Provas bioquímicas_água e PNE

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Testes de identificação dos principais patógenos de interesse no CQ de PFeC
	Teste
	P. aeruginosa
	E. coli
	Enterobacter aerogenes
	Salmonella sp.
	Agar TSI (tríplice-açucar-ferro)
	Alcalina (ver.)
	Ácido (am.)
	Ácido (am.)
	Alcal (verm.)
	Agar SIM (sulfeto, indol e motilidade) 
	S / I / M: (-)s
	S: (-); I / M:(+)s
	S / I: (-)s; M: (+)
	I: (-); S / M: (+)s
	OF (Hugh-Leifson) oxid. e ferm. aberto
	Oxid. (+) e ferm.(-)
	NA
	NA
	NA
	Gelatinase (meio gelatina)
	+
	NA
	NA
	NA
	Citocromo oxidase
	+
	-
	-
	NA
	Citrato de Simmons
	+
	-
	+
	+ ou -
	Lisina descarboxilase
	NA
	+ 
	+
	+
	Urease
	+
	-
	-
	-
	Vermelho de metila
	-
	+
	-
	+
	Voges-Proskauer
	-
	-
	+
	-
	Gelatinase
	+
	NA
	NA
	NA
NA = não aplicável
1- IDENTIFICAÇÃO DE Pseudomonas aeruginosa: Isolamento e seleção: ágar cetrimida: colônias com verde fluorescentes [piocianina (azul-esverdeado) e fluoresceína (verde-amarelado)] característicos da P. aeruginosa.
Teste do ágar tríplice-açúcar-ferro: inocular colônia isolada em ágar inclinado TSI (dextrose, lactose e sacarose). Incubar a 30-37 ºC, 24 horas. P. aeruginosa não modificam o pH do meio e, portanto, produzem reação alcalina (cor vermelha) na superfície e na base. Indica tb a produção de H2S (sulfeto de hidrogênio)
Teste do ágar SIM: Usado para determinar a produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) a partir do sulfato ferroso (precipitação do sulfeto férrico), indol a partir do triptofano (reag. Kovacks) e motilidade de bacilos entéricos. P. aeruginosa é indol negativa (não forma halo vermelho), H2S negativa e não apresenta motilidade.
Teste do ágar O/F (Hugh-Leifson): MO ñ-fermentadores que metabolizam glicose via metabolismo oxidativo irão causar oxidação, caracterizado por uma pequena produção de ácido no tubo aberto alterando o pH e mudando o azul de bromotimol de verde para amarelo na porção superior do ágar. No tubo fechado não provocam alteração. P. aeruginosa é oxidativa, não fermentadora, não produz gás no OF.
Teste da Gelatinase: Determina se o MO possui a enzima gelatinase. P. aeruginosa é gelatinase +
Teste da Citocromo oxidase – Colocar uma gota de N,-N-dimetil-p-fenilenodiamina, recentemente preparada , em colônia suspeita da placa de ágar cetrimida. Colônias de P. aeruginosa desenvolvem coloração rósea, que passa a marron, vermelho escuro e negro entre 10 e 30 min. 
Teste da urease: A urease é uma enzima hidrolítica que ataca a ligação entre o nitrogênio e o carbono em compostos como a uréia, formando a amônia (alcalino), CO2 e H2O. O meio alcalino altera a coloração do indicador de pH (vermelho de fenol) de amarelo para rosado. P. aeruginosa é urease positiva.
Teste da produção de fluoresceína – Inocular colônia isolada em ágar inclinado para detecção de fluoresceína. Incubar a 30-37 ºC durante 24 horas, e examinar a fluorescência do ágar à luz ultravioleta, no comprimento de onda entre 328 e 210 nm. Cerca de 99% das cepas de P. aeruginosa produzem fluoresceína.
Teste do crescimento a 41 ºC – inocular colônia isolada em ágar inclinado em infusão cérebro e coração. Incubar o tubo a 41 ºC, 48 horas. Aproximadamente 99% das cepas de P. aeruginosa crescem a 41 ºC.
2- IDENTIFICAÇÃO DE E. coli: Isolamento e seleção: Ágar – EMB: Colônias pretas com brilho verde metálico na superfície.
Teste do ágar tríplice-açúcar-ferro - Colônias típicas de E. coli apresentam reação alcalina (vermelha) ou ácida (amarela) na parte superior (inclinada) e ácida amarela na base, com ou sem formação de gás e H2S;
Teste do ágar SIM: E. coli cresce, migra e produz gás, mas não produz H2S (precipitado escuro). É indol positivo (forma halo vermelho c/ Kovacs) 
Teste de indol – Inocular tubo contendo caldo de digesto pancreático de caseína com colônia suspeita da placa de ágar EMB. Incubar a 30-37 ºC, 24 horas. Adicionar 0,5 ml de reagente de Kovacs e agitar o tubo suavemente. Coloração vermelha intensa indica a presença de indol, que é produzido por E. coli. Pode ser adicionado no mesmo teste com ágar SIM.
Teste do ágar citrato de Simmons - Inocular colônia suspeita da placa de ágar EMB em ágar citrato de Simmons inclinado. Incubar a 30-37 ºC, 4 dias. E. coli não utiliza citrato como única fonte de carbono, e o meio permanece verde.
Teste da lisina descarboxilase: O meio de cultura contém o a.a. lisina e um indicador de pH (púrpura de bromocresol). A fermentação da glicose acidifica o meio e o pH ácido altera o indicador de pH de púrpura para amarelo. O pH ácido ativa a enzima que descarboxila a lisina à amina causando a subsequente neutralização do meio que retorna p/ púrpura outra vez. Reação alcalina (púrpura) em todo o meio. E. coli é lisina descarboxilase +.
Teste de vermelho de metila - VM (reação ácida mista = ácidos: lático, fórmico, acético...): Adicionar 3 a 5 gotas do indicador vermelho de metila por 5 ml do meio de cultura (caldo vermelho de metila / Voges-Proskauer- MR-VP). Reações positivas, fortemente ácidas, desenvolvem coloração vermelha brilhante; reações fracamente positivas desenvolvem coloração vermelha-alaranjada e reações negativas desenvolvem coloração amarela. E. coli é VM positivo, pois oxida a glicose, acidificando o meio.
Teste de Voges- Proskauer - VP (reação ácida simples = acetoína): Adicionar 4 ml do reagente de Voges-Proskauer (3 partes de alfa-naftol 5% e 1 parte de hidróx. de potássio 40%, nesta ordem) por 5 ml do meio MR-VP. Incubar a 30-37 ºC, 1 hora. O desenvolvimento de cor vermelha de eosina indica a presença de diacetila (acetoína), produto de oxidação de acetilmetilcarbinol. E. coli é VP negativa;
3 - IDENTIFICAÇÃO DE Salmonella sp: Isolamento e seleção: Ágar SS, ágar Sulfito de Bismuto, ágar XLD: características diferentes em cada
Teste do ágar tríplice-açúcar-ferro - Colônias típicas de Salmonella apresentam reação alcalina (vermelha) na parte superior (inclinada) e alcalina ou ácida amarela na base, com formação de gás H2S (sulfeto de hidrogênio) o meio fica bem vermelho;
Teste do ágar SIM: Salmonella cresce, migra (tem flagelos) e produz gás. É indol negativo (ñ forma halo vermelho c/ Kovac) 
Teste do ágar citrato de Simmons: Salmonella utiliza citrato como única fonte de carbono, e o meio passa p/ azul.
Teste da lisina descarboxilase: Salmonella é lisina descarboxilase (+).
Teste da urease: Salmonella é urease negativa.
Teste de vermelho de metila - VM (reação ácida mista = ácidos: lático, fórmico, acético...): Salmonella é VM positivo, pois oxida a glicose, acidificando o meio.
Teste de Voges-Proskauer - VP (reação ácida simples = acetoína): Salmonella é VP negativa;
4 - IDENTIFICAÇÃO DE Staphylococcus aureus: Isolamento e seleção: Sal Manitol Vermelho de Fenol; Voguel Johnsson: características diferentes em cada
Coloração de Gram: S. aureus é Gram-(+)
Teste da Coagulase: Adicionar a colônia isolada em 0,5 ml de plasma (humano, de coelho, etc) puro ou diluído 1:4 adicionado de citrato ou EDTAA maioria das cepas de Staphylococcus aureus possui a coagulase ligada (ou fator aglutinante) “clumping factor” na superfície da parede celular, que reage com o fibrinogênio do plasma causando a 
coagulação do mesmo.