no plasma: depende da [fibrinogênio]; Influenciada pela forma, tamanho e nº de eritrócitos, além da presença das imunoglobulinas; Descoberta em 1930: reagia com o polissacarídeo- C dos pneumococos na fase aguda da infecção; Dosagem de PCR: medida direta de PFA – inflamação [ ] séricas alteram-se rapidamente; Variação mais ampla que o VHS; Casos de pós-operatórios tem maior sensibilidade do que: elevação do VHS, leucócitos, frequência cardíaca e febre; Utilizado para a pesquisa de inflamação sem distinguir com precisão a etiologia; Aumentam os níveis em casos: inflamação, infecção, inflamação sistêmica para AR, IAM, pancreatite necrotizante, politraumas, neoplasias, vasculite. Proteína C reativa (PCR) Não sofre interferência: anemia, hipergamaglobulinemia. Monitoram a evolução das doenças infecciosas, autoimunes e outras. Dinâmica da PCR Secreção predominantemente hepática: 4 a 6 horas após o estímulo – Duplica a cada 8 horas e atinge o pico entre 36 e 50 horas. ½ vida plasmática: 19 horas Leva alguns dias para atingir níveis basais: Dosagens seriadas ao longo de vários dias 1 2 3 4 5 6 Indicações clínicas e limitações de uso da PCR AGUIAR, J.B. et. al. Proteína C reativa: aplicações clínicas e propostas para utilização racional. Disponível em: https://www.scielo.br/pdf/ramb/v59n1/v59n1a16.pdf acesso fev. 2022 Monitoramento de doenças reumatológicas; Não existe um único teste ideal para detectar inflamação: múltiplas dosagens de PCR e VHS. Teste de aglutinação Reação de Aglutinação Caracteriza-se pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos em sua superfície. Antígeno Anticorpo (aglutinina) Fonte: https://binged.it/3doJFlN acesso fev. 2022 AGLUTINAÇÃO INDIRETA Antígeno solúvel associado a outras superfícies+ Anticorpo específico Partículas de látex ou superfície de hemácias Fonte: http://bit.ly/3pvpPHQ acesso fev. 2022 A- Teste de aglutinação positivo para anticorpos B- Teste de aglutinação positivo para antígenos PCR-Látex Finalidade: reagentes para a determinação qualitativa e semiquantitativa da PCR no soro; Princípio: aglutinação das partículas de látex sensibilizadas com anticorpos anti-PCR humana (antígeno) quando misturada com soro de pacientes contendo uma [PCR ] ≥ 6 mg/L; Amostra utilizada: soro (sem hemólise ou lipemia). Método qualitativo 50 uL CN 50 uL CP 50 uL Amostra 50 uL Reagente do Látex PCR Fonte: VEIGA, A.P.M. et. al. Utilização de técnica rápida de aglutinação em látex para determinação semiquantitativa dos níveis séricos de proteína C reativa em cães. Disponível: Acta Scientiae Veterinariae acesso fev. 2022 Método semiquantitativo maior diluição do soro que apresenta aglutinação visível. Portanto é a quantidade mínima de anticorpo necessário para formar os aglutinados Fonte: https://binged.it/2N7buVe acesso fev. 2021 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL Descarta 0,5 mL 1 mL 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 Vf= 0,5 mL por tubo 7 8 9 10 11 12 Método semiquantativo 50 uL CN 50 uL CP 50 uL de cada diluição da amostra PCR + 50 uL Reagente do Látex PCR Fonte: VEIGA, A.P.M. et. al. Utilização de técnica rápida de aglutinação em látex para determinação semiquantitativa dos níveis séricos de proteína C reativa em cães. Disponível: Acta Scientiae Veterinariae acesso fev. 2021 Método semiquantitativo Amostra não reagente: expressar o resultado como < 6 UI/mL; Amostra reagente: Expressar o resultado em UI/mL; UI/mL: sensibilidade do teste X título encontrado no método semiquantitativo – Ex: Maior Título encontrado 1/16 UI/mL= 6 x 16= 96 mg/L Valor de referência: PCR < 6 mg/L Determinação de PCR Velocidade de hemossedimentação (VHS) Velocidade de hemossedimentação (VHS) Técnica de referência para determinação: Westergren; O exame consiste em colocar sangue humano em uma pipeta de Westergren fixada em um suporte próprio; Realiza a leitura passada 1 hora do início do teste para verificar a sedimentação eritrocitária. Velocidade de hemossedimentação (VHS) Sangue colhido com anticoagulante Plasma se deposita na parte superior Eritrócitos sedimentam Eritrossedimentação VHS A amostra de sangue deve ser mantida na vertical e permaneça em repouso pelo menos durante 1 hora; Leitura: altura da coluna de plasma (mm/h). Fonte: http://binged.it/2ZnASbz acesso fev. 2022 Fonte: http://binged.it/3qESDPu acesso fev. 2022 13 14 15 16 17 18 VHS VHS Sua variação é, quase sempre, sinal de alteração orgânica ou de enfermidade Amplamente empregado Artrite reumatoide Polimialgia reumática Linfomas LES Tuberculose Processos inflamatórios, infecciosos e neoplásicos. Eritrossedimentação- Mecanismo Fonte: Atlas de hematologia UFG. Disponível em http://bit.ly/2NyVjQk acesso fev.2022 Hemácias em rouleaux Acontece pela agregação de hemácias e consequente formação de rouleaux A formação em rouleaux é limitada pela carga negativa dos eritrócitos, que se repelem e não se agregam Essa força repulsiva eletrostática, chamada potencial zeta é produzido por uma intensa carga negativa em nível da superfície dos eritrócitos, em decorrência da sua riqueza em ácido siálicos, o que explica porque estas células se mantêm separadas. VHS A velocidade com que as hemácias sedimentam no tubo depende do dos seguintes fatores: 1. Volume e forma dos eritrócitos e das proteínas do plasma; 2. Diferença de densidade entre os eritrócitos e o plasma; 3. Viscosidade do plasma influenciado por proteínas plasmáticas: fibrinogênio, β- globulina, α e γ- globulinas e albumina; 4. Temperatura. VHS Fatores que reduzem a sedimentação: rigidez e alterações morfológicas celulares; Fatores que aumentam o VHS: hemodiluição, presença de proteínas plasmáticas assimétricas e de alto peso molecular reduz o potencial zeta e facilita a formação de rouleaux VHS Potencial zeta VHS Potencial zeta Fibrinogênio> alfa globulina>gamaglobulina Albumina > lecitina VHS: valores e variação normal Fatores fisiológicos que podem aumentar VHS: menstruação, gravidez e envelhecimento FAIXA ETÁRIA VALORES DE REFERÊNCIA (em 60 min) Criança DE 0 a 10 mm Adulto até 50 anos HOMEM: DE 0 a 15 mm MULHER: DE 0 a 20 mm Adulto acima de 50 anos HOMEM: DE 0 a 20 mm MULHER: DE 0 a 30 mm 19 20 21 22 23 24 Indicações do VHS Processos infecciosos, inflamatórios ou neoplásicos; Inespecífico porém indispensável na investigação e acompanhamento de artrite ou de polimialgia reumática; Normalização do VHS: marcador de boa resposta ao tratamento de doenças subagudas e crônicas (tuberculose, endocardite, mieloma múltiplo, linfomas e doenças reumáticas, alguns tipos de neoplasias. Fonte: autor Aumento anormal do VHS SANTOS, V.M. et. al. Velocidade de hemossedimentação. Disponível em: https://www.scielo.br/pdf/ramb/v46n3/3082.pdf acesso fev. 2021 Reumatologia o VHS é útil: avaliação da presença de atividade e resposta terapêutica em pacientes com AR, LES, vasculites.... VHS Influenciada pelos níveis séricos de fibrinogênio, imunoglobulinas e de proteínas de fase aguda; Deve ser utilizado apenas como auxiliar no diagnóstico, tratamento e acompanhamento de diversascondições clínicas; Valores acima de 100 mm/h: indicam doença sistêmica grave – infecções crônicas, neoplasias, doenças autoimunes. 25 26 27
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