Exames Imunológicos ou Sorológicos

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Exames Imunológicos ou Sorológicos 
(sem automação) 
Exames Sorológicos 
São exames que se destinam à pesquisa de anticorpos 
no soro ou plasma de pacientes. 
Objetivo 
Diagnosticar, indiretamente, através de pesquisa de 
anticorpos, casos de doenças ou infecções em que os 
agentes etiológicos não são capazes de crescer em meios 
de cultura artificiais (exemplo vírus, bactéria da sífilis, 
etc). 
SORO X PLASMA 
→ Soro: Proveniente de sangue coletado SEM 
anticoagulante, espontaneamente ou após 
centrifugação. Foi gasto o fibrinogênio no processo 
de coagulação do sangue. 
→ Plasma: Proveniente de sangue coletado COM 
anticoagulante, espontaneamente ou após 
centrifugação. Mantém o fibrinogênio 
EXAMES SOROLÓGICOS 
Princípio: reações de aglutinação 
1. PCR (proteína C reativa) 
• Esta proteína possui atividade anti-inflamatória e 
ajuda o sistema imunológico a combater germes 
invasores. 
• A PCR é produzida no fígado e se encontra 
elevada no soro de pacientes em casos de 
inflamação ou infecção, inclusive, infartos do 
miocárdio (PCR ULTRASENSÍVEL) 
• Eleva-se rapidamente após o estímumlo 
inflamatório (4-6 horas). Pico em 24-72 horas 
• Na ausência de estímulo inflamatório crônico 
normaliza-se em 3-4 dias. 
• É inespecífico, isto é, não especifica a doença em 
questão. 
Fundamento do exame: 
Reação de aglutinação, utilizando partículas ou esfera 
de látex recobertas com anticorpos anti-proteína C 
reativa. 
LÁTEX: partícula inerte 
• As partículas de látex ou hemácias usadas como 
suporte nas reações imunológicas promovem reações 
de AGLUTINAÇÃO, facilitando a visualização da 
reação. 
 
• Reações de aglutinação são aquelas em que o 
antígeno é particulado 
• Reações de precipitação são aquelas em que o 
antígeno é líquido. 
Kit de laboratório para PCR 
Controle positivo: soro sabidamente positivo 
Controle negativo: soro sabidamente negativo 
Etapas de realização dos exames 
1. Colocar controle positivo e controle negativo 
no primeiro e segundo poços; 
2. Pipeta o soro dos pacientes nos demais poços; 
3. Adiciona-se o reagente do PCR sobre todos os 
soros; 
4. Homogeneiza; 
5. Leitura: Resultado + (com grumos) e neg (sem 
Grumos). 
 
→ AS REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO E 
PRECIPITAÇÃO SÓ OCORREM QUANDO AS 
QUANTIDADES DE ANTÍGENO E 
ANTICORPO SÃO EQUIVALENTES. 
→ DAÍ A IMPORTÂNCIA DE PIPETAR OS 
REAGENTES NA QUANTIDADE 
DETERMINADA NAS BULAS DOS KITS 
LABORATORIAIS 
Equivalência entre anticorpos e antígeno 
Temos antígenos e seus respectivos anticorpos nesses 
tubos, mas só onde houver equivalência de anticorpos e 
antígeno, em quantidade, haverá aglutinação ou 
precipitação visível. 
Na zona de equivalência, ocorre a malha de aglutinação 
visível. 
PROZONA: Corresponde à zona de excesso de 
anticorpo. 
PCR (proteína C reativa): resultados 
• O valor normal de PCR é menor que 06 mg/L. Se 
houver aglutinação na placa, é necessário fazer a 
diluição do soro para se determinar o valor real do 
PCR. 
• A diluição da amostra permite detectar títulos 
maiores que 06 mg/L. 
• Fator de diluição: 6,5 (multiplica o título da 
diluição com o fator de diluição). 
TESTE QUANTITATIVO 
É realizado através de diluições (ver slide seguinte) 
Como realizar as diluições: 
1. No TUBO 1, adicionar 50 μl de solução fisiológica 
(salina) e distribuir essa quantidade de solução 
fisiológica em quantos tubos você quiser usar para fazer 
diluições; 
2. Também no tubo 1, adicionar 50 μl do soro do 
paciente (diluição 1:2). Homogeneizar e transferir 50 μl 
dessa mistura para o tubo 2 que já contém 50 μl de 
solução fisiológica. Homogeneizar e transferir 50 μl 
dessa mistura para o tubo 3 (1:4) e assim por diante; 
3. Transfira o conteúdo de cada tubo para cada poço na 
placa (50ul) (ou faça as diluições na própria placa 
preta); 
4. Adicione o reagente em cada tubo; 
5. Faça a leitura da reação na placa 
2. ARTHRI-TEST E WAALER-ROSE 
ARTHRI-TEST 
• Exame para auxiliar no diagnóstico de artrite 
reumatoide. 
• A artrite reumatóide é uma doença auto-imune de 
evolução lenta que tende à cronicidade 
• A fase final após 15-20 anos de doença caracteriza-
se por um quadro de deformidades e limitações de 
movimento (há erosão de cartilagens, que 
posteriormente podem calcificar e fragmentar) 
ARTHRI-TEST 
• O objetivo do exame é a detecção do fator 
reumatóide no soro de um paciente portador de 
artrite reumatóide. 
• O fator reumatóide é uma IgM dirigida contra o 
fragmento Fc de uma IgG. 
Fator reumatóide: IgM anti-IgG 
IgM monomérico IgM (pentamérica) 
RESULTADOS ARTHRI-TEST 
→ As amostras reagentes com títulos superiores a 25 
UI /mL devem ter valor diagnóstico 
→ Todas as amostras reagentes devem ser diluídas 
para ter o seu título determinado 
→ Fator de diluição: 8 
→ O aumento do título reflete a progressão da 
doença, daí a importância da prova quantitativa. 
→ Reações falsamente positivas podem ser 
verificadas com outras doenças 
→ Reações falsamente positivas podem ser 
verificadas com outras doenças. 
 
 
Fundamento do arthri test 
Arthri-test: partículas de látex adsorvidas com IgG (este 
é o reagente) são misturadas ao soro do paciente 
Fundamento do Waaler-Rose 
Waaler-Rose: hemácias de carneiro adsorvidas com IgG 
são misturadas ao soro do paciente. 
Nos casos positivos, há hemólise. 
3. ASO ou ASLO (anti-estreptolisina O) 
• Uma das toxinas produzidas pelo Estreptococo beta 
hemolítico é a estreptolisina-O, descrita por Todd 
em 1932 
• Quando, após uma infecção de orofaringe ou pele, 
o paciente não é tratado adequadamente a toxina 
induz o organismo a produzir a antiestreptolisina-O 
(ASO) anticorpo- 
• Após 2-3 semanas de infecção não tratada, a 
antiestreptolisina-O que tem estrutura semelhante a 
porções do miocárdio, rins e articulações, pode 
levar ao desencadeamento de, respectivamente: 
1- Febre reumática (geralmente após infecções 
estreptocócicas de orofaringe) 
2- Glomérulo nefrite (geralmente após infecções de 
pele), além das dores nas articulações. 
Fundamento do exame: 
o O soro em análise é colocado em contato com um 
reagente que contém partículas de látex revestidas 
com estreptolisina-O. 
o A reação de aglutinação pode ser qualitativa e 
quantitativa (através da técnica de diluição). 
o Fator de diluição: 200 
RESULTADOS: ASLO 
Resultados: 
• Em soros normais, sempre existe ASLO em 
concentração inferior a 200 UI/mL, e por esta razão 
não se deve expressar um resultado como negativo 
e sim com os valores. 
• Valores inferiores a 200 UI/mL não são 
significativos para infecções estreptocócicas. 
• Para glomérulo-nefrite, apenas valores acima de 
500 
• UI/mL podem caracterizar a existência da doença. 
TESTES DE GRAVIDEZ 
Princípio: imunocromatografia 
Baseiam-se na pesquisa do hormônio da gravidez, 
denominado hCG (hormônio Gonadotrofina Coriônica 
Humana) 
PRODUÇÃO DO hCG 
É um hormônio produzida pelo trofoblasto, grupo de 
células do embrião que dá origem à placenta 
O hormônio hCG produzido pelo trofoblasto consegue 
alcançar a corrente sanguínea da mãe, o que possibilita 
sua detecção por exames laboratoriais ultrassensíveis. 
β hCG 
O hCG é composto de duas subunidades α e β 
• O exame é realizado utilizando anticorpos 
monoclonais anti-subunidade β, altamente 
específicos e quase totalmente desprovidos de 
reações cruzadas 
• A subunidade alfa está presente em outros 
hormônios como os da tireóide 
Testes laboratoriais para gravidez 
a- Inibição da aglutinação 
b-Aglutinação direta 
C- β hCG 
O Beta hCG deve ser realizado no sangue ou urina? 
→ O hCG produzido passa para a circulação sanguínea 
da mãe e é filtrado pelos rins, sendo parte dele 
eliminado pela urina. 
→ Logo, o beta hCG pode ser dosado tanto no sangue 
como na urina da mulher. 
→ A dosagem na urina permite casos de falso-
negativos no início da gestação e em urinas diluídas 
CONCENTRAÇAO DE β hcg 
o A produção deβ hCG se intensifica dobrando em 
média a cada 2 dias, atingindo os maiores níveis em 
torno da 10ª semana de gestação. 
o A capacidade de detecção de níveis variáveis deste 
hormônio determina a sensibilidade dos testes 
laboratoriais 
o PLANOTESTES (testes de inibição de aglutinação 
e aglutinação direta): 
o Testes de 50 a 500 UI detectam positividade após o 
13º dia de atraso menstrual 
● β hcg de 25 UI a detecção da gravidez se dá no 2º ou 
3º dia de atraso menstrual 
● β hCG com 10 UI detecta gravidez 24 horas após a 
concepção. 
Procedimento para realizaçao de β beta hCG 
qualitativo 
Tiras reagentes adsorvidas com anticorpos anti-beta 
hCG + conjugado de cor são inseridas em tubos 
contendo soro ou urina do paciente. 
• Quando há hormônio na urina ou soro do paciente 
na quantidade correspondente à sensibilidade do 
teste, há a formação de duas faixas. 
• Quando apenas uma faixa se forma (controle), o 
resultado é negativo. 
• Anticorpos anti-beta hCG + conjugado de cor 
β hCG QUANTITATIVO 
Realizado por técnica de quimioluminescência (será 
estudado em outra aula). 
Valores de beta hCG quantitativo ao longo da 
gravidez 
Em geral, os valores do β hCG comportam-se da 
seguinte maneira ao longo das semanas de gravidez: 
Mulheres não grávidas ou com menos de 3 semanas de 
gravidez: menor que 5 mIU/mL. 
3 semanas de gravidez: entre 5 e 50 mIU/ml. 
4 semanas de gravidez: entre 5 e 426 mIU/ml. 
5 semanas de gravidez: entre 18 e 7.340 mIU/ml. 
6 semanas de gravidez: entre 1.080 e 56.500 mIU/ml. 
7 a 8 semanas de gravidez: entre 7.650 e 229.000 
mIU/ml. 
9 a 12 semanas de gravidez: entre 25.700 e 288.000 
mIU/ml. 
13 a 16 semanas de gravidez: entre 13.300 e 254.000 
mIU/ml. 
17 a 24 semanas de gravidez: entre 4.060 e 165.400 
mIU/ml. 
25 a 40 semanas de gravidez: entre 3.640 e 117.000 
mIU/ml. 
Atenção!!!! os valores acima são apenas para 
orientação. Eles não são uma regra e outras 
referências podem apresentar valores distintos. 
RECOMENDAÇÕES PARA AMOSTRA de β hCG 
a- URINA: 
• Urinas hemorrágicas ou turvas devem ser 
filtradas ou centrifugadas 
• Usar a primeira amostra da manhã que contém 
maior concentração de hCG, igualando-se aos 
níveis sanguíneos de hCG 
• Os recipientes utilizados (vidro ou plástico) na 
coleta deverão estar limpos e secos, isentos de 
detergentes que podem interferir no teste e 
falsear o resultado 
b -SOROS 
Soros lipêmicos (turvos) devem ser evitados 
RESULTADOS TESTES DE GRAVIDEZ 
Resultados Falso-positivos: 
Doenças trofoblásticas (molahidatiforme, 
coriocarcinoma) 
Tumores testiculares 
Proteínúria 
Contaminação bacteriana 
Doenças reumáticas 
Drogas anticonvulsivantes, 
Drogas antiparkisonianas 
Hipnóticos e tranqüilizantes 
Obs: A produção de hCG de tumores trofoblásticos 
pode ser bem grande, frequentemente acima de 100.000 
e em alguns casos, ultrapassando os 500.000 mIU/mL. 
Resultados Falso-negativos: 
• Gravidez ectópica 
• Aborto iminente 
• Drogas diuréticas 
TESTES RÁPIDOS (TR) 
Os Testes Rápidos (TR) são imunoensaios (IE) simples, 
cujas execução, leitura e interpretação podem ser 
realizados em até 20 minutos. 
FORMATOS DE TR 
a- Dispositivos (ou tiras) de Imunocromatografia (ou 
fluxo lateral) para pesquisa de anticorpo total. 
Mecanismo da Imunocromtografia de fluxo lateral 
→ Na área A, há antígenos do agente infeccioso 
investigado ligados a ouro coloidal. A amostra de 
sangue do paciente é depositada sobre a membrana 
na área A. 
→ Os anticorpos, se presentes na amostra do paciente, 
se ligam ao antígeno formando um imunocomplexo 
Antígeno-Anticorpo. 
→ Com a adição do tampao, o imunocomplexo migra 
até a área teste (T) onde será visualizada uma linha 
vertical devido ao ouro coloidal 
→ A reação será válida se houver o aparecimento de 
uma linha colorida, na área de controle (C). 
→ Na linha controle tem um anticorpo fixado que 
recebe o antígeno com ouro coloidal, confirmando 
que o teste está funcionando bem. 
A= ag + ouro coloidal 
C= controle - anticorpo 
T – anti-anticorpo 
COMO FUNCIONA A 
IMUNOCROMATOGRAFIA 
1. Área A: 
antígenos ligados a ouro coloidal amostra do paciente 
tampão 
2. Área teste: 
anti-anticorpos fixados 
3. Controle: 
Anticorpo fixado (recebe o antígeno com ouro coloidal) 
Interpretação teste rápido 
Reagente: 
Quando houver formação de duas linhas coloridas: 
uma, na área de teste (T) e outra, na área de controle (C). 
Não reagente: 
Quando houver formação de uma linha colorida, 
somente na área de controle (C). 
Inválido: 
Quando não houver linha colorida, na área de controle 
(C). 
TESTE RÁPIDOS PARA PESQUISA DE IgM e 
IgG 
A fabricação de um teste imunocromatográfico é um 
processo que emprega princípios de biologia, química, 
física e engenharia. 
COMPONENTES DO TESTE 
Os componentes se sobrepoem e são montados sobre 
uma parte de suporte. 
1. Filtro de amostra 
Controla a distribuição do material para o suporte do 
conjugado, impedindo o alagamento 
Material: malhas de algodão, fibras de celulose e fibras 
de vidro 
2. Suporte do conjugdo: Anticorpos do paciente+ ouro 
coloidal. 
Preparo de partículas de ouro coloidal são baseados na 
redução aquosa de ácido tetracloroaúrico (HAuCl4) 
usando diferentes tipos e quantidades de agentes 
redutores. 
Material: podem também ser empregadas no teste: 
partículas de látex coloridas partículas magnéticas e 
moléculas fluorescentes . 
3. Membrana de nitrocellulose: teste e controle 
TESTE: anti-anticorpos IgM e IgG, separadamente 
CONTROLE: anticorpo que se ligará ao antígeno com 
outro coloidal que migrará quando for adicionado o 
tampão 
o O filtro absorvente tem como finalidade puxar todo 
o fluido adicionado no teste assegurando que não 
ocorra a volta deste material, evitando assim falsos 
positivos. O material é tipicamente uma celulose de 
alta densidade 
SENSIBILIDADE/ESPECIFICIDADE DOS TR 
* Sensibilidade de 100% 
* Especificidade de 99,4% 
Semelhantes aos testes Elisa 3ª geração 
Amostras para TR 
A amostra utilizada no teste rápido pode ser: 
o Soro 
o Plasma 
o Sangue total: EDTA 
lanceta (desprezar 1ª gota) 
Testes complementares 
• Embora os testes rápidos e os IE sejam sensíveis e 
específicos, resultados falso-positivos podem 
ocorrer. Por esta razão, os testes complementares 
foram desenvolvidos. 
• Os testes complementares utilizam diferentes 
formatos e princípios. Estão incluídos nessa 
categoria:Western blot (WB), eimunofluorescência 
indireta (IFI). 
• A IFI foi muito utilizada como teste complementar 
durante a primeira década da epidemia de HIV, mas 
atualmente foi substituída pelo WB e PCR 
(Polimerase chain reaction). 
IMUNOFLUORESCÊNCIA 
A técnica de imunofluorescência combina corantes 
fluorescentes, como o isotiocianato de fluoresceína, 
com anticorpos para que fluoresçam quando expostos à 
luz ultravioleta; 
• Principal tipo: 
1. Imunofluorescência indireta 
2. Imunofluorescência direta 
Imunofluorescência Indireta 
→ O anti-anticorpo vai se ligar somente se o anticorpo 
específico estiver formando complexo com o seu 
antígeno; 
→ Depois da incubação a lâmina é lavada para 
remover o anticorpo não ligado e é examinada ao 
microscópio de fluorescência; 
→ Se o antígeno fixado à lâmina aparece fluorescente, 
significa que o anticorpo específico está presente no 
soro; 
→ No microscópio de imunofluorescência, filtros 
adequados para evitar a passagem, pela ocular, de 
luz de baixo comprimento de onda, protegendo 
assim os olhos do observador. 
WESTERN- BLOT 
• Método padrão confirmatório de positividade 
• O DNA ou RNA de um agente etiológico é tratado 
com endonucleases para criar fragmentos de 
tamanhos diferentes; 
• Os fragmentos do ácido nucléico são separados por 
eletroforese em gel e depois transferidos para papel 
de nitrocelulose; 
• Este papel depois é colocado em contato com o soro 
do paciente suspeito de apresentaranticorpos contra 
um determinado microrganismo e, após corado, 
aparece um “borrão” no local onde o anticorpo do 
paciente se fixou. 
Outros testes: 
Teste de Dick (Escarlatina) 
A injeção de uma dose de teste cutâneo da toxina 
eritrogênica (teste de Dick) resulta em um resultado 
positivo em pessoas que não produziram a antitoxina 
(aparecimento de edema e eritema após 8 - 24 horas). 
Teste de Widal (febre tifóide) 
É a pesquisa de anticorpos dirigidos contra os 
antígenos O e H de Salmonella typhi ou Salmonella 
parapyphi A e B através de reação de aglutinação 
Reação de Fixação de complemento (sífilis) 
o A fixação do complemento foi usada antigamente 
para o diagnóstico da sífilis (teste de Wasserman) e 
ainda é utilizada para diagnosticar determinadas 
doenças virais, fúngicas e causadas por Riquétsias 
o Quando, para o antígeno em questão, o soro contém 
Anticorpo, o Complemento é fixado e, ao se 
adicionar o sistema indicador, não ocorrerá 
hemólise. 
 
 
Mononucleose infecciosa ou doença do beijo Teste 
de Paul and Bunnel 
• Paul and Bunnel verificaram que o vírus 
EpsteinBarr formam anticorpos heterofilos que 
aglutinam hemácias de boi 
• O teste sorológico baseia-se em partículas de látex 
revestidas com eritrócitos de boi 
• Trata-se de um teste de hemaglutinação.