Capitulo 4 Análise instrumental

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Capítulo 4
 
 
 
 
 
 	Espectroscopia de Fluorescência Molecular no UV-VIS
Luminescência molecular
Fotoluminescência
excitação  absorção de fótons
geralmente a radiação emitida tem comprimento de onda maior do que o da radiação absorvida na excitação
Fluorescência
tempo médio de vida no estado excitado 10-5 s
não há alteração no spin do elétron
Fosforescência
tempo médio de vida no estado excitado >10-5 s
inversão de spin do elétron
Quimiluminescência
emissão de radiação por parte de espécies excitadas formadas durante uma reação química
número de reações químicas que produzem quimiluminescência é pequeno  técnica aplicada a um número pequeno de substâncias
método simples, seletivo e com alta sensibilidade
aplicação à química analítica é recente
Características das técnicas luminescentes
alta sensibilidade
limites de detecção  três ordens de grandeza menores do que os da absorção molecular (nível de ppb)
sujeitos a interferências de espécies presentes na matriz
faixa linear de concentrações mais amplas
menos acurados e precisos que absorção molecular no UV/VIS
campo de aplicação menor  número de espécies que possuem propriedades luminescentes é pequeno
Teoria da fluorescência e da fosforescência
Molécula no estado fundamental
todos os elétrons emparelhados  estado eletrônico singlet
não há desdobramento de energia dos níveis eletrônicos em presença de campo magnético externo

_____________________________________________________________________________________
 fundamental  singlet
Radicais livres
presença de elétron desemparelhado  estado eletrônico dublet
desdobramento de energia  duas orientações do spin eletrônico em presença de campo magnético externo

______________________________________________________________________________________________
 fundamental  dublet
Moléculas no estado excitado
par eletrônico excitado
Singlet  não há inversão de spin eletrônico
Triplet  inversão de spin  elétrons excitados  não emparelhados

__________________________________________________________
fundamental  singlet

 
________________________________________________
excitado  singlet

 
________________________________________________
excitado  triplet
Transição singlet  triplet é menos provável que a
 singlet  singlet 

tempo médio de vida no estado excitado triplet (>10-4 s) é maior do que no singlet (10-5 a 10-8 s)
Processos de relaxação
relaxação não radiativa
relaxação radiativa  fluorescência ou fosforescência
processo predominante  minimizar o tempo de vida no estado excitado
Diagramas de energia para sistema fotoluminescente
Relaxação não radiativa
Relaxação ou desativação vibracional
colisões entre moléculas excitadas e moléculas do solvente 
excesso de energia vibracional  transferido para moléculas do solvente numa série de etapas  pequeno aumento da temperatura do meio
processo muito rápido  tempo de vida no estado vibracional excitado < 10-12 s

Se ocorrer fluorescência  transição do nível vibracional de menor energia do nível eletrônico excitado para qualquer nível vibracional do nível eletrônico fundamental
Diagramas de energia para sistema fotoluminescente
Conseqüência  banda de fluorescência de uma dada transição eletrônica aparece a  maiores do que os da banda de absorção  deslocamento de Stokes
absorção
emissão
Conversão interna
relaxação do nível vibracional de menor energia de um nível eletrônico excitado para um outro nível eletrônico de menor energia sem emitir radiação
processo menos eficiente que a desativação vibracional  tempo de vida no nível eletrônico excitado  10-6 a 10-8 s, mas é mais eficiente que fluorescência
mecanismo não completamente conhecido e compreendido
processo particularmente eficiente quando os dois níveis de energia são suficientemente próximos  sobreposição de energia dos níveis vibracionais
Diagramas de energia para sistema fotoluminescente
Conseqüência  Absorção  bandas centradas em 1, 2  banda de fluorescência  3
Espectros de absorção e fluorescência de solução de quinina
Conversão externa
processo também pouco conhecido
interação e transferência de energia entre a molécula excitada e moléculas do solvente ou outro soluto 
evidências do processo  influência da T, do tipo de solvente e da sua viscosidade nas características da fluorescência
Diagramas de energia para sistema fotoluminescente
Cruzamento intersistema
processo que provoca inversão de spin no estado excitado
S1  T1		(S0  T1 é transição proibida)
processo eficiente quando há sobreposição de energia dos níveis vibracionais de S1 e T1
favorecido pela presença de átomos pesados (iodo, bromo) na molécula
Diagramas de energia para sistema fotoluminescente
Relaxação radiativa
Fluorescência
retorno da molécula de um nível eletrônico excitado do tipo singlet para o nível fundamental com emissão de radiação eletromagnética
como podem retornar para qualquer nível vibracional do nível eletrônico fundamental  espectro fluorescência molecular  bandas formadas por uma série de linhas próximas cuja resolução é difícil
Linhas de ressonância 
radiação emitida  mesma energia (mesmo ) que a radiação absorvida
Diagramas de energia para sistema fotoluminescente
Deslocamento de Stokes
radiação emitida  menor energia (maior ) que a radiação absorvida
parte da energia da absorção é dissipada por processo de relaxação não radiativa (relaxação vibracional) que ocorre a taxa elevada
se a conversão interna é pouco importante  espectros de absorção e fluorescência  imagens especulares aproximadas e se sobrepõem pela linha de fluorescência de ressonância
Espectro de fluorescência para solução 1 ppm de antraceno em álcool.
(a) absorção; (b) emissão.
Se a conversão interna é importante  fluorescência observada do nível vibracional de menor energia do primeiro nível eletrônico excitado para qualquer nível vibracional do estado fundamental
Espectros de absorção e fluorescência de solução de quinina
Diagramas de energia para sistema fotoluminescente
Fosforescência
retorno da molécula de um nível eletrônico excitado do tipo triplet para o estado fundamental com emissão de radiação eletromagnética
transição T1  S0  baixa probabilidade  tempo médio no estado excitado T1 é relativamente grande (>10-4 s)
compete, com pouco sucesso, com os processos de conversão interna e externa  no de espécies fosforescentes é muito pequeno
fosforescência  temperaturas baixas, meio viscoso, moléculas adsorvidas em sólidos  características que dificultam os processos de conversão interna e externa
Espectrometria de Fluorescência Molecular
Eficiência quântica ou rendimento quântico ()
teoricamente todas as espécies que absorvem radiação UV/VIS deveriam fluorescer

na prática só poucas são fluorescentes

estrutura molecular favorece a relaxação por processos não radiativos que ocorrem a taxas maiores do que a fluorescência
Eficiência ou rendimento quântico
		ou
		
sendo:	kf = constante da taxa de relaxação por fluorescência
	kr = soma das constantes das taxas de relaxação por 	processos não radiativos
Fluorescência e estrutura
Principais moléculas fluorescentes:
presença de anéis aromáticos
outras: compostos carbonílicos
 	compostos com duplas ligações conjugadas
 
Transições   *  maior eficiência na fluorescência
	  		no de anéis aromáticos 
		grau de condensação dos anéis 

		heterocíclicos simples não fluorescem
	Não fluorescem					
	piridina	furano	tiofeno		pirrol	
	Exibem fluorescência					
	quinolina	isoquinolina		indol		
Presença de substituintes no anel  deslocamento das bandas de fluorescência e influência sobre a eficiência de fluorescência
		 (nm)		 	Substância	 (nm)	
	Benzeno	270-310	10	 	Fenolato	310-400	10
	Tolueno	270-320	17	 	Anisol	285-345	20
	Propilbenzeno	270-320	17	 	Anilina	310-405	20
	Fluorbenzeno	270-320	10	 	Anilínio-	0
	Clorobenzeno	275-345	7	 	Ac. Benzóico	310-390	3
	Bromobenzeno	290-380	5	 	Benzonitrila	280-360	20
	Iodobenzeno	-	0	 	Nitrobenzeno	-	0
	Fenol	285-365	18	 	 	 	 
Efeito dos grupos substituintes na fluorescência do anel benzênico
Efeito da rigidez da estrutura
Fluorescência  favorecida por moléculas com estruturas rígidas
Ex 1)
 = 1
 = 0,2
aumento da rigidez da estrutura pela ponte metilênica entre os dois anéis aromáticos

redução na taxa de relaxação não radiativa e a fluorescência acaba ocorrendo a taxa maior
Ex 2)
	 Agentes complexantes orgânicos
não fluorescente
fluorescente
Ex. 3)
	Espécies fluorescentes adsorvidas em sólidos  eficiên-cia de fluorescência aumentada
Efeito da temperatura
T 	 	 aumento da probabilidade de colisões favorecendo aos processos de relaxação não radiativa (conversão externa)	
Efeito do solvente
Viscosidade 	 	 aumento da probabilidade de colisões intermoleculares	
Presença de átomos pesados	 	 favorecimento ao cruzamento intersistema (S1  T1)  favorece a fosforescência	
Presença de O2 dissolvido
redução na intensidade da fluorescência
oxidação fotoquimicamente induzida da espécie fluorescente
propriedades paramagnéticas do O2  promoção do cruzamento intersistema  favorece transição S1  T1 reduzindo a fluorescência
Efeito do pH na fluorescência
anéis aromáticos com substituintes com caráter ácido ou básico  fluorescência é afetada pelo pH do meio
posição das bandas e intensidade da radiação emitida  diferentes nas formas ionizada e não ionizada
estruturas de ressonância da anilina
Íon anilínio
Ex: Anilina e íon anilínio
Efeito da concentração na intensidade da fluorescência
F = K’(P0 – P)		(1)		(K’ depende de )
Sendo (2)
					
Substituindo-se (2) em (1)
F = K’P0 (1 – 10-bc)	(3)
Pela expansão do termo potencial em série de Maclaurin
Quando 	bc = A < 0,05
F = 2,3 K’ bc P0
Sendo 	P0 = constante
F = K c	
baixas concentrações  dependência linear
concentrações elevadas  A > 0,05  perda de linearidade
aumento das colisões entre moléculas excitadas

favorecimento dos processos de relaxação não radiativa (conversão externa ou interna) 

auto supressão
próprias moléculas absorvem a radiação emitida por fluorescência

redução na intensidade da radiação emitida por fluorescência

auto absorção
O teor de quinino em bebidas pode ser determinado por fluorimetria. O comprimento de onda de excitação é 350 nm e o de emissão de fluorescência onde são feitas as medidas é 450 nm. A partir de uma solução estoque de quinino com concentração 0,1 mg/L foram preparadas cinco soluções padrão , como indicado a seguir.
	Padrão nº	Volume padrão (mL)	H2SO4 0,05 mol/L (mL)	Intensidade fluorescência
	1	20	0	182
	2	16	4	138,8
	3	12	8	109,2
	4	8	12	75,8
	5	4	16	39,5
	branco	0	20	0,0
Uma alíquota de 0,1 mL da bebida foi diluida a 100 mL com a solução de H2SO4 0,05 mol/L, sendo observada uma intensidade de fluorescência igual a 113
Qual a expressão da curva de trabalho ?
Qual a concentração de quinino na bebida (mg/L) ? 
	Padrão nº	Volume padrão (mL)	H2SO4 0,05 mol/L (mL)	Intensidade fluorescência	Concentração quinino (mg/L)
	1	20	0	182	0,10
	2	16	4	138,8	0,08
	3	12	8	109,2	0.06
	4	8	12	75,8	0.04
	5	4	16	39,5	0.02
	branco	0	20	0,0	0,00
I = 2,219 + 1773,286xC
I amostra = 113
C amostra = 6,247 x 10-2 mg/L
C bebida x 0,10 = 100 x C amostra
C amostra = 62,47 mg/L
Instrumentos para medida de fluorescência
Componentes
os mesmos da espectrometria de absorção molecular no UV/VIS
Fluorímetros 
filtros para seleção dos 
Espectrofluorímetros 
filtro ou monocromador  limitar a radiação de excitação
redes de difração  dispersar a radiação de fluorescência
			
obtenção dos espectros de fluorescência
Componentes de um fluorímetro ou de um espectrofluorímetro
Características
Feixe duplo  compensar flutuações em P0
Feixe de amostra
filtro ou monocromador primário  transmitir a radiação que vai excitar a amostra e limitar os  correspondentes à fluorescência
radiação de fluorescência emitida pela amostra em todas as direções  medida num ângulo de 90o com o feixe incidente  reduzir ou eliminar o efeito do espalhamento da radiação na solução e nas paredes da célula
filtro ou monocromador de emissão
- dispersar a radiação de fluorescência
- selecionar a banda de fluorescência de interesse
Feixe de referência
Atenuador  reduzir a intensidade a um nível similar ao da radiação fluorescente
Comercialmente vários modelos
grau de sofisticação  		preço 
Fluorímetros
mais adequados para análises quantitativas  maior sensibilidade
simples e de fácil utilização
custo baixo
Componentes
Fontes
maior intensidade que as da espectrometria de absorção no UV/VIS
Fluorímetros
Lâmpada de vapor de Hg  linhas de excitação  254 – 302 – 313 – 546 – 578 – 691 e 773 nm  isoladas por filtros 
Compostos fluorescentes  fluorescência é induzida por diferentes  e pelo menos um destes será adequado
Espectrofluorímetros
Lâmpada de arco de Xe de alta pressão  espectro contínuo 300 - 1300 nm
Filtros e monocromadores
idênticos aos dos instrumentos para medida da absorção no UV/VIS
Células e compartimentos para amostras
Células 
cilíndricas ou retangulares
vidro ou sílica fundida
Compartimento de célula 
design adequado de modo a reduzir a incidência de radiação espalhada
Detectores
Sinal de luminescência baixa intensidade detector altamente sensível 
Tubos fotomultiplicadores (operação sob resfriamento)
Rede de diodos
Transferência de carga acoplada (CCD)
Instrumentos típicos
Representação esquemática de um fluorímetro
Representação esquemática de um espectrofluorímetro
Fenômeno observado quando:
excitação = emissão
Padronização dos instrumentos
Fluorímetros / espectrofluorímetros  potência da fonte e sensibilidade do detetor  podem variar de um dia para outro

padronização dos instrumentos de modo a obter-se um nível de sensibilidade reprodutível
Solução padrão de sulfato de quinina 10-5 mol/L
(excitada a 350 nm  fluoresce a 450 nm)
Perkin Elmer

kit com 6 padrões
Aplicações da fluorescência molecular
Espécies inorgânicas
cátion ou ânion  extraído para solução orgânica imiscível com agente quelante  fluorescência da solução orgânica é medida
Métodos diretos
analito + agente quelante  complexo com propriedades fluorescentes
determinação de cátions
Analito + complexante Complexo fluorescente 
Intensidade
Concentração analito
58
Métodos indiretos 
redução na emissão de fluorescência de um dado reagente em função da sua reação com o analito
determinação de ânions
 
Concentração analito
Complexo fluorescente + Analito Complexo que não fluoresce
Intensidade
Estruturas dos agentes complexantes mais comuns
	8-hidróxi-quinolina	alizarina garnet R
	flavanol	benzoína
Métodos fluorímétricos selecionados para espécies inorgânicas
	Íon	Reagente	 (nm)		S (g/mL)	Interferentes
			Abs	F		
	Al3+	alizarina garnet R	470	500	0,007	Be, Co, Cr, Cu, F-, NO3-, Ni, PO43-, Th, Zr
	F-	auto-supressão do complexo acima	470	500	0,001	Be, Co, Cr, Cu, Fe, Ni, PO43-, Th, Zr
	B4O7-	benzoína	370	450	0,04	Be, Sb
	Cd2+	2-(o-hidróxifenil-benzoxazola)	365	azul	2	NH3
	Li+	8-hidroxiquinolina	370	580	0,2	Mg
	Sn4+	flavanol	400	470	0,1	F-, PO43-, Zr
	Zn2+	benzoína	-	verde	10	B, Be, Sb e íons corados
OBS:
Íons de metal de transição 
formação de complexos que absorvem no UV/VIS  relaxação não radiativa é tão rápida (eficiente)  não fluorescem
muitos são paramagnéticos  favorece os cruzamentos intersistemas para estado excitado triplet  fluorescência pouco provável (aumenta a tendência a fosforescência)
Íons de metais não de transição  não formam complexos que absorvam radiação na região UV/VIS, mas seus complexos com quelantes orgânicos adequados  fluorescentes
FLUORESCÊNCIA MOLECULAR + ABSORÇÃO MOLECULAR NO UV/VIS

complementares para determinação de cátionsSubstâncias orgânicas/ bioquímicas 
Fluorescência  campo de aplicação amplo e extremamente importante
seletividade e sensibilidade elevadas
Ex:
Determinação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, adenina, guanidina, indol, naftol, proteínas, aminoácidos, produtos alimentares e farmacêuticos, produtos naturais
image1.jpeg
image2.jpeg
image3.jpeg
image4.wmf
excitadas
 
moléculas
 
de
 
total
 
n
fluorescem
 
que
 
moléculas
 
de
 
n
o
o
=
F
image5.wmf
r
f
f
k
k
k
+
=
F
oleObject1.bin
oleObject2.bin
image6.wmf
N
image7.wmf
O
image8.wmf
S
image9.wmf
N
H
image10.wmf
N
image11.wmf
N
image12.wmf
N
H
image13.wmf
image14.wmf
image15.wmf
N
OH
image16.wmf
Zn
N
O
2
image17.wmf
N
image18.wmf
N
_
image19.wmf
N
_
image20.wmf
N
+
image21.wmf
bc
-
0
10
P
P
e
=
image22.wmf
(
)
(
)
(
)
.........
 
-
 
!
 
3
bc
 
2,3
 
-
 
-
 
!
 
2
bc
 
2,3
 
-
 
-
 
bc
 
2,3
 
-
 
P
 
'
K
F
3
2
0
e
e
e
=
oleObject3.bin
oleObject4.bin
image23.wmf
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0
2
4
6
8
10
12
14
16
 
 
Intensidade
Concentração
oleObject5.bin
oleObject6.bin
image24.wmf
0,000
0,025
0,050
0,075
0,100
0,125
0
50
100
150
200
Intensidade de fluorescência
Concentração de quinino (mg/L)
Equation
y = a + b*x
Adj. R-Square
0,9972
Value
Standard Error
B
Intercept
2,21905
2,54582
B
Slope
1773,28571
42,04282
oleObject7.bin
image25.jpeg
image26.jpeg
image27.jpeg
image28.jpeg
image29.png
image30.jpeg
image31.wmf
N
OH
image32.wmf
O
O
OH
image33.wmf
HO
N
N
OH
HO
SO
3
Na
image34.wmf
C
C
H
OH
O