Apostila de Aulas Praticas de Microbiologia Basica

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO 
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL 
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - INBIO 
Microbiologia Básica 
Apostila de 
Aulas Práticas 
 
Campo Grande - MS 
 
 1
Nome:________________________________________ 
Curso: _______________________________________ 
Semestre: _____________________________________ 
Prezado Acadêmico! 
Seja bem vindo à disciplina de Microbiologia. 
Este manual contém informações importantes, de seu interesse e que facilitarão o acompanhamento 
da disciplina. 
Corpo docente: 
• Professor Odair Pimentel Martins – Graduado em Medicina Veterinária pela Universidade 
Estadual de São Paulo, Mestre em Microbiologia pela Universidade de São Paulo e Doutorando 
em Ciências da Saúde pela Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. 
• Professora Ana Paula da Costa Marques – Graduada em Biologia pela Universidade Católica 
Dom Bosco, Mestrado em Biologia Parasitária com ênfase em Imunologia pelo Instituto 
Oswaldo Cruz da Fundação Oswaldo Cruz e Doutora em Saúde e Desenvolvimento na Região 
Centro Oeste pela Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. 
• Professora Maria Carolina Silva Marques – Graduada em Farmácia pela Universidade Federal do 
Ceará, Mestrado em Agronomia com área de concentração em Agroquímica e Agrobioquímica 
pela Universidade Federal de Lavras e Doutora em Saúde e Desenvolvimento na Região Centro 
Oeste pela Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. 
Corpo Técnico: 
• Ana Paula de Oliveira Ricaldi de Castilho 
• Bruna Castro de Barros 
• Renata Lucichi Scapolatempo 
Pretendemos contribuir para a formação de um profissional de saúde que viva no seu tempo e que 
saiba enfrentar os desafios que ele apresenta. Que desenvolva a capacidade de pensar criticamente e 
que possa mudar para melhor, se não o mundo, pelo menos o seu mundo ao derredor. 
Pare, reflita: 
“O êxito da vida não se mede pelo caminho que você conquistou, mas sim pelas 
dificuldades que superou no caminho. ”
 Abraham Lincoln 
 2
SUMÁRIO 
Normas de segurança no Laboratório de Microbiologia ...........................................................................4
Meios de Cultura ........................................................................................................................................5
Presença de Micro-organismos no Ambiente ............................................................................................6
Características do Crescimento Bacteriano ...............................................................................................7
Bacterioscopia - Coloração simples .........................................................................................................9
Noções Básicas de Assepsia .....................................................................................................................11
Bacterioscopia - Coloração diferencial – Coloração de Gram ..............................................................12
Técnicas de semeadura e isolamento de bactérias ...................................................................................14
Adaptações de Meios para o Estudo dos Micro-organismos ...................................................................16
Antibiograma ...........................................................................................................................................17
Provas Bioquímicas I ...............................................................................................................................19
Provas Bioquímicas II ..............................................................................................................................20
Estudo da microbiota das mãos ...............................................................................................................22
Controle da população microbiana através de métodos físicos ...............................................................23
Referências Bibliográficas .......................................................................................................................24
 3
Normas de segurança no Laboratório de Microbiologia 
➢ É indispensável o uso de avental, calça comprida e sapato fechado no laboratório. O avental 
deve ser comprido, de mangas compridas e estar abotoado; 
➢ O Material pessoal (bolsas cadernos, mochilas, agasalhos, etc.) deve ser mantido longe das 
bancadas de trabalho. Utilizar na bancada somente o material necessário ao trabalho prático, 
como: roteiro de aula, papel e lápis ou caneta para anotações; 
➢ Antes de começar devemos lembrar: 
- prenda seu cabelo comprido para trás, longe da chama do Bico de Bunsen; 
- não use jóias e acessórios durante a aula prática; 
- mantenha seus dedos, lápis, caneta e quaisquer outros objetos longe da sua boca; 
- não fume, coma ou beba nada no laboratório; 
- não fique andando pelo laboratório, pois atividades desnecessárias podem causar acidentes, 
distrair os outros alunos e promover contaminação. 
➢ Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro, cd, marcador, etc.) 
➢ Em caso de qualquer acidente (derramamento de culturas, quebra de placas, ferimentos, 
aspiração de culturas, etc) comunicar imediatamente o professor ou o técnico responsável pela 
aula prática; 
➢ Descarte de material: 
- Materiais contaminados devem ser colocados nos recipientes próprios, existentes nos 
laboratórios. NUNCA deixá-los nas bancadas ou pias; 
- Placas de petri deverão ser deixadas tampadas sobre a bancada; 
- Lâminas fornecidas para visualização deverão ser deixadas sobre as bancadas; 
- Tubos com culturas deverão ser deixados nas estantes. 
➢ Prestar atenção às atividades dos colegas ao lado para evitar acidentes 
➢ Terminados os trabalhos práticos: 
- Esterilizar alças e fios de platina; 
- Verificar se as torneiras de água e gás estão fechadas; 
- Desligar lâmpadas e microscópios; 
- Limpar microscópios e cobri-los com a capa; 
- Tirar o avental e guardar; 
- Lavar cuidadosamente as mãos com água e sabão ou anti-séptico. 
“Tenha sempre em mente que a superfície das bancadas, os recipientes ou os materiais de trabalho 
podem ter sido contaminados inadvertidamente, portanto o manuseio de todos os materiais deve ser 
realizado com o máximo de cuidado e atenção”. 
 4
Meios de Cultura 
Objetivos: Compreender o que é um meio de cultura e a sua importância no isolamento, 
caracterização e identificação dos micro-organismos. 
Meios de cultura – Aspectos Gerais: O meio de cultura é uma preparação química que possui 
nutrientes necessários para que micro-organismos de determinada amostra biológica se multipliquem, 
permitindo seu estudo, identificação e análise. Os principais componentes de um meio de cultura são 
fontes de carbono, energia (açúcares), nitrogênio, fósforo e sais minerais. O crescimento dos micro-
organismos nos diferentes meios de cultura utilizados fornece as primeiras informações para a sua 
identificação. É importante conhecer o potencial de crescimento de cada meio de cultura e adequar ao 
perfil bacteriano esperado para cada material. Os meios de cultura dividem-se, quanto ao estado 
físico, em meios sólidos ou ágar, aqueles que contêm ágar (agente solidificante derivado de algas 
marinhas (Gellidium sp.) e são acondicionados em Placas de Petri ou tubos contendo meio inclinado; 
meios líquidos ou caldos, sem ágar e em tubos e os semissólidos, com um teor menor de ágar, 
também em tubos. Atualmente os meios de cultura utilizados são pré-fabricados e fornecidos na 
forma de pó desidratados, ao qual deverá ser adicionada uma quantidade determinada de água de 
boa qualidade, seguindo as especificações do fabricante. Ao preparar um dado meio de cultura, 
devem ser obedecidas todas as recomendações do fabricante, portanto, antes de iniciar o preparo, 
leia atentamente as especificações do produto e realize os cálculos, se necessários antes de iniciar a 
pesagem. 
Etapas do processode preparação: 
1. Pesagem criteriosa, em balança analítica, conforme especificação do fabricante. 
2. Medir o volume de água destilada, especificado pelo fabricante, em uma proveta. Colocar parte 
do volume de água em um Erlenmeyer com o dobro da capacidade de volume a ser 
preparado. 
3. Adicionar lentamente o pó sobre a água contida no Erlenmeyer. 
4. Acrescentar o restante da água, lavando as bordas internas do Erlenmeyer para que não haja 
perda de material nas bordas do frasco. 
5. Homogeneizar, aquecer até a completa dissolução, mexendo frequentemente. 
6. Após completa dissolução, autoclavar durante 15 minutos (1 atm/120 °C). 
7. Após retirar da autoclave, sob condições rigorosas de assepsia, distribuir o meio. 
8. Separar uma amostra e incubar em estufa a 37 °C durante 18 horas, para controle de 
contaminação. 
9. Retirar e armazenar sob refrigeração até o momento de uso. 
 5
Presença de Micro-organismos no Ambiente 
Objetivos: Constatar a presença de microrganismos no ambiente e nas superfícies vivas e 
inanimadas e verificar a diversidade de espécies microbianas. 
PROCEDIMENTO: 
 Cada dupla irá receber uma placa de ágar nutriente e um tubo com caldo nutriente ou 
Mueller-Hiton, 3 swabs e um tubo de salina estéril. 
 Discuta com os alunos do seu grupo de trabalho sobre quais os ambientes ou superfícies 
vocês gostariam de constatar a presença de micro-organismos. Utilize os “swabs” para isolar 
bactérias das superfícies dos ambientes, objetos ou mesmo da microbiota normal do corpo 
humano. 
 Ao final das atividades de semeadura identifique na tampa ou lateral de cada placa: material 
ou local semeado, nome ou iniciais do grupo de alunos, curso e turma. 
 6
Características do Crescimento Bacteriano 
Objetivos: Compreender as diferentes formas de crescimento bacteriano em função do tipo de meio 
de cultura e suas diferentes aplicações. 
Introdução: 
 
 
PROCEDIMENTO: 
Sobre a bancada encontram-se placas de Petri e tubos 
que foram semeados na aula anterior e que contém 
diferentes culturas de bactérias. 
 
Figura 1: Características do crescimento bacteriano – A: Em caldo; B – Em ágar 
ANÁLISE DOS RESULTADOS: 
Observe as culturas que se encontram sobre a bancada e estude as características de 
crescimento das bactérias em meios líquidos e sólidos. 
 
 Observe o crescimento de bactérias na superfície dos meios de cultura, com auxílio da lupa 
estereoscópica. Nos meios sólidos faça a análise pela observação das colônias. 
 Em meio sólidos, deve-se observar o número e tipos de colônias isoladas considerando-se o 
tamanho (grande: > que 1mm de diâmetro; médio: = a 1 mm; pequeno: < que 1 mm), cor 
(incolor, cinza, branca, amarela, rosa, esverdeada, alaranjada, negra, creme etc...), densidade 
(transparente, opaca e translúcida) e consistência (brilhante, cremosa, seca e mucóide), forma, 
elevação e margem (Figura 9). 
 7
turvação
depósito
película
A análise do crescimento bacteriano em meios 
sólidos é feita pela observação da formação de 
colônias isoladas ou crescimento confluente ou 
espalhado (Figura 1 B); já em caldos é realizada com 
base em características como turvação, depósito e 
presença de película na superfície (Figura 1 A). 
A
B
 
Figura 2: Descrição morfológica das colônias em Microbiologia 
 Observe a sua placa, fazendo a análise das colônias encontradas e do seu tubo de cultura. 
Anote os resultados no quadro abaixo. 
Placa Análise macroscópica - Características da colônia
Ágar Nutriente
Tubo Análise macroscópica - Alterações no caldo
Caldo
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Bacterioscopia - Coloração simples 
Objetivos: reconhecer a importância da preparação do esfregaço para a confecção de lâminas que 
serão observadas ao microscópio óptico comum durante o processo de identificação e caracterização 
de bactérias a partir de amostras. Compreender o princípio da coloração simples. 
Introdução: o diagnóstico das infecções bacterianas, contaminação de alimentos e/ou materiais 
estão fundamentados na identificação e caracterização do agente etiológico responsável por tais 
infecções e/ou contaminações. Na rotina do laboratório de Microbiologia os procedimentos de 
coloração são utilizados para evidenciar aspectos morfológicos e estruturais dos micro-organismos e 
constituem-se etapa fundamental do processamento de amostras para a identificação do agente 
etiológico. 
As células bacterianas são transparentes e por isso são difíceis de serem visualizadas em 
preparações não coradas. Em virtude da afinidade de grupos ionizáveis dos corantes com algumas 
estruturas celulares é possível a coloração das bactérias e observação ao microscópio óptico comum. 
As proteínas celulares e os aminoácidos são substâncias anfotéricas, ou seja, reagem como ácidos 
fracos ou bases e são altamente reativas quimicamente. Como as proteínas estão predominantemente 
na composição celular, elas são envolvidas nas reações de coloração. Para reagir satisfatoriamente 
com uma proteína, um corante deve ionizar-se como um ácido ou como uma base. 
Uma técnica de coloração é denominada de coloração simples quando somente um tipo de 
corante (ex: azul de metileno ou safranina ou fucsina) é empregado com a finalidade de contrastar a 
célula bacteriana com o fundo de observação. Nessa técnica as estruturas são coradas de maneira 
indiferenciada possibilitando-se apenas distinguir a morfologia geral da célula. 
Para a execução de qualquer uma das técnicas de coloração inicialmente prepara-se o 
esfregaço, colocando-se no centro da lâmina o material a ser examinado. A seguir realiza-se 
movimento circular com a alça de platina a fim de espalhar uniformemente o material sobre a 
superfície da lâmina. 
Antes de iniciar qualquer técnica de coloração é necessário bloquear a atividade enzimática das 
bactérias para que não aconteça a remoção do corante da célula. O procedimento recebe o nome de 
fixação do esfregaço e pode ser realizado de diferentes maneiras. Com a utilização de substâncias 
químicas como o formol, acetona ou álcool, ou por meio do calor passando-se rapidamente a lâmina 
três ou quatro vezes pela chama do bico de Bunsen; conforme Figura 2. 
 
 
 9
Figura 3: Técnica de preparo do esfregaço, fixação e coloração de células para a 
observação microscópica. 
Preparação de esfregaço e fixação 
MATERIAIS: 
 Lâminas de microscopia, conta-gotas com água destilada, corante azul de metileno de Loeffler’s, 
palitos de dente, prendedor de lâmina, pisseta com água destilada, recipientes de descartes e 
microscópicos ópticos. 
PROCEDIMENTO: 
Uma preparação ideal para estudos pode ser obtida com um esfregaço de uma suspensão 
liquida de material da boca em uma lâmina de microscopia. Este experimento dará a você uma 
percepção da diferença de tamanho entre as células animais (suas) e a variedade de micro-
organismos da microbiota bucal. O azul de metileno é o corante que será utilizado para a execução 
da técnica de coloração simples. 
Selecione, seque e identifique uma lâmina. Umedeça a lâmina com uma gota de água no 
centro da mesma e com o auxílio de um palito de dente, retire material da superfície dos dentes, 
esfregando-o sobre os dentes, próximo à gengiva e espalhe sobre a superfície da lâmina, com 
movimentos circulares. Fixe o esfregaço pelo calor e adicione algumas gotas do corante azul de 
metileno e deixe reagir por 2 minutos. Lave delicadamente com água destilada e seque com papel 
absorvente. Examine inicialmente sob pequenos aumentos e a seguir com a objetiva de imersão. 
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Noções Básicas de Assepsia 
Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também 
dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas. 
Toda a vez que se fizer uma semeadura ou a confecção de uma lâmina de microscopia é 
importante seguir as regras abaixo mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por 
micro-organismos presentes no ambiente e evitar acidentes laboratoriais. 
1. Flambagem da alça ou fio de platina: 
Tanto aalça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação 
de semeadura ou preparo de uma lâmina de microscopia. Para tanto devem ser aquecidos ao 
rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. A posição correta 
para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho 
(Figura 1). Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material, 
seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura, esfriar previamente a alça. Esta deverá ser 
esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri; 
 
Figura 4- Posição correta para a flambagem da alça ou fio 
Não esqueça!!!!!! 
Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo, ou num pedaço 
do ágar sem cultura), antes de colocar a alça em contato com a cultura, lembre-se: ela está muito 
QUENTE!!! 
2. As placas de Petri, os tubos de cultura e demais materiais deverão ser abertos ou manipulados 
SEMPRE próximos ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. Uma vez 
semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo. 
Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma, sempre invertida. 
 11
Bacterioscopia - Coloração diferencial – Coloração de Gram 
Objetivos: diferenciar coloração simples de coloração diferencial bem como as suas aplicações. 
Descrever o princípio e executar a técnica de coloração de Gram. Discutir a aplicação desse método 
de coloração com etapa fundamental do processamento de amostras para o diagnóstico laboratorial 
das infecções e /ou contaminações bacterianas. 
Introdução: Denomina-se de coloração diferencial a técnica na qual dois ou mais corantes são 
aplicados para a distinção da célula em partes ou para a discriminação de uma dada espécie ou 
grupos de micro-organismos. A coloração de Gram é a técnica de coloração mais amplamente 
utilizada na rotina do laboratório de Microbiologia, compreende um dos poucos testes que pode 
auxiliar no diagnóstico presuntivo de uma infecção e/ou contaminação causada por bactérias. É 
empregada para classificar as bactérias com base nas suas características tintoriais, morfológicas e 
arranjo celular. A técnica foi descrita por Hans Christian Joachim Gram em Berlin (1884). Gram foi um 
bacteriologista que se graduou em Medicina no ano de 1883. 
Pela técnica de Gram, as bactérias são classificadas em dois grandes grupos de acordo com a 
capacidade de resistirem ou não ao processo de descoloração pelo álcool-acetona. A reação de 
coloração é dependente da composição química e da estrutura da parede celular bacteriana. A 
espessa camada de peptidioglicano, rica em ligações glicosídicas e peptídicas é a causa da resistência 
à descoloração pelo álcool-acetona. 
A técnica é realizada utilizando-se um corante primário, um corante secundário, uma 
solução mordente e um agente descorante. 
O primeiro reagente a ser aplicado sobre o esfregaço já fixado é o corante primário (cristal 
violeta ou violeta de genciana) que cora todas as células presentes no esfregaço. O segundo reagente 
é uma solução de lugol (solução fraca de iodo) que atua como um mordente ou fixador do corante 
primário. O terceiro reagente é o agente descorante (álcool-acetona 1:1) que dissolve e retira o 
corante primário. O quarto reagente é o corante secundário (fucsina ou a safranina), que é 
aplicado como um contracorante. 
As bactérias que retêm o complexo violeta-lugol são denominadas de Gram Positivas. 
Aquelas que são descoradas pelo álcool-acetona e são coradas pela fucsina são denominadas de 
Gram Negativas. 
A diferença essencial entre uma bactéria Gram positiva e uma Gram negativa parece residir na 
estrutura da parede celular. As células Gram positivas, que apresentam uma espessa camada de 
peptidioglicano, são mais sensíveis à desidratação pelo álcool. O álcool do agente descorante atua 
fechando os poros da parede celular, promovendo a retenção do complexo cristal violeta-iodo e 
fazendo com que a bactéria seja corada em roxo. 
As bactérias Gram negativas apresentam uma parede celular rica em lipídios. O agente 
descorante promove a dissolução dos lipídios proporcionando um aumento na porosidade da parede o 
que impede a retenção do complexo cristal violeta-iodo. Dessa forma, após a etapa de aplicação do 
agente descorante as bactérias Gram negativas apresentam-se transparentes e serão coradas pelo 
corante secundário ou contracorante para serem visualizadas. 
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A etapa de descoloração pelo álcool-acetona é o passo crítico da diferenciação entre os dois 
grupos de bactérias evidenciados pela técnica de Gram. O resultado final da coloração de Gram pode 
ser afetado pela etapa de descoloração (sobre ou subdescoloração), idade do micro-organismo, 
tratamento com antimicrobianos e outros fatores que podem levar a falsas interpretações. 
MATERIAIS: Cada dupla deverá ter lâminas de microscopia, um prendedor de lâmina, uma cultura de 
bactéria em ágar, alça de platina, um conta-gotas de água destilada, pisseta com água destilada, kit 
de coloração de Gram, recipientes de descartes, duas placas de Petri vazias e microscópicos ópticos. 
PROCEDIMENTO: 
A partir da cultura de bactérias que se encontra sobre a bancada de trabalho e com o auxílio 
de uma alça de platina flambada e esfriada confeccione um esfregaço seguindo as orientações da 
última aula prática. 
Realize a técnica de coloração de Gram seguindo a etapas abaixo: 
1. Cobrir o esfregaço com o cristal de violeta (corante primário) e deixar agir por 1 minuto; 
2. Remover o excesso de corante e aplicar o lugol (solução mordente) deixando-o agir por 1 
minuto; 
3. Proceder à descoloração gotejando a solução de álcool-acetona (agente descorante) sobre o 
esfregaço corado. Esse procedimento deve ser realizado durante aproximadamente 5 
segundos; 
4. Lavar delicadamente em água destilada; 
5. Aplicar a fucsina ou safranina (corante secundário) e aguardar 30 segundos. 
6. Enxaguar e secar a lâmina. 
7. Observar ao microscópio óptico na objetiva de imersão. 
Análise dos resultados: 
Desenhe o que você observou na sua lâmina. 
 
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Técnicas de semeadura e isolamento de bactérias 
Objetivos: descrever as principais técnicas de semeadura de bactérias bem como a aplicação de 
cada técnica na rotina do processamento de amostras. 
MATERIAIS: Cada dupla deverá ter dois tubos de cultura e duas placas de Petri vazios, duas culturas 
bacteriana em ágar, outra cultura em caldo, duas placas de ágar nutriente, um tubo com caldo 
nutriente e um tubo com ágar nutriente inclinado. 
PROCEDIMENTO: 
- semeadura de bactérias para obtenção de cultura pura: (placa cultivada para tubo) 
♦ Examinar a placa que apresenta crescimento bacteriano e escolher uma colônia para a 
obtenção da cultura pura; 
♦ Flambar alça bacteriológica até a incandescência mantendoa verticalmente no bico de 
Bunsen; 
♦ Segurar a placa na mão não dominante, levantar a tampa, esfriar a alça, tocar na colônia 
escolhida e fechar a placa; 
♦ Utilizar o dedo mínimo para retirar a tampa do tubo que será inoculado e flambar a boca do 
tubo (Figura 5); 
♦ Introduzir a alça e inocular no meio líquido com movimentos circulares; 
♦ Flambar a boca do tubo e tampar; 
♦ Flambar a alça 
♦ Identificar o tubo no qual será preparada uma cultura pura (alunos, turma, curso); 
♦ Colocar para incubar. 
 
Figura 5: Transferência asséptica para um tubo de cultura. 
 14
- semeadura de bactérias para o isolamento na superfície de meio sólido, pela técnica de 
esgotamento - Figura 6: (tubo cultivado para placa) 
♦ Flambar a alça; 
♦ Utilizar o dedo mínimo para retirar a tampa do tubo que contém a amostra e em seguida 
flambar a boca do tubo; 
♦ Esfriar a alça e coletar uma porção do espécime; 
♦ Flambar a boca do tubo e tampar; 
♦ Segurar com uma mão a placa de Petri que contém o ágar nutriente; 
♦ Levantar a tampa e espalhar o conteúdo da alça, em estrias no setor 1; 
♦ Flambar a alçae esfriar; 
♦ Girar a placa um quarto de volta realizar estrias no setor 2; 
♦ Tampar a placa, flambar e esfriar a alça; 
♦ Girar novamente a placa e proceder como anteriormente no setor 3; 
♦ Flambar a alça; 
♦ Identificar a placa na qual será realizada a técnica de semeadura; 
♦ Colocar para incubar. 
TÉCNICA DE SEMEADURA POR ESGOTAMENTO: 
 Consiste em espalhar a amostra sobre a superfície do meio de cultura com o auxílio da alça 
bacteriológica realizando estrias sucessivas em três setores diferentes da placa. No setor 1, o 
material da alça é esgotado e nos setores 2 e 3 o material é espalhado a partir do setor anterior. Para 
o processamento de amostras muito densas como fezes, conteúdo abdominal, trato respiratório 
superior e outros, flambar a alça bacteriológica entre cada setor. 
 
 
Figura 6: Técnica de semeadura por esgotamento para obtenção de colônias isoladas 
- semeadura de bactérias em tubo com ágar inclinado: (tubo cultivado para tubo 
inclinado) 
♦ Flambar a alça; 
♦ Utilizar o dedo mínimo para retirar a tampa do tubo que contém a amostra e em seguida 
flambar a boca do tubo; 
♦ Esfriar a alça e coletar uma porção do espécime; 
♦ Flambar a boca do tubo e tampar; 
♦ Retirar a tampa do tubo que será inoculado e flambar a boca do tubo; 
♦ Introduzir a alça com o espécime e realizar estrias ao longo da superfície inclinada do meio 
sólido; 
♦ Flambar a boca de tubo e tampar; 
♦ Flambar a alça; 
♦ Identificar o tubo que contém o ágar inclinado e colocar para incubar. 
 15
SETOR 3SETOR 2SETOR 1
Adaptações de Meios para o Estudo dos Micro-organismos 
Objetivos: aplicar o conhecimento sobre a nutrição dos micro-organismos atendendo propósitos 
práticos do processo de identificação e caracterização de bactérias. Selecionar meios que possibilitam 
o isolamento e distinção de características de um micro-organismo a partir de uma cultura mista. 
PROCEDIMENTO: 
A turma será dividida em grupos de 3 alunos. Cada grupo terá os seguintes materiais: 
Uma placa de ágar nutriente (AN), de ágar Mac Conkey (MK) e a terceira de ágar manitol 
salgado (MS). Cada placa deverá ser semeada por uma das seguintes bactérias: Pseudomonas 
aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Escherichia coli. Identificar as placas: Alunos, 
turma, curso e bactéria. Incubar os meios a 370C por 24 horas. 
Análise dos Resultados: Não cresceu (-), cresceu (+, ++, +++); mudou de cor ou não 
 
 
 Figura 7: Tipo de semeadura nas placas 
 
P. aeruginosa S. aureus E. coli B. subitlis
Ágar nutriente 
Ágar Mac Conkey 
Ágar manitol 
salgado 
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Antibiograma 
Objetivos: Analisar o perfil de sensibilidade das bactérias frente aos antimicrobianos empregados 
no tratamento das doenças infecciosas. 
PROCEDIMENTO: 
 Sobre a bancada de trabalho de cada dupla encontra-se uma cultura em caldo e em fase 
ativa de crescimento (inóculo), 1 placa de ágar Mueller-Hinton, “Swab” estéreis, pinças estéreis, 
frascos com discos de antibióticos e recipiente de descartes. 
1 - Abrir asceticamente o tubo de cultura e introduzir o swab, umedecendo-o bem, retirar e fechar 
asceticamente o tubo. Semear o inóculo em toda a superfície de placa de ágar Mueller-Hinton com o 
auxílio do swab. Conforme Figura 8: 
 
Figura 8: Semeadura convergente para teste de sensibilidade a antimicrobianos (TSA) 
 17
2 - Usar a pinça flambada e esfriada para colocar os discos, pressionando-os levemente (Figura 9). 
 
Figura 9: Distribuição dos discos de antimicrobianos na placa semeada 
 Identificar as placas. 
 Incubar 18-24 horas em temperatura de 36 -37°C. 
Leitura: 
Proceder à leitura dos halos de inibição usando uma régua milimetrada, comparando os valores 
obtidos com a tabela padronizada e fundo preto. 
Antimicrobianos:
Bacillus 
subtilis 
Halo (mm)
Escherichia 
coli 
Halo (mm)
Staphylococcus 
aureus 
Halo (mm)
Pseudomonas 
aeruginosa 
Halo (mm)
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Provas Bioquímicas I 
Objetivos: reconhecer as principais endoenzimas sintetizadas pelas bactérias e descrever as suas 
funções biológicas, por meio dos testes bioquímicos. Interpretar as alterações que ocorrem nos 
diferentes meios de cultura em decorrência da produção dessas enzimas. Relacionar a síntese de 
endoenzimas com os procedimentos de caracterização e identificação de bactérias. 
PROCEDIMENTO: 
Sobre a bancada de cada dupla encontram-se culturas puras em ágar das seguintes bactérias: 
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae., Proteus mirabilis e Pseudomonas aeruginosa. 
♦ PROVA BIOQUÍMICA DE FERMENTAÇÃO DE CARBOIDRATOS 
A – Triple Sugar Iron (TSI) 
B – Sulfide Indole Motility (SIM) 
C – Citrato 
♦ Utilizando técnica asséptica, semeie a bactéria da seguinte forma: 
a) Retire uma pequena amostra, com auxílio do fio de platina devidamente flambado até o 
rubro e FRIO e semeie: 
a1) Meio TSI: com fio de platina, efetue uma picada central com movimento firme e retilíneo 
até o fundo do tubo e ao retirar a agulha faça estrias na superfície (bizel); 
a2) Meio SIM: semeie com fio de platina uma picada central em movimento firme e retilíneo 
até o meio do tubo; 
a3) Meio Citrato: semeie com fio de platina, fazendo estria sinuosa ou reta na superfície. 
♦ Obs.: O fio de platina não deve ser flambado entre um meio e outro. Somente deve ser 
flambado após o término da operação. 
♦ Incube por 18-24h a 35°C. 
Análise dos resultados: 
Resultados: 
* Após as 24 horas, no meio SIM, abri-lo e pingar três gotas do reativo Kovacs e observar. 
Interpretação do resultado: 
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________ 
Bactéria Gli Gás Sac/Lac H2S Mot Ind* Cit
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
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Provas Bioquímicas II 
Objetivos: reconhecer as principais exoenzimas sintetizadas pelas bactérias e descrever as suas 
funções biológicas, por meio dos testes bioquímicos. Interpretar as alterações que ocorrem nos 
diferentes meios de cultura em decorrência da produção dessas enzimas. Relacionar a síntese de 
exoenzimas com os procedimentos de caracterização e identificação de bactérias. 
PROCEDIMENTO: 
Sobre a bancada de cada dupla encontram-se diversos meios de cultura e culturas puras em 
ágar das seguintes bactérias: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus 
epidermidis, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa. 
1 - TESTE DA CATALASE 
Semear com auxílio da alça de platina as 
bactérias Staphylococcus aureus nos tubos 
que contém caldo s imples (MH) e 
Enterococcus faecalis nos tubos que contém 
caldo simples BHI. Incubar “overnight” a 
370C. 
2 - TESTE DA GELATINASE 
Semear com auxílio do fio de platina as 
bactérias E. coli e Pseudomonas aeruginosa 
nos tubos que contém caldo gelatina. 
Incubar “overnight” a 370C.
3 - TESTE DA COAGULASE 
Semear com auxílio do fio de platina as 
bactér ias Staphylococcus aureus e 
Staphylococcus epidermidis nos tubos que 
contém plasma humano desfibrinado. 
Incubar “overnight” a 370C. 
4 - TESTE DE HEMÓLISE 
S e m e a r p o r m e i o d a t é c n i c a d e 
esgotamento as bactérias Staphylococos 
aureus ou Bacillus subitlis nas placas de 
ágar sangue. Incubar “overnight” a 370C. 
5 - TESTE DA AMILASE 
Dividir a placa de ágar amido em dois setores e semear em um dos setores a bactéria E. 
coli e no outro setor Bacillus subtilis. Incubar “overnight” a 370C. 
 20
Análise dos resultados: 
 
1 - TESTE DA CATALASE 
Para a leitura, gotejar água oxigenada e 
observar se ocorre a formação de bolhas. 
Interpretação do resultado: 
________________________________ 
________________________________ 
________________________________ 
________________________________ 
________________________________ 
2 - TESTE DA GELATINASE 
Após a incubação, colocar no refrigerador 
por 15 minutos junto com o tubo controle 
não semeado. Observarse o meio 
apresenta-se sólido ou líquido. 
Interpretação do resultado: 
________________________________ 
________________________________ 
________________________________ 
________________________________ 
3 - TESTE DA COAGULASE 
Observar a presença ou a ausência de 
coágulo. 
Interpretação do resultado: 
________________________________ 
________________________________ 
________________________________ 
________________________________ 
4 - TESTE DE HEMÓLISE 
Observar se houve a formação de um halo 
transparente ao redor das colônias. 
Interpretação do resultado: 
________________________________ 
________________________________ 
________________________________ 
________________________________ 
5 - TESTE DA AMILASE 
Para a leitura adicionar uma fina camada de lugol deixando agir por 1 minuto. Observar a 
presença de coloração escura no meio e ao redor das colônias. 
Interpretação do resultado: 
___________________________________________________________________ 
___________________________________________________________________ 
___________________________________________________________________ 
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Estudo da microbiota das mãos 
Objetivos: verificar a presença de micro-organismos nas mãos e suas fontes de contaminação. 
Enfatizar a importância das medidas associadas à prática de higienização das mãos para garantir a 
segurança e qualidade do serviço prestado. 
PROCEDIMENTOS: 
A turma será dividida em duplas e cada dupla será denominada por um dos seguintes grupos: 
Grupo I: Mão limpa e álcool 70o 
Grupo II: Mão suja e álcool 70o 
Grupo III: Mão limpa e clorexidina 
Grupo IV: Mão suja e clorexidina 
Grupo V: Mão limpa e PVPI 
Grupo VI: Mão suja e PVPI 
Sobre a bancada de trabalho encontra-se uma placa de Petri estéril que contém ágar nutriente. 
Para os grupos I, III e V seguir os seguintes passos: 
Dividir o fundo da placa de ágar nutriente em 4 setores e numerá-los. Um aluno da dupla irá 
fazer o desenvolvimento do experimento. Sem lavar as mãos e sob condições assépticas, abrir a placa 
e executar a seguinte sequência: 
1 – tocar com o dedo indicador a superfície do ágar no setor I; 
2 – a seguir, lavar as mãos com água e sabão por 1 minuto, secar com papel toalha estéril e tocar 
com o dedo indicador a superfície do ágar no setor II; 
3 – utilizando-se de um antisséptico (álcool 70 , clorexidina ou PVPI), colocar aproximadamente 3 mL 
nas mãos e friccionar bem o dedo indicador e aguardar secar naturalmente e tocar no setor III; 
4 – tocar em um objeto, cumprimentar uma pessoa, pegar no celular, no rosto, cabelo e tocar no 
setor IV. Identificar a placa com nome da dupla, curso e turma e grupo e incubar a 370C. 
Para os grupos II, IV e VI seguir os seguintes passos: 
Dividir o fundo da placa de ágar nutriente em 3 setores e numerá-los. Um aluno da dupla irá 
fazer o desenvolvimento do experimento. Sem lavar as mãos e sob condições assépticas, abrir a placa 
e executar a seguinte sequência: 
1 – tocar com o dedo indicador a superfície do ágar no setor I; 
2 – utilizando-se de um antisséptico (álcool 70 , clorexidina ou PVPI), colocar aproximadamente 3 mL 
nas mãos e friccionar bem o dedo indicador e aguardar secar naturalmente e tocar no setor II; 
3 – tocar em um objeto, cumprimentar uma pessoa, pegar no celular, no rosto, cabelo e tocar no 
setor III. Identificar a placa com nome da dupla, curso e turma e grupo e incubar a 370C. 
Análise dos Resultados: 
Baseando-se no número e tipos de colônias que se apresentam em cada setor, faça sua 
conclusão do experimento. 
 22
CONTROLE DA POPULAÇÃO MICROBIANA ATRAVÉS DE MÉTODOS FÍSICOS 
Objetivos: identificar os métodos físicos e químicos empregados para o controle da população de 
micro-organismos bem como as suas limitações quanto ao potencial antimicrobiano. 
PROCEDIMENTO: 
1 – Efeito da luz UV: Encontram-se sobre a bancada uma cultura de bactérias, duas placas de ágar 
nutriente estéreis, swabs, papel e uma tesoura. Fazer um desenho vazado (Figura 13) no centro dos 
dois papeis brancos e certificar-se de que a extensão dos papeis exceda o diâmetro da placa de Petri. 
Identificar as placas, sendo uma denominada com tampa e a outra sem tampa. Com o auxílio do 
swab, semear a bactéria distribuindo-a uniformemente por toda superfície do ágar. Colocar as placas 
dentro da câmera de UV. Remover as tampas das placas já semeadas e colocar os papéis com o 
desenho vazado em ambas as placas de tal forma que o desenho fique centralizado. Colocar a tampa 
sobre a placa denominada com tampa e deixar a outra placa sem tampa, só com o papel. Expor à luz 
ultravioleta as placas durante 10 minutos. 
 
Figura 10: Desenho vazado 
Resultados: 
1 – Efeito da luz UV: Observar se houve crescimento, se o crescimento foi uniforme ou se houve 
falhas (formação de desenho). 
a) Placa com tampa:_______________________________________________________ 
b) Placa sem tampa: _______________________________________________________ 
2 - Conclusões: 
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________ 
 23
 
Referências Bibliográficas 
1. HARVEY, R.A.; CHAMPE, P.C.; FISHER, B, D. Microbiologia ilustrada. 2.ed. Porto Alegre: 
Artmed, 2008. 
2. HAUSER, A.R. Antibióticos na prática clínica. 1. ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. 
3. JAWETZ, E.; MELNICK, J.L.; ADELBERB, E.A. Microbiologia médica. 21. ed. Rio de Janeiro: 
Guanabara Koogan, 2000. 
4. MURRAY, P.R.; ROSENTHAL, K.S.; PFALLER, M.A. Microbiologia médica. 5. ed. Rio de 
Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. 
5. OPLUSTIL, C.P., Zoccoli, C.M.; Tobouti, N.R.; Sinto, S.I. Procedimentos básicos em 
microbiologia clínica. 2. ed. São Paulo: Sarvier, 2004. 
6. PELCZAR, JR., M.J. CHAN, E.C.S.; KRIEG, N.R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2. 
ed. São Paulo: Makron Books, v.1 e 2, 1996. 
7. RIBEIRO, M.C.; SOARES, M.M.S.R. Microbiologia prática roteiro e manual. São Paulo: 
Atheneu, 2000. 
8. ROSSETTI, M.L.; SILVA, C.M.D.; RODRIGUES, J.J.S. Doenças infecciosas: diagnóstico 
molecular. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. 
9. ROITT, I.M.; MIMS, C.A.; PLAYFAIR, J.H.I.; WAKELIN, D.; WILLANS,R. Microbiologia 
médica. São Paulo: Manole,1995. 
10.TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2000. 
11. TRABULSI, L.R; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 5. ed. Rio de Janeiro: Atheneu, 2008. 
12. WINN, J.R., W.; ALLEN, S.D.; JANDA, W.M.; KONEMAN, E.; PROCOP, G.; SHRECKENBERGER, 
P.C. WOODS, G. Koneman Diagnóstico microbiológico: Texto e atlas colorido. 6. ed. 
Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. 
 24
	Normas de segurança no Laboratório de Microbiologia
	Meios de Cultura
	Presença de Micro-organismos no Ambiente
	Características do Crescimento Bacteriano
	Figura 1: Características do crescimento bacteriano – A: Em caldo; B – Em ágar
	Figura 2: Descrição morfológica das colônias em Microbiologia
	Bacterioscopia - Coloração simples
	Figura 3: Técnica de preparo do esfregaço, fixação e coloração de células para a observação microscópica.
	Noções Básicas de Assepsia
	Figura 4- Posição correta para a flambagem da alça ou fio
	Bacterioscopia - Coloração diferencial – Coloração de Gram
	Técnicas de semeadura e isolamento de bactérias
	Figura 5: Transferência asséptica para um tubo de cultura.
	Figura 6: Técnica de semeadura por esgotamento para obtenção de colônias isoladas
	Adaptações de Meios para o Estudo dos Micro-organismos
	Figura 7: Tipo de semeadura nas placas
	Antibiograma
	Figura 8: Semeadura convergente para teste de sensibilidade a antimicrobianos (TSA)
	Figura 9: Distribuição dos discos de antimicrobianos na placa semeada
	Provas Bioquímicas I
	Provas Bioquímicas II
	Estudo da microbiotadas mãos
	Controle da população microbiana através de métodos físicos
	Figura 10: Desenho vazado
	Referências Bibliográficas