Tecnica da PCR - Resumo

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Técnica da PCR 
PCR = Reação em cadeia da polimerase. 
Conceitos básicos 
Desnaturação – rompimento das pontes de hidrogênio que estabilizam a dupla hélice de 
DNA. 
Temperatura de desnaturação (Td ou Tm – melting temperature) – temperatura na qual 
50% do DNA está desnaturado. Quando maior o conteúdo GC do DNA, maior a Td (3 pontes 
de hidrogênio, mais difícil de romper). 
A renaturação é possível. 
Princípios PCR 
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um processo em que uma região específica do 
DNA é replicada várias vezes, gerando muitas cópias dessa sequência. O processo é 
realizado em vários ciclos (cerca de 30). 
Primers – definem os limites da sequência a ser amplificada. São complementares às 
sequências que flanqueiam essa região alvo. É necessário um par deles (forward + reverse). 
Se ligam nos filamento opostos de DNA e suas pontas 3’ apontam uma para a outra. 
São necessários para que a DNA polimerase possa amplificar o segmento, pois ela não faz 
síntese “de novo”. Significa que ela precisa de uma extremidade 3’ OH livre para começar a 
síntese (o primer oferece isso). 
 
 
Características dos primers 
 Ambos os primers devem ser específicos para a sequência-alvo e possuírem Td 
similar. 
 Tamanho: 15 a 25 pares de bases 
 Conteúdo GC – 40 a 60% 
 Não deve conter sequências complementares ou similares 
o Evitar formação de hairpins e dímeros 
Multiplex-PCR 
Amplificação simultânea de mais de uma região do DNA, em uma única reação – usa vários 
pares de primers. Eles devem possui temperatura de anelamento (hibridação) similar. 
 
DNA polimerase 
A DNA polimerase adiciona bases nitrogenadas nas pontas dos primers. 
A mais usada é a Taq polimerase (Thermus aquaticus), obtida de bactérias extremófilas. 
Possui atividade ótima a 72ºC. Importante essa característica pois ela resiste às variações de 
temperatura do ciclo (DNA polimerase humana seria desnaturada) – TAQ POLIMERASE É 
TERMOESTÁVEL. 
É de menor fidelidade pois não possui atividade de reparo (exonuclease) no sentido 3’  5’. 
Outros tipos de DNA polimerase: AmpliTaq Gold, Pfu polimerase. 
Novos filamentos complementares de DNA são sintetizados (como na replicação normal de 
DNA nas células), formando moléculas bifilamentares de DNA idênticas à sequência parental. 
Componentes da PCR 
 Primers 
 DNA polimerase 
 Cátions – cofatores da DNA polimerase 
o Principal: Mg2+ 
 Tampão – mantém pH adequado para reação 
 Desoxirribonucleotídeos (dNTPs) – substratos para a polimerização; quantidades 
equivalentes de dATP, dCTP, dGTP e dTTP. 
 DNA molde – linear ou circular 
 
 
Ciclos da PCR 
Consiste de 3 etapas: 
1) Desnaturação – temperatura mais alta do ciclo, ocorre separação das fitas de DNA 
(94 – 95ºC) 
2) Anelamento – temperatura é diminuída para permitir o anelamento (hibridação) dos 
primers. Geralmente é de 3 a 5 graus menor que a Td dos primers. (cerca de 50ºC) 
a. É a temperatura crítica do ciclo 
b. Se não for ajustada corretamente pode ocorrer: amplificação inespecífica de 
outros trechos, falha na amplificação 
3) Extensão - temperatura é aumentada novamente para que a DNA polimerase faça a 
extensão das fitas. (72ºC) 
Termociclador 
Aparelho em que é realizada a PCR. 
 
 
Aplicações 
 Amplificação de sequências presentes em números extremamente baixos 
 Pode ser utilizada em contextos forenses e diagnósticos 
 Produtos da PCR podem ser usados em clonagem 
Fatores que afetam a PCR 
 É preciso ter informações da sequência do fragmento de DNA que precisa ser 
amplificado. 
 DNA degradado – falha na amplificação 
 Inibidores da PCR – podem atuar de várias formas, impedem que a reação acontece. 
o Mais importantes: heme (Hb), índigo (jeans), compostos húmicos (solo). 
 Contaminação 
 Segmentos amplificados não podem ser grandes (maior propensão a erros) 
RT-PCR 
Utilizada para detectar mRNA – reação da transcrição reversa seguida da PCR. Primeiro a 
gera DNA a partir de fragmentos de mRNA, e esses fragmentos de DNA serão amplificados. 
 Primers – podem ser de DNA ou RNA, sendo os de DNA mais eficientes 
o Podem ser gene-específicos ou universais (hibridizam com qualquer 
sequencia) 
 RT-PCR de um passo – combina a transcrição reversa e a PCR em um único tubo 
o Uso de primers gene-específicos 
o Útil para grande número de amostras 
 RT-PCR de dois passos – reações em tubos separados 
o Uso de primers universais 
o Útil para analisar múltiplos mRNAs em uma única amostra 
 
 
 
RESUMO DA RT-PCR: 
DNA-COMPLEMENTAR (CDNA) SINTETIZADO A PARTIR DE MOLÉCULAS 
DE RNA PELA ENZIMA TRANSCRIPTASE REVERSA + AMPLIFICAÇÃO 
POR PCR 
Nested-PCR 
Variação da PCR em que primeiro o segmento é amplificado de forma abrangente 
(copiando sequências que ultrapassam) e depois utilizando o primeiro produto, ocorre a 
amplificação da sequência-alvo real. 
Aumento da especificidade e da eficiência da reação. 
 
Quantificação do DNA por PCR 
End-point PCR 
Nessa abordagem, um único lócus STR ou outra região é amplificada ao longo de amostras 
de DNA de concentrações conhecidas, gerando uma curva padrão à qual as amostras de 
concentração desconhecida serão comparadas. 
Um pigmento fluorescente intercalante é utilizado, como o SYBR Green. Baseado na 
intensidade de sinal fluorescente resultante da amplificação por PCR, é possível estimar a 
quantidade de DNA da amostra. 
Método pouco usado atualmente (pouco inespecífico). 
Real-time PCR (qPCR) 
Cuidado para não confundir as siglas da real-time PCR (qPCR) com RT-PCR (transcrição 
reversa). 
Mede o sinal de fluorescência resultante da amplificação de uma sequência alvo do 
DNA. São utilizadas sondas fluorescentes que emitem fluorescência cada vez que um 
segmento é amplificado. Então, a fluorescência emitida é diretamente proporcional à 
quantidade de segmentos amplificados. 
Sondas de qPCR: 
 TaqMan – quando a sonda está intacta, pouca ou nenhuma 
fluorescência é emitida. Durante a polimerização, a sonda 
hibridiza NO MEIO da sequência alvo, e quando a DNA 
polimerase passa por ela, ocorre degradação da sonda. 
o A degradação da sonda faz com que ocorra a emissão 
da fluorescência!!!! 
o Sonda intacta = quencher em proximidade com o 
fluoróforo reporter suprime a fluorescência 
o Sonda clivada pela DNA polimerase – o fluoróforo 
reporter é liberado (se afasta do quencher) e emite 
fluorescência. 
 Molecular beacon – outro tipo de sonda; quando estão livres 
(forma de hairpin) não emitem fluorescência. Na presença do 
DNA alvo, eles hibridizam na sequência, se desdobram e passam a emitir 
fluorescência. 
A medida da emissão de fluorescência é feita na fase exponencial do ciclo – há um alto grau 
de precisão na produção de novos produtos, ou seja, o número de DNA alvo dobra a cada 
ciclo. 
 
 
Cycle threshold (Ct) 
É o ponto da curva de amplificação da PCR em que a fluorescência emitida excede algum 
limiar previamente estabelecido pelo software. 
QUANTO MAIOR O CT, MENOR ERA O NÚMERO DE MOLÉCULAS NA AMOSTRA 
INICIAL. 
Esse Ct é comparado a uma curva de amplificação de uma amostra de concentração 
conhecida, e assim é possível obter a quantidade de DNA da amostra. 
Procedimentos PCR (manuseio de termociclador) 
Manipular e eliminar todas as amostras biológicas, reagentes e materiais usados como se 
fossem agentes infecciosos. Evitar o contato direto com as amostras biológicas. Evitar a 
formação de aerosol durante o procedimento – evite respingar material ao redor da área de 
trabalho ou fora dela. 
Os procedimentos de biologia molecular, como a extração, a transcrição reversa, a 
amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal especializado para evitar o 
risco de resultados incorretos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos 
das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. 
É necessário dispor de uma área separada para a extração/preparação das reaçõesde 
amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de amplificação (áreas de 
pré e pós PCR). Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extração/preparação 
das reações de amplificação. É necessário uso de EPI adequado a cada uma das áreas de 
trabalho em laboratório de biologia molecular. 
As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem 
ser manipuladas em uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contêm amostras diferentes 
nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras 
devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento 
positivo ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem 
a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. 
 Os reagentes devem ser manipulados em câmara de fluxo laminar. Os reagentes 
necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma 
única vez (mix). As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas 
exclusivamente para aquela área de trabalho. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento 
positivo ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem 
a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. 
2. Pipetar o DNA de cada amostra na placa de PCR ou tubo devidamente identificado, 
trocando as ponteiras para cada amostra. 
3. Preparar o mix conforme o número e o volume das amostras, adicionar o BigDYE 3.1por 
último e sempre cuidar para deixar a placa ou tubo envolto com papel alumínio enquanto é 
transportada pelo laboratório, evitando a perda da fluorescência 
 
Referências: 
Griffiths et al (2008) Introdução a genetica 9ed 
Genetica Molecular Humana - Tom Strachan 4ed 
http://www.biometrix.com.br/site_diagnostica/arquivos/e505c25436b9aa15bf5f099689a42ff1
_arquivo.02 
 
 
http://www.biometrix.com.br/site_diagnostica/arquivos/e505c25436b9aa15bf5f099689a42ff1_arquivo.02
http://www.biometrix.com.br/site_diagnostica/arquivos/e505c25436b9aa15bf5f099689a42ff1_arquivo.02
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	Referências: