Impacto da Rinite Alérgica

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2022/2023 
 
 
 
 
 
Maria Inês Ribeiro da Rocha 
Impacto da rinite alérgica na atividade da sinaptofisina na via olfativa 
Impact of allergic rhinitis on synaptophysin activity in the olfactory pathway 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FEVEREIRO, 2023 
 
 
 
 
 
 
 
Maria Inês Ribeiro da Rocha 
Impacto da rinite alérgica na atividade da sinaptofisina na via olfativa 
Impact of allergic rhinitis on synaptophysin activity in the olfactory pathway 
 
 
 
Mestrado Integrado em Medicina 
 
 
Área: 3.1 Medicina Básica 
Tipologia: Dissertação 
 
 
Trabalho efetuado sob a Orientação de: 
Dr. Jorge Filipe Miranda Rodrigues 
E sob a Coorientação de: 
 Professor Doutor Kristof René Gerarda Raemdnock 
 
 
Trabalho organizado de acordo com as normas da revista: 
Physiology & Behavior 
 
 
 
 
FEVEREIRO, 2023 
 
 
UC Dissertação/Projeto (6º Ano) - DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE 
 
 
 
 
Eu, Maria Inês Ribeiro da Rocha, abaixo-assinado, nº mecanográfico 201705610, estudante do 6º 
ano do Ciclo de Estudos Integrado em Medicina, na Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 
declaro ter atuado com absoluta integridade na elaboração deste projeto de opção. 
Neste sentido, confirmo que NÃO incorri em plágio (ato pelo qual um indivíduo, mesmo por omissão, 
assume a autoria de um determinado trabalho intelectual, ou partes dele). Mais declaro que todas as 
frases que retirei de trabalhos anteriores pertencentes a outros autores, foram referenciadas, ou 
redigidas com novas palavras, tendo colocado, neste caso, a citação da fonte bibliográfica. 
 
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 06 / 02 / 2023 
 
Assinatura conforme cartão de identificação: 
________________________________________________ 
 
UC Dissertação/Projeto (6º Ano) – DECLARAÇÃO DE REPRODUÇÃO 
 
 
NOME 
Maria Inês Ribeiro da Rocha 
 
NÚMERO DE ESTUDANTE E-MAIL 
201705610 mariainesrr23@gmail.com 
 
DESIGNAÇÃO DA ÁREA DO PROJECTO 
3.1 Medicina Básica 
 
TÍTULO DISSERTAÇÃO/MONOGRAFIA (riscar o que não interessa) 
Impacto da rinite alérgica na atividade da sinaptofisina na via olfativa 
 
ORIENTADOR 
Jorge Filipe Miranda Rodrigues 
 
COORIENTADOR (se aplicável) 
Kristof René Gerarda Raemdnock 
 
ASSINALE APENAS UMA DAS OPÇÕES: 
É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO INTEGRAL DESTE TRABALHO APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, 
MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE. 
 
É AUTORIZADA A REPRODUÇÃO PARCIAL DESTE TRABALHO (INDICAR, CASO TAL SEJA NECESSÁRIO, Nº 
MÁXIMO DE PÁGINAS, ILUSTRAÇÕES, GRÁFICOS, ETC.) APENAS PARA EFEITOS DE INVESTIGAÇÃO, 
MEDIANTE DECLARAÇÃO ESCRITA DO INTERESSADO, QUE A TAL SE COMPROMETE. 
 
DE ACORDO COM A LEGISLAÇÃO EM VIGOR, (INDICAR, CASO TAL SEJA NECESSÁRIO, Nº MÁXIMO DE 
PÁGINAS, ILUSTRAÇÕES, GRÁFICOS, ETC.) NÃO É PERMITIDA A REPRODUÇÃO DE QUALQUER PARTE DESTE 
TRABALHO. 
 
 
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, 06 / 02 / 2023 
 
Assinatura conforme cartão de identificação: ______________________________________________ 
 X 
AGRADECIMENTOS 
 
Findado o presente projeto de investigação, urge a necessidade de agradecer a 
quem contribuiu de forma essencial para o sucesso da sua realização. 
Começo por agradecer à Professora Doutora Maria Dulce Madeira, Diretora do 
Instituto de Anatomia da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, por 
me ter aceitado nesta instituição para a realização deste projeto. 
Agradeço ao Dr. Jorge Miranda Rodrigues, meu orientador, todo o empenho, 
disponibilidade e paciência que demonstrou ao longo de todo o processo, ao 
orientar-me no caminho certo para a realização deste trabalho de investigação. 
Agradeço ao Professor Doutor Kristof Raemdock, meu coorientador, pela sua 
disponibilidade e colaboração na execução de procedimentos práticos e revisão 
deste projeto. 
Agradeço ainda, à Professora Doutora Susana Sá por me ter orientado no início 
deste trabalho e pela prontidão com que sempre me ajudou ao longo deste 
projeto e ao Professor Doutor Armando Cardoso pela ajuda nos testes 
comportamentais. 
Finalmente, agradeço aos que mais me aconchegam o coração: aos meus pais, 
Conceição Ribeiro e Adão Rocha, por estarem sempre ao meu lado, mesmo 
quando não entendiam uma palavra; ao meu irmão, Luís Miguel Rocha, por me 
fazer acreditar que a vida também pode ser um filme; e ao meu amigo, João 
Pedro Moreira, pela amizade desmedida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“You do what your heart says you have to. 'Cause you don't owe anyone 
your life.” 
The Fabelmans (2022) 
 
"Sometimes it is the people no one imagines anything of who do the things 
that no one can imagine." 
The Imitation Game (2014) 
 
 1 
ÍNDICE 
ABREVIATURAS .................................................................................................... 3 
RESUMO ............................................................................................................. 4 
ABSTRACT ............................................................................................................ 6 
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 8 
2. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................11 
2.1. ANIMAIS ........................................................................................................... 11 
2.2. RINITE ALÉRGICA INDUZIDA PELA OVALBUMINA............................................ 11 
2.3. CONTABILIZAÇÃO DE SINTOMAS ..................................................................... 12 
2.4. ESTUDOS COMPORTAMENTAIS ....................................................................... 12 
 2.4.1. BURRIED FOOD TEST ............................................................................... 12 
 2.4.2. AGGRESSIVE BEHAVIOR TEST .................................................................. 13 
2.5. TOTAL DE IgE .................................................................................................... 13 
2.6. COLHEITA DE TECIDO ....................................................................................... 13 
2.7. HISTOLOGIA ..................................................................................................... 14 
2.8. IMUNOFLUORESCÊNCIA .................................................................................. 15 
2.9. PROCESSAMENTO DE IMAGENS ...................................................................... 15 
2.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................... 16 
3. RESULTADOS ...................................................................................................17 
3.1. PESO CORPORAL E DOS ORGÃOS .................................................................... 17 
3.2. CONFIRMAÇÃO DO MODELO DE RINITE ALÉRGICA ........................................ 17 
3.3. EFEITO DA RINITE ALÉRGICA NO COMPORTAMENTO ..................................... 18 
 2 
 3.3.1. AVALIAÇÃO DO OLFATO ......................................................................... 18 
 3.3.2. COMPORTAMENTOS AGRESSIVOS E DEFENSIVOS .................................. 18 
3.4. EFEITO DA RINITE ALÉRGICA NA ESTRUTURA SINÁPTICA ............................... 18 
 3.4.1. EFEITO DA RINITE ALÉRGICA NA ESTRUTURA SINÁPTICA NO BOLBO 
OLFATIVO ................................................................................................................ 18 
 3.4.2. EFEITO DA RINITE ALÉRGICA NA ATIVIDADE SINÁPTICA DO NÚCLEO 
OLFATIVO ANTERIOR E CÓRTEX PIRIFORME .......................................................... 19 
 3.4.3. EFEITO DA RINITE ALÉRGICA NA ATIVIDADE SINÁPTICA DO CÓRTEX PRÉ-
FRONTAL ................................................................................................................. 19 
4. DISCUSSÃO.....................................................................................................20 
5. REFERÊNCIAS ..................................................................................................25 
TABELAS E FIGURAS ...........................................................................................32 
 
 
 
 
 
 
 3 
ABREVIATURAS 
 
 
BO – bolbo olfativo 
CCM – camada de células mitrais 
CG – camada glomerular 
CPE – camada plexiforme externa 
CPF – córtex pré-frontal 
CPI – camada plexiforme interna 
CPir – córtex piriforme 
IgE – imunoglobulina E 
NOA – núcleo olfativo anterior 
NSO – neurónios sensitivos olfativos 
OVA – ovalbumina 
RA – rinite alérgica 
SNC – sistema nervoso central 
Syn – sinaptofisina 
 
 4 
RESUMO 
 
 
Introdução: A rinite alérgica (RA) tem vindo a ser apontada como uma causa de 
disfunção olfativa. Para além dos sintomas clássicos, a RA também foi associada 
a alterações do padrão normal de sono, diminuição do desempenho cognitivo e 
maior probabilidade de depressão e ansiedade. Apesar dos mecanismos 
subjacentes a estas associações permanecerem indeterminados, a via olfativa 
tem sido proposta como possível ligação entre a inflamação nasal crónica e a 
ocorrência de alterações no sistema nervoso central. Assim, este trabalho tem 
como objetivo investigar a influência da RA na atividade da sinaptofisina na via 
olfativa e no córtex pré-frontal (CPF), por imuno-histoquímica, num modelo 
animal de RA. Pretendemos ainda avaliar a influência da RA na função olfativa 
e em comportamentos de agressividade, em ratos com RA. 
 
Métodos: Foi replicado um modelo de RA em ratos machos Wistar, por 
sensibilização com a ovalbumina (OVA). Após os testes olfativos e 
comportamentais, estudamos a estrutura sináptica do bolbo olfativo (BO), núcleo 
olfativo anterior (NOA), CPir e CPF, através da deteção da marcação de 
sinaptofisina (Syn) por imunofluorescência. 
 
Resultados: Verificou-se uma diminuição significativa da marcação de Syn na 
camada glomerular (CG) do BO e no CPF, em ratos com RA. Além disso, a 
avaliação olfativa revelou disfunção olfativa significativa no grupo da RA. Os 
testes comportamentais demonstraram um predomínio de comportamentos 
defensivos em ratos com RA. 
 5 
 
Conclusões: Neste trabalho verificou-se que a RA influencia a atividade da Syn 
na via olfativa e no CPF, levando a diminuição da função olfativa e alterando o 
comportamento de agressividade dos ratos com RA. 
 
Palavras-chave: Rinite alérgica, sinaptofisina, hiposmia, agressividade, bolbo 
olfativo, córtex pré-frontal. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 6 
ABSTRACT 
 
Introduction: Allergic rhinitis (AR) has been pointed out as a cause of olfactory 
dysfunction. In addition to the classic symptoms, AR has also been associated 
with alterations in the normal sleep pattern, decreased cognitive performance and 
increased likelihood of depression and anxiety. Although the mechanisms 
underlying these associations remain undetermined, the olfactory pathway has 
been proposed as a possible link between chronic nasal inflammation and the 
occurrence of changes in the central nervous system. Thus, this study aims to 
investigate the influence of AR on synaptophysin activity in the olfactory pathway 
and prefrontal cortex, by immunohistochemistry, in an animal model of AR. We 
also aimed to evaluate the influence of AR on olfactory function and aggressive 
behaviors in mice with AR. 
 
Methods: An AR model was replicated in male Wistar rats by sensitization with 
ovalbumin. After olfactory and behavioral tests, we studied the synaptic structure 
of the olfactory bulb, anterior olfactory nucleus, piriform cortex, and prefrontal 
cortex, by detecting synaptophysin (Syn) labeling by immunofluorescence. 
 
Results: There was a significant decrease in Syn labeling in the glomerular layer 
of the olfactory bulb and in the prefrontal cortex, in rats with AR. Moreover, 
olfactory evaluation revealed significant olfactory dysfunction in the AR group. 
Behavioral tests showed a predominance of defensive behaviors in AR rats. 
 
Conclusions: In this study we found that AR influences the activity of Syn in the 
 7 
olfactory pathway and CPF, leading to decreased olfactory function and altering 
the aggressive behavior of rats with AR. 
 
Keywords: Allergic rhinitis, synaptophysin, hyposmia, aggressive behavior, 
olfactory bulb, prefrontal cortex. 
 
 
 
 
 
 8 
1. INTRODUÇÃO 
A rinite alérgica (RA) é uma doença inflamatória crónica da mucosa nasal, 
mediada por imunoglobulina E (IgE)1, como resposta à exposição a 
determinados alergénios. A interação dos alergénios com as IgE específicas das 
células mediadoras (basófilos e mastócitos) resulta na libertação de mediadores 
inflamatórios, entre os quais a histamina, os leucotrienos e a proteína catiónica 
eosinófila, responsáveis pela resposta alérgica2. Esta resposta alérgica, a nível 
nasal, caracteriza-se por sintomas como rinorreia, congestão nasal, espirros, 
prurido e hipósmia1. 
A RA é uma doença crónica muito prevalente2, embora seja frequentemente 
subdiagnosticada3. Afeta cerca de 40% da população mundial4 e atinge todas as 
faixas etárias, mas apresenta um pico de incidência na adolescência5. 
Apesar da RA não constituir uma doença grave, pode condicionar sintomas 
limitantes, com impacto no padrão habitual do sono, na qualidade de vida e na 
produtividade no trabalho e na escola5,7,9. Para além do mais, estudos prévios 
sugerem uma associação entre as doenças alérgicas e certas doenças mentais, 
sendo que uma meta-análise recente demostrou uma maior probabilidade de 
depressão e ansiedade em pacientes com RA10. O impacto da RA parece 
influenciar também o comportamento. Vários estudos com ratos sensibilizados 
mostraram que a exposição a alergénios intranasais induziu alterações de 
comportamento13,49, verificando-se uma maior tendência para comportamentos 
de submissão e de evicção de conflito, traduzindo numa diminuição de 
agressividade13,49. 
Embora os mecanismos desta associação não se encontrem esclarecidos, 
pensa-se que a inflamação provocada pela RA poderá libertar mediadores 
 9 
celulares e moleculares, responsáveis pela ativação de mecanismos 
neuroimunes envolvidos nos circuitos da ansiedade e depressão e nas 
modificações de comportamento11,13,49. 
O sistema olfativo, pela sua anatomia e organização, constitui uma importante 
via de ligação entre o Sistema Nervoso Central (SNC) e o ambiente externo. O 
bolbo olfativo (BO), elemento central da via olfativa, recebe projeções dos 
neurónios sensitivos olfativos (NSO)14 e, por sua vez, envia axónios para 
determinadas regiões do córtex olfativo, como o córtex piriforme (CPir), a 
amígdala e o córtex entorrinal. O córtex olfativo tem ainda importantes conexões 
com o córtex pré-frontal (CPF), responsável pelo planeamento, tomada de 
decisões e comportamento social16. Estudos anteriores demonstraram que 
pacientes com lesões no CPF apresentaram maior probabilidade de 
comportamentos de agressividade, quando comparados com pacientes sem 
lesões nesta aérea, sugerindo uma maior predisposição para a impulsividade, 
agressividade e inadequação social50,51. Sabe-se também que desequilíbrios do 
sistema límbico, onde a amígdala e o CPir têm um papel importante, podem 
resultar em alterações do humor e da ansiedade15,16. 
Estudos prévios mostraram que a RA parece induzir um processo de 
neuroinflamação, influenciando a atividade do CPF22, 23,24 e justificando maiores 
níveis de ansiedade em ratos com RA11. Recorrendo a um modelo experimental 
em rato, foi anteriormente proposto que a resposta alérgica decorrente da RA 
pode perturbar o circuito entre o BO e o CPF medial, resultando em 
comportamentos relacionados com a ansiedade e agressividade24,13, 49. 
Acresce ainda que o olfato também pareceser afetado pelo processo 
inflamatório crónico existente na mucosa nasal. Doentes com rinossinusite 
 10 
crónica evidenciaram disfunção olfativa, que permaneceu mesmo após a 
resolução da obstrução nasal, sugerindo assim que a inflamação persistente 
pode impor alterações prolongadas na via olfativa17. Estas alterações têm vindo 
a ser sugeridas como um outro mecanismo subjacente à hiposmia, para além da 
obstrução nasal6. Estudos realizados em pacientes com diagnóstico de rinite 
severa e persistente demostraram que os bolbos olfativos apresentavam menor 
volume quando avaliados em ressonância magnética21. De facto, a 
neuroinflamação também parece estar associada à perda de sinapses na via 
olfativa25. A inflamação crónica parece resultar na ativação da microglia, no 
aumento de produção de citocinas pró-inflamatórias e na perda de proteínas 
sináticas21. 
A sinaptofisina (Syn) é uma proteína sináptica que está presente nas vesículas 
pré-sinápticas das fendas sinápticas. Para além disso, é, também, um marcador 
molecular de densidade sináptica48, pelo que a quantificação da sua marcação 
consiste numa ferramenta útil para compreender a estrutura sináptica subjacente 
a alguns circuitos funcionais do sistema nervoso central. 
Este trabalho tem como objetivo investigar a influência da RA na atividade da 
Syn na via olfativa e no CPF, através de métodos imunohistoquímicos, num 
modelo animal de RA. Neste sentido, também pretendemos avaliar a influência 
da RA na função olfativa e em comportamentos de agressividade, em ratos com 
RA. 
 
 
 
 
 11 
2. MATERIAIS E MÉTODOS 
2.1. ANIMAIS 
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as recomendações da 
European Communities Council Directives, publicadas a 22 de setembro de 
2010, e da Ata Portuguesa nº113/13 e aprovados pela ORBEA, comité interno 
da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto. 
Foram utilizados ratos machos Wistar (Charles River, France) com 6 a 8 
semanas de vida. 
Os ratos foram alojados em grupos de 2, 10 ratos em cada grupo, e mantidos 
em condições padronizadas: 12 horas de ciclos luz/escuro, temperatura 
ambiente de 21ºC e humidade relativa de 45 ± 5%, com acesso livre a água e 
comida. 
 
2.2. RINITE ALÉRGICA INDUZIDA PELA OVALBUMINA 
A indução de RA em Rato baseou-se na versão adaptada de um protocolo 
previamente publicado27. Os ratos foram sensibilizados durante 2 semanas, em 
dias alternados, com ovalbumina (OVA, grau V, Sigma, 50 μg por rato, 500 μl, 
intraperitoneal) ou com solução salina (controlos), co-admistrada com AlumTM 
(Fisher Scientific Porto Salvo, Portugal) como adjuvante. 
Após a fase de sensibilização, foi administrada OVA intranasal, diariamente, 
durante 14 dias, sob anestesia com sevoflurano ao grupo de ratos da RA. O 
grupo controlo recebeu solução salina intranasal nas mesmas condições que os 
ratos sensibilizados com OVA. A administração intranasal foi executada segundo 
um protocolo já publicado27. Após a fase de instilação intranasal, os ratos foram 
submetidos a estudos comportamentais. 
 12 
Todas as manhãs, os animais foram pesados. Após a última instilação nasal (24h 
depois), os ratos foram anestesiados e sacrificados. 
 
2.3. CONTABILIZAÇÃO DE SINTOMAS 
Nos dias 14 e 27, os ratos foram colocados em gaiolas de observação, por um 
período de 10 minutos, para habituação e seguidamente foram contabilizados: o 
número de espirros, prurido nasal e gestos de higiene nasal, durante 30 minutos, 
por 3 investigadores, segundo um protocolo publicado28. 
 
2.4. ESTUDOS COMPORTAMENTAIS 
Os testes comportamentais foram realizados após 30 minutos de habituação à 
sala de testes e durante a fase de luz. No dia 23 (D23) da experiência os ratos 
foram submetidos ao aggressive behavior test e no D26 foram submetidos ao 
burried food test. 
 
2.4.1. BURIED FOOD TEST 
Este teste foi realizado com o objetivo de avaliar a capacidade olfativa para 
odores voláteis e o uso do olfato como método de procura de alimento29. Depois 
de 18 horas de privação alimentar, os ratos foram colocados na gaiola de teste 
durante 10 minutos para habituação. De seguida, retirou-se o rato da gaiola e a 
bolacha foi enterrada a cerca de 2 cm da superfície, num local aleatório, e o rato 
voltou a ser colocado na gaiola. O tempo que os ratos demoraram a localizar a 
bolacha foi registado, com um tempo máximo de procura de 15 minutos. Duas 
horas depois foi feito o mesmo teste, mas deste vez com a bolacha visível à 
superfície. 
 
 13 
2.4.2. AGGRESSIVE BEHAVIOR TEST 
Este teste tem como objetivo avaliar o tipo e a duração de comportamentos 
agressivos30. Os ratos foram mantidos sozinhos numa gaiola, sem mudar a cama 
do leito durante 5 dias. Posteriormente, um rato adulto, sexualmente inexperiente 
e mais leve que o rato de teste, foi introduzido na gaiola do rato de teste. 
O comportamento do rato teste foi gravado em vídeo durante 15 min. A análise 
da gravação determinou o tipo e duração de comportamentos ofensivos 
(perseguição, ataque, postura ereta ofensiva, ameaça lateral e sobreposição) e 
comportamentos defensivos (fuga, postura submissa e postura ereta defensiva). 
 
2.5. TOTAL DE IgE 
Após anestesia com sevoflurano e antes da perfusão com a solução de fixação 
foram colhidas amostras de sangue diretamente do coração e centrifugadas a 
2000 RPM. O soro foi recolhido, diluído numa relação de 1/1000 em tampão de 
diluição e processado em duplicado para análise de IgE total via ELISA (Abcam, 
ab157736), segundo as instruções do fabricante. 
 
2.6. COLHEITA DE TECIDO 
Os ratos foram eutanaziados por perfusão transcardíaca de 150mL de tampão 
fosfato (PB) 0,1 M e pH 7,6, para lavagem vascular, seguida de 250mL de uma 
solução fixadora com 4% de paraformaldeído em PB. 
As glândulas suprarrenais e os pulmões foram removidos e pesados. O cérebro 
foi pesado e imerso em solução fixadora durante 1h. Após a remoção das 
meninges, os hemisférios foram separados por um corte médio-sagital e 
mantidos durante a noite numa solução de sacarose a 10% em PB, a 4 °C. No 
 14 
dia seguinte, os cérebros foram transferidos para uma solução crioprotectora de 
Olmos e armazenados a -20 °C até ao processamento seguinte. 
Para a análise histoquímica, os cérebros previamente criopreservados foram 
colocados em solução salina de tampão fosfato (PBS). Os hemisférios obtidos 
foram seccionados rostralmente através da extremidade anterior dos corpos dos 
mamilares e incorporados em ágar. Os blocos de tecido obtidos foram colocados 
num vibrátomo e seccionados em série, segundo um plano coronal, com 40 μm 
de espessura, através do BO, NOA, CPir e CPF. As secções foram recolhidas 
em série, transferidos para a solução de Olmos e armazenados a -20 °C até à 
análise imuno-histoquímica. 
As cavidades nasais foram dissecadas e transferidas para 4% de 
paraformaldeído em PB durante 48h. Posteriormente foram armazenadas em 
etanol a 70% até análise posterior. 
 
2.7. HISTOLOGIA 
Para o estudo histológico, a cavidade nasal foi descalcificada usando ácido 
nítrico a 5%, durante 7 dias e, posteriormente, incorporada em parafina. De 
seguida, foram cortadas, coronalmente, secções de parafina de 5µm de 
espessura ao nível da papila incisiva do palato duro. Posteriormente, estas 
secções foram desparafinadas e coradas com hematoxilina e eosina. 
O número de eosinófilos na mucosa do septo nasal foi contado em ambos os 
lados da cartilagem septal utilizando uma lente objetiva de imersão em óleo 
(ampliação: x1000; microscópio Carl Zeiss Axio Imager 2.0 acoplado a uma 
câmara a cores e a um computador com o software Carl Zeiss AxioVision Rel. 
4.8 (Nova Iorque, EUA)). Foram contadas duas secções consecutivas em cada 
 15 
animal. 
 
2.8. IMUNOFLUORESCÊNCIA 
A deteção de Syn por imunofluorescência foi feita em quatro conjuntos de 
secções que continham amostras de OB, AON, PirC e PFC. As secções foramcortadas em intervalos regulares de 480 µm. Estas secções foram lavadas 4 
vezes durante 15 min com PBS e depois incubadas em normal horse serum 5% 
em PBS com 0,25% de Triton X-100, durante 1h, à temperatura ambiente, para 
bloquear locais de ligação inespecíficos. Cada conjunto de secções foram 
incubadas em duas etapas distintas. Na primeira etapa de incubação, as 
secções foram incubadas com o anticorpo primário anti-Syn, durante 72h, a 4 
°C. Após lavagem, as secções foram incubadas no anticorpo secundário 
específico: anticorpo anti-IgG de coelho, durante 1h à temperatura ambiente 
(Tabela Suplementar 1). Por fim, as secções foram lavadas e depois incubadas 
com Streptavidin, uma vez que o anticorpo secundário era biotinilado, durante 
1h, à temperatura ambiente. Todas as secções foram montadas em lâminas 
revestidas com gelatina e cobertas com Fluorsafe™ juntamente com DAPI a uma 
diluição de 1:100. 
 
2.9. PROCESSAMENTO DE IMAGENS 
As fotografias foram tiradas num microscópio Carl Zeiss Axio Imager 2.0 
emparelhado com uma câmara a cores e um computador com o software Carl 
Zeiss AxioVision Rel. 4.8 (Nova Iorque, EUA). Foram obtidas imagens do BO, 
NOA, CPir e CPF com uma ampliação de 40X. Para a determinação da 
intensidade óptica de Syn por área cerebral, foi utilizado o software ImageJ 
 16 
1.52a. Para prevenir variabilidade na coloração, os grupos experimentais e de 
controlo foram processados em paralelo. 
 
2.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA 
Os resultados dos testes comportamentais estão expressos em média ± SEM e 
os resultados morfológicos em média ± SD. 
A análise estatística foi feita com recurso ao GraphPad Prism versão 7.02 para 
Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). 
A análise two-away ANOVA foi utilizada para analisar os resultados obtidos no 
burried food test (variáveis independentes: localização da bolacha, RA; variável 
dependente: tempo gasto para encontrar a bolacha) e no agressive behavior test 
(variável independente: tipo de comportamento, RA; variável dependente: tempo 
gasto em comportamentos ofensivos e defensivos). 
Por outro lado, a análise one-way ANOVA foi utilizada na análise dos sintomas 
produzidos pela RA, comportamentos ofensivos e defensivos, ganho de peso 
corporal, peso dos órgãos e dados histológicos. 
Sempre que foi necessário, as análises por ANOVA foram seguidas por testes 
de comparação de post-hoc de Turkey HSD (highest signification difference). 
O T-test foi usado na contagem de eosinófilos, nos níveis totais de IgE e na 
análise da imunofluorescência para comparar as diferenças entre o grupo da RA 
e o grupo controlo. As diferenças foram consideradas estatisticamente 
significativas quando p<0,05. 
 
 
 
 17 
3. RESULTADOS 
3.1. PESO CORPORAL E DOS ORGÃOS 
No D1 os pesos corporais eram semelhantes entre os grupos de RA e controlo. 
No D28 (dia final da experiência) não foram encontradas diferenças 
estatisticamente significativas entre os pesos corporais, dos pulmões e das 
suprarrenais, entre os dois grupos. Houve um aumento do peso corporal em 
cerca de 1,2 vezes, mas sem diferença significativa entre ambos os grupos 
(Tabela 1). 
 
3.2. CONFIRMAÇÃO DO MODELO DE RINITE ALÉRGICA 
No D14, após a fase de sensibilização, foram avaliados os sintomas alérgicos. 
Foi quantificado o número de espirros e de prurido nasal e verificou-se que os 
resultados foram semelhantes entre os 2 grupos. 
No D27, repetiu-se a avaliação dos sintomas. No grupo controlo, os resultados 
foram semelhantes. Por outro lado, no grupo da RA verificou-se um aumento 
estatisticamente significativo do número de espirros (p<0,001), de prurido nasal 
(p<0,01) e dos comportamentos de manutenção da higiene (p<0,05), em relação 
ao grupo controlo. Verificou-se também que, no D27 o número de espirros 
(p<0,001) e de prurido nasal (p<0,01) aumentaram em relação ao D14 (Tabela 
1). 
As amostras de sangue colhidas no D28 para medição da IgE total revelaram 
diferenças estatisticamente significativas: grupo controlo com níveis séricos de 
39 ng/mL vs grupo de RA com níveis sérios de 228 ng/mL (p<0,01). 
Quanto ao número total de eosinófilos, também houve um aumento 
estatisticamente significativo: grupo de RA 37,2/campo vs grupo controlo 
 18 
4,1/campo (p<0,01). 
 
3.3. EFEITO DA RINITE ALÉRGICA NO COMPORTAMENTO 
3.3.1. AVALIAÇÃO DO OLFATO 
A avaliação do olfato foi feita através do burried food test. Quando comparamos 
os 2 grupos, verificamos uma redução na capacidade olfativa no grupo da RA. 
Verificou-se que o tempo médio para encontrar a bolacha escondida foi 3,1 
vezes maior no grupo da RA, em comparação com o grupo controlo (p<0,05) 
(Figura 2). Dentro de cada grupo não houve diferenças significativas. 
 
3.3.2. COMPORTAMENTOS AGRESSIVOS E DEFENSIVOS 
Relativamente à percentagem de tempo cumulativo despendido em 
comportamentos agressivos e defensivos, verificou-se que houve diferenças 
significativas entre os dois grupos (p<0,05). A análise post-hoc mostrou que os 
ratos com RA despenderam menos tempo em comportamentos agressivos 
(p<0,05) e mais tempo em comportamentos defensivos (p<0,05), 
comparativamente ao grupo controlo (Figura 3). 
 
3.4. EFEITO DA RINITE ALÉRGICA NA ATIVIDADE SINÁPTICA 
3.4.1. EFEITO DA RINITE ALÉRGICA NA ATIVIDADE SINÁPTICA DO BOLBO 
OLFATIVO 
Foram analisadas as diferentes camadas do bolbo olfativo e verificou-se uma 
redução de 44% na distribuição da Syn (p<0,001) no grupo da RA, 
comparativamente ao grupo controlo. No entanto, não foram encontradas 
diferenças significativas nas outras camadas do BO (Figuras 4 e 5). 
 19 
 
3.4.2. EFEITO DA RINITE ALÉRGICA NA ATIVIDADE SINÁPTICA DO NÚCLEO 
OLFATIVO ANTERIOR E CÓRTEX PIRIFORME 
Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na distribuição 
da Syn no NOA e no CPir entre os dois grupos (Figuras 6 e 7). 
 
3.4.3. EFEITO DA RINITE ALÉRGICA NA ATIVIDADE SINÁPTICA DO CÓRTEX 
PRÉ-FRONTAL 
Quando analisamos o CPF verificamos uma redução de 53% na distribuição da 
Syn (p<0,001) no grupo da RA, em comparação ao grupo controlo (Figura 8). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 20 
4. DISCUSSÃO 
Com este trabalho conseguimos demonstrar, através da avaliação imuno-
histoquímica, uma diminuição significativa da marcação de Syn na CG do BO, 
no grupo da RA. No CPF também se identificou redução na deteção de Syn em 
ratos com RA. Estes animais evidenciaram ainda alterações comportamentais 
relevantes, com diminuição da capacidade olfativa, identificada no buried food 
test, e da agressividade, avaliada no agressive behavior test. 
De forma a investigar a possível influência da RA na via olfativa e em áreas 
relacionadas do SNC, recorreu-se a um modelo animal de RA em Rato. Para tal, 
após pesquisa bibliográfica, selecionou-se um modelo de indução de RA por 
sensibilização e provocação com OVA27. Após replicação do modelo, procedeu-
se à confirmação clínica, analítica e histológica do desenvolvimento de RA. 
Clinicamente, verificou-se um aumento estatisticamente significativo do número 
de espirros e de prurido nasal, em relação ao grupo controlo, à semelhança das 
manifestações da doença no Homem. Analiticamente, constatou-se um aumento 
significativo do valor da IgE total. A análise histológica demonstrou um aumento 
significativo da infiltração da mucosa nasal por eosinófilos, pelo que podemos 
afirmar que conseguimos replicar um modelo de RA em Rato. 
O processo inflamatório crónico de causa alérgica, como acontece na RA, resulta 
na libertação persistente de citocinas pró-inflamatórias na mucosa nasal, 
podendo levar a alterações na regeneração e na sobrevivência dos NOS, com 
consequentemente declínio da atividade sináptica do BO17, 18, 19. Os NOS são 
neurónios muito importantes no BO, que fazem sinapse exclusivamente na CG 
do BO33. No nosso estudo confirmamos uma redução da marcação de Syn na 
CG, facto que pode resultarde um comprometimento na atividade sináptica do 
 21 
BO de ratos com RA. Esta redução da marcação da Syn vai de encontro aos 
resultados obtidos no burried food test, onde se confirmou disfunção olfativa nos 
ratos com RA, comparativamente aos controlos. Estes resultados sugerem que 
a inflamação alérgica crónica que ocorre na mucosa nasal pode comprometer os 
NOS e ser responsável pela diminuição da atividade sináptica no BO. Esta 
alteração identificada na CG do BO, quando prolongada no tempo, poderá estar 
relacionada com a redução do volume do BO previamente descrita em estudos 
com ressonância magnética nuclear 21. Esta informação vem suportar a suspeita 
de que a RA induz alterações estruturais na via olfativa, confirmando a existência 
de outros mecanismos para além da obstrução nasal, a justificar a hiposmia em 
doentes com RA. 
Vários estudos têm alertado para o efeito das doenças alérgicas no SNC36,37. O 
processo inflamatório crónico presente na via aérea parece despoletar 
modificações imunológicas no SNC38. Ademais, a RA induzida 
experimentalmente em roedores, parece desencadear aumento de citocinas 
inflamatórias no CPF e comportamentos de ansiedade, sugerindo que a RA é 
uma condição capaz de influenciar as respostas comportamentais em ratos11. 
Também foi reconhecida a presença de neuroinflamação no BO, no CPF e no 
hipocampo em animais com RA, mas as suas repercussões funcionais não foram 
ainda estabelecidas13. Neste estudo, os nossos resultados demostraram uma 
redução da marcação da Syn no CPF de ratos com RA. Este resultado vai de 
encontro ao que foi proposto por Salimi e colaboradores, que sugeriram uma 
desregulação do circuito entre o BO e o CPF medial, em resposta à inflamação 
alérgica24. A diminuição da atividade sináptica em determinadas regiões do CPF, 
a longo termo, pode explicar o declínio no desempenho cognitivo, ansiedade e 
 22 
alterações na agressividade, observados em estudos humanos39,50,51. Isto vai de 
encontro ao facto de que em estudos anteriores foi demonstrado que pacientes 
com lesões no CPF apresentaram maior probabilidade de comportamentos de 
agressividade, quando comparados com pacientes sem lesões nesta aérea, 
sugerindo uma maior predisposição para a impulsividade, agressividade e 
inadequação social50. 
Quanto aos testes comportamentais, verificamos que os ratos com RA exibiram 
disfunção olfativa, uma vez que estes animais gastaram significativamente mais 
tempo a encontrar a bolacha escondida, comparativamente aos controlos, no 
burried food test. Estes resultados não se deveram a problemas motores, de 
motivação ou outras alterações sensoriais, pois com a bolacha visível à 
superfície, o desempenho entre os dois grupos foi semelhante. A disfunção 
olfativa identificada no burried food test vai de encontro à redução da marcação 
da Syn detetada na CG do BO por imuno-histoquímica. 
Outra relação que tem vindo a ser estudada é a associação entre a RA e a 
alteração de comportamentos de agressividade,13,49. Apesar de ainda não se ter 
encontrado uma relação direta, há relatos de alterações ao nível da interação 
social entre os roedores9. Neste trabalho, recorrendo ao aggressive behavior 
test, e demonstramos que os ratos com RA têm comportamentos menos 
agressivos, quando comparados com os controlos. Instintivamente, todo o 
processo de sentido de pertença da sua gaiola é mais eficaz quando todos os 
órgãos sensitivos funcionam corretamente. Nos ratos com RA, foi demonstrada 
uma disfunção olfativa, pelo que é normal que estes ratos tenham mais 
dificuldade em reconhecer a gaiola como sua e, concludentemente, tenham 
comportamentos menos agressivos quando confrontados com um intruso. 
 23 
Este trabalho foi realizado com ratos machos Wistar, com o propósito de 
extrapolar algumas conclusões para a RA em humanos. Naturalmente, surgem 
algumas limitações, designadamente: a) na dificuldade em avaliar 
comportamentos de agressividade em roedores; b) no modelo de RA 
reproduzido, pois os ratos viveram pouco tempo com RA, enquanto a doença 
humana é crónica e a exposição cumulativa pode ser a chave para o 
aparecimento das comorbilidades; c) na proporção tamanho corporal: tamanho 
do bolbo olfativo, em que esta proporção é significativamente maior nos roedores 
do que nos humanos e, por isso, a disfunção olfativa pode estar a ser 
sobrevalorizada em relação ao modelo humano. 
Apesar das limitações supracitadas, este trabalho vem apontar para o facto da 
RA poder induzir alterações sinápticas ao nível do BO e do circuito neuronal com 
ele relacionado, afetando alguns comportamentos dependentes do olfato, como 
verificado na avaliação do comportamento agressivo. Para além disto, apesar de 
frequentemente subdiagnosticada, a RA é uma doença altamente prevalente a 
nível mundial2, tendo sido previamente associada a alterações de 
comportamento, maior probabilidade de depressão e ansiedade10. Assim, o 
diagnóstico precoce e o tratamento adequado da RA poderão ser fundamentais 
no sentido de diminuir a morbilidade imposta por esta doença. 
De futuro, mais estudos serão necessários para: a) estudar outras regiões do 
SNC, como a amígdala e o hipocampo, implicados nos circuitos da ansiedade e 
depressão; b) estudar a possibilidade da reversibilidade das alterações 
identificadas com tratamento adequando; c) estudar a repercussão da RA em 
animais com um período de exposição mais longo à RA, melhorando a 
semelhança com a doença humana. 
 24 
Em suma, neste trabalho conseguimos demostrar que a RA influencia a atividade 
da Syn na via olfativa e no CPF, comprometendo a função olfativa e alterando o 
comportamento de agressividade dos ratos com RA. 
 
DESTAQUES 
A indução de rinite alérgica levou a uma diminuição significativa da marcação de 
sinaptofisina na camada glomerular do bolbo olfativo. 
Foi identificada a diminuição da capacidade olfativa em ratos com rinite alérgica. 
Foram identificados comportamentos menos agressivos em ratos com rinite 
alérgica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 25 
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 32 
TABELAS E FIGURAS 
 
 
Tabela 1 – Peso corporal e de órgãos 
 
 
Dados apresentados como média ± SD. One-way ANOVA: *** p<0,001, em 
comparação com D1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Controlos RA p 
Corporal (D1) (g) 269,40 ± 17,2 266,70 ± 17,7 0,932 
Corporal (D28) (g) 317,70 ± 17,8 *** 311,00 ± 19,3*** 0,653 
Encéfalo (g) 2,02 ± 0,04 1,94 ± 0,11 0,136 
Pulmões (g) 1,75 ± 0,85 2,21 ± 1,14 0,448 
Suprarrenais (mg/g) 0,19 ± 0,04 0,23 ± 0,05 0,082 
 33 
 
 
Figura 1 – Representação gráfica dos sintomas alérgicos no D14 (início) e D27 
(fim) do grupo controlo e do grupo de RA. Espirros e comichões nasais foram 
contadas por 3 investigadores durante 30 minutos. As colunas representam 
média ± SD (N=10/grupo). One-way ANOVA: * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001, 
em comparação com os controlos e ++ p<0,01; +++ p <0,001, em comparação com 
a avaliação inicial. 
 
 
 34 
 
Figura 2 – Representação Gráfica do tempo despendido à procura da bolacha 
no grupo controlo e no grupo da RA. As colunas representam média ± SD 
(N=10/grupo). Two-way ANOVA: *p<0,05, em comparação com os controlos; 
#p<0,05; ##p<0,01, em comparação com a bolacha escondida. 
 
 
 35 
 
 
 
Figura 3 – Representação gráfica do tempo despendido em comportamentos 
ofensivos e defensivos. (A) Os ratos com RA passaram significativamente menos 
tempo em comportamentos ofensivos e significativamente mais tempo em 
comportamentos defensivos do que os controlos. (B) Percentagem de tempo 
despendido em comportamentos ofensivos. Os ratos com RA gastaram 
significativamente menos tempo em comportamentos de manutenção de guarda 
do que os controlos. (C) Percentagem do tempo dependido em comportamentos 
de afastamento, postura submissa e defensiva vertical. Os ratos com RA 
passaram significativamente mais tempo em comportamentos verticais 
defensivos do que o grupo de controlo. Dados apresentados em média ± SEM. 
One-way ANOVA: * p<0,05, em comparação com os controlos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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 (%
) 
Comportamentos 
ofensivos 
Comportamentos 
defensivos 
Ataque Ameaça 
lateral 
Sobreposição Postura 
ereta 
ofensiva 
 
Fuga Postura 
submissa 
Postura 
ereta 
defensiva 
 36 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4 – Representação gráfica da marcação de Syn na totalidade do BO e 
nas diferentes camadas do BO (CG, camada de células mitrais (CCM) e camada 
plexiforme externa (CPE)) de ambos os grupos em estudo. As colunas 
representam a média ± SD (N=10/grupo). T-test: *** p<0,001, em comparação 
com os controlos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
M
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o 
de
 S
yn
 n
a 
C
C
M
 (%
) 
M
ar
ca
çã
o 
de
 S
yn
 n
a 
C
PE
 (%
) 
 37 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5 – Deteção imuno-histoquímica de Syn nas diferentes camadas do BO 
(CG, CPE, CCM, camada plexiforme interna (CPI); camada de células 
glomerulares (CCG)) dos ratos com RA. Marcação por imunofluorescência com 
DAPI para o núcleo (azul), Alexa Fluor 568 (vermelho) para Syn e ambos. 
Escala=40µm. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CG CPE CCG 
 
B 
CCM CPI 
 38 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6 – Representação gráfica da marcação de Syn no NOA no grupo 
controlo e no grupo RA. As colunas representam a média ± SD (N=10/grupo). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
M
ar
ca
çã
o 
de
 S
yn
 n
o 
N
O
A
 (%
) 
 39 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7 – Representação gráfica da marcação de Syn no CPir no grupo controlo 
e no grupo RA. As colunas representam a média ± SD (N=10/grupo). 
 
M
ar
ca
çã
o 
de
 S
yn
 n
o 
C
Pi
r (
%
) 
 40 
 
 
 
 
 
 
Figura 8 – Representação gráfica da marcação de Syn no CPF no grupo controlo 
e no grupo RA. As colunas representam a média ± SD (N=10/grupo). T-test: *** 
p<0,001, em comparação com os controlos. 
 
M
ar
ca
çã
o 
de
 S
yn
 n
o 
C
PF
 (%
) 
ARRIVE 
The ARRIVE guidelines 2.0: author checklist 
Item Recommendation 
Section/line number, or reason 
for not reporting 
Study design 
 
1. For each experiment, provide 
brief details of study design 
including: 
a. The groups being compared, 
including control groups. If no 
control group has been used, the 
rationale should be stated. 
b. The experimental unit (e.g a 
single animal, litter, or cage of 
animals). 
 
Foi feito um estudo experimental 
em que se compararam dois 
grupos de ratos: ratos com RA vs 
ratos controlos (sem rinite 
alérgica) [Página 11 (2.1) “Os 
ratos foram alojados em grupos 
de 2, 10 ratos em cada grupo (...)”] 
Foi replicado um modelo de RA 
em ratos machos Wistar, por 
sensibilização com a ovalbumina 
(OVA) [Página 11 (2.2) “A indução 
de RA em Rato baseou-se na 
versão adaptada de um protocolo 
previamente publicado27. Os ratos 
foram sensibilizados durante 2 
semanas, em dias alternados, 
com ovalbumina (OVA, grau V, 
Sigma, 50 μg por rato, 500 μl, 
intraperitoneal) ou com solução 
salina (controlos), co-admistrada 
com AlumTM (Fisher Scientific 
Porto Salvo, Portugal) como 
adjuvante. 
Após a fase de sensibilização, foi 
administrada OVA intranasal, 
diariamente, durante 14 dias, sob 
anestesia com sevoflurano ao 
grupo de ratos da RA. O grupo 
controlo recebeu solução salina 
intranasal nas mesmas condições 
que os ratos sensibilizados com 
OVA.”]. Após os testes olfativos e 
comportamentais, estudamos a 
estrutura sináptica do bolbo 
olfativo (BO), núcleo olfativo 
anterior (NOA), CPir e CPF, 
através da deteção da marcação 
de sinaptofisina (Syn) por 
imunofluorescência [Página 12, 
(2.3.) “Nos dias 14 e 27, os ratos 
foram colocados em gaiolas de 
observação, por um período de 10 
minutos, para habituação e 
seguidamente foram 
contabilizados: o número de 
espirros, prurido nasal e gestos de 
higiene nasal, durante 30 minutos, 
por 3 investigadores, segundo um 
protocolo publicado28.”]; [Página 
12, (2.4.) “Os testes 
comportamentais foram 
realizados após 30 minutos de 
habituação à sala de testes e 
durante a fase de luz. No dia 23 
(D23) da experiência os ratos 
foram submetidos ao aggressive 
behavior test e no D26 foram 
submetidos ao burried food test.”]; 
[Página 15 (2.8) “A deteção de 
Syn por imunofluorescência foi 
feita em quatro conjuntos de 
secções que continham amostras 
de OB, AON, PirC e PFC (...)”]. 
 
Sample size 
 
2. 
a. Specify the exact number of 
experimental units allocated to 
each group, and the total number in 
each experiment. Also indicate the 
total number of animals used. 
b. Explain how the sample size 
was decided. Provide detail of any 
a priori sample size calculation, if 
done. 
 
Página 11 (2.1.) 
“Foram utilizados ratos machos 
Wistar (Charles River, France) 
com 6 a 8 semanas de vida. 
Os ratos foram alojados em 
grupos de 2, 10 ratos em cada 
grupo, e mantidos em condições 
padronizadas (...)” 
 
Inclusion and 
exclusion criteria 
 
 
 
3. 
a. Describeany criteria used 
for including and excluding animals 
(or experimental units) during the 
experiment, and data points during 
the analysis. Specify if these 
criteria were established a priori. If 
no criteria were set, state this 
explicitly. 
b. For each experimental 
group, report any animals, 
experimental units or data points 
not included in the analysis and 
explain why. If there were no 
exclusions, state so. 
c. For each analysis, report the 
exact value of n in each 
experimental group. 
 
Critérios de inclusão: 
Página 11 (2.1.) 
“Foram utilizados ratos machos 
Wistar (Charles River, France) 
com 6 a 8 semanas de vida.” 
 
Critérios de exclusão: 
Não foram aplicados critérios de 
exclusão. 
 
 
 
Randomisation 
 
 
4. 
a. State whether randomisation was 
used to allocate experimental units 
to control and treatment groups. If 
done, provide the method used to 
generate the randomisation 
sequence. 
b. Describe the strategy used to 
minimize 
potential confounders such as the 
order of treatment and 
measurements, or animal/cage 
location. If confounders were not 
controlled, state this explicitly. 
 
Os animais foram aleatoriamente 
distribuídos pelos grupos de RA e 
controlo. 
 
Os confundidores não foram 
controlados. 
Blinding 
 
 
5. Describe who was aware of the 
group allocation at the different 
stages of the experiment (during 
the allocation, the conduct of the 
experiment, the outcome 
assessment, and the data analysis) 
 
 
A análise de sintomas foi feita por 
3 investigadores cegos, que não 
sabiam quais os ratos tratados ou 
quais os ratos de controlo. 
Outcome 
measures 
 
6 . 
a. Clearly define all outcome 
measures assessed (e.g. cell 
death, molecular markers, or 
behavioural changes). 
b. For hypothesis-testing studies, 
specify the primary outcome 
measure, i.e. the outcome 
measure that was used to 
determine the sample size. 
 
Página 10, parágrafo 9. (1. 
Introdução) 
“Este trabalho tem como objetivo 
investigar a influência da RA na 
atividade da Syn na via olfativa e 
no CPF, através de métodos 
imunohistoquímicos, num modelo 
animal de RA. Neste sentido, 
também pretendemos avaliar a 
influência da RA na função 
olfativa e em comportamentos de 
agressividade, em ratos com RA.” 
 
Statistical 
methods 
 
7. 
a. Provide details of the statistical 
methods used for each analysis, 
including software used. 
b. Describe any methods used to 
assess whether the data met the 
assumptions of the statistical 
approach, and what was done if the 
assumptions were not met. 
 
 
Página 16 (2.10) 
“Os resultados dos testes 
comportamentais estão 
expressos em média ± SEM e os 
resultados morfológicos em média 
± SD. 
A análise estatística foi feita com 
recurso ao GraphPad Prism 
versão 7.02 para Windows 
(GraphPad Software, La Jolla, 
CA, USA). 
A análise two-away ANOVA foi 
utilizada para analisar os 
resultados obtidos no burried food 
test (variáveis independentes: 
localização da bolacha, RA; 
variável dependente: tempo gasto 
para encontrar a bolacha) e no 
agressive behavior test (variável 
independente: tipo de 
comportamento, RA; variável 
dependente: tempo gasto em 
comportamentos ofensivos e 
defensivos). 
Por outro lado, a análise one-way 
ANOVA foi utilizada na análise 
dos sintomas produzidos pela RA, 
comportamentos ofensivos e 
defensivos, ganho de peso 
corporal, peso dos órgãos e 
dados histológicos. 
Sempre que foi necessário, as 
análises por ANOVA foram 
seguidas por testes de 
comparação de post-hoc de 
Turkey HSD (highest signification 
difference). 
O T-test foi usado na contagem de 
eosinófilos, nos níveis totais de 
IgE e na análise da 
imunofluorescência para 
comparar as diferenças entre o 
grupo da RA e o grupo controlo. 
As diferenças foram consideradas 
estatisticamente significativas 
quando p<0,05.” 
 
Experimental 
animals 
 
 
8. 
a. Provide species-appropriate 
details of the animals used, 
including species, strain and 
substrain, sex, age or 
developmental stage, and, if 
relevant, weight. 
b. Provide further relevant 
information on the provenance of 
animals, health/immune status, 
genetic modification status, 
genotype, and any previous 
procedures. 
 
 
Página 11 (2.1) 
“Foram utilizados ratos machos 
Wistar (Charles River, France) 
com 6 a 8 semanas de vida.” 
 
Experimental 
procedures 
 
 
9. For each experimental group, 
including controls, describe the 
procedures in enough detail to 
allow others to replicate them, 
including: 
a. What was done, how it was done 
and what was used. 
b. When and how often. 
c. Where (including detail of any 
acclimatization periods). 
 
Páginas 11 e 12 (2.1.; 2.2.; 
2.3.;2.4) 
“Foram utilizados ratos machos 
Wistar (Charles River, France) 
com 6 a 8 semanas de vida. 
Os ratos foram alojados em 
grupos de 2, 10 ratos em cada 
grupo, e mantidos em condições 
padronizadas: 12 horas de ciclos 
d. Why (provide rationale for 
procedures). 
 
luz/escuro, temperatura ambiente 
de 21ºC e humidade relativa de 45 
± 5%, com acesso livre a água e 
comida. 
A indução de RA em Rato baseou-
se na versão adaptada de um 
protocolo previamente 
publicado27. Os ratos foram 
sensibilizados durante 2 
semanas, em dias alternados, 
com ovalbumina (OVA, grau V, 
Sigma, 50 μg por rato, 500 μl, 
intraperitoneal) ou com solução 
salina (controlos), co-admistrada 
com AlumTM (Fisher Scientific 
Porto Salvo, Portugal) como 
adjuvante. 
Após a fase de sensibilização, foi 
administrada OVA intranasal, 
diariamente, durante 14 dias, sob 
anestesia com sevoflurano ao 
grupo de ratos da RA. O grupo 
controlo recebeu solução salina 
intranasal nas mesmas condições 
que os ratos sensibilizados com 
OVA. A administração intranasal 
foi executada segundo um 
protocolo já publicado27. Após a 
fase de instilação intranasal, os 
ratos foram submetidos a estudos 
comportamentais. 
Todas as manhãs, os animais 
foram pesados. Após a última 
instilação nasal (24h depois), os 
ratos foram anestesiados e 
sacrificados. 
Nos dias 14 e 27, os ratos foram 
colocados em gaiolas de 
observação, por um período de 10 
minutos, para habituação e 
seguidamente foram 
contabilizados: o número de 
espirros, prurido nasal e gestos de 
higiene nasal, durante 30 minutos, 
por 3 investigadores, segundo um 
protocolo publicado28. 
Os testes comportamentais foram 
realizados após 30 minutos de 
habituação à sala de testes e 
durante a fase de luz. No dia 23 
(D23) da experiência os ratos 
foram submetidos ao aggressive 
behavior test e no D26 foram 
submetidos ao burried food test. 
2.4.1. BURIED FOOD TEST 
Este teste foi realizado com o 
objetivo de avaliar a capacidade 
olfativa para odores voláteis e o 
uso do olfato como método de 
procura de alimento29. Depois de 
18 horas de privação alimentar, os 
ratos foram colocados na gaiola 
de teste durante 10 minutos para 
habituação. De seguida, retirou-
se o rato da gaiola e a bolacha foi 
enterrada a cerca de 2 cm da 
superfície, num local aleatório, e o 
rato voltou a ser colocado na 
gaiola. O tempo que os ratos 
demoraram a localizar a bolacha 
foi registado, com um tempo 
máximo de procura de 15 minutos. 
Duas horas depois foi feito o 
mesmo teste, mas deste vez com 
a bolacha visível à superfície. 
 
2.4.2. AGGRESSIVE BEHAVIOR 
TEST 
Este teste tem como objetivo 
avaliar o tipo e a duração de 
comportamentos agressivos30. Os 
ratos foram mantidos sozinhos 
numa gaiola, sem mudar a cama 
do leito durante 5 dias. 
Posteriormente, um rato adulto, 
sexualmente inexperiente e mais 
leve que o rato de teste, foi 
introduzido na gaiola do rato de 
teste. 
O comportamento do rato teste foi 
gravado em vídeo durante 15 min. 
A análise da gravação determinou 
o tipo e duração de 
comportamentos ofensivos 
(perseguição, ataque, postura 
ereta ofensiva, ameaça lateral e 
comportamentos de manutenção 
de guarda) e comportamentos 
defensivos (afastados, com 
postura submissa e postura ereta 
defensiva).” 
 
 
 
 
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PHYSIOLOGY & BEHAVIOR
AUTHOR INFORMATION PACK
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p.1
p.2
p.2
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ISSN: 0031-9384
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Physiology & Behavior is aimed at the causal physiological mechanisms of behavior and its
modulation by environmental factors. The journal invites original reports in the broad area of
behavioral and cognitive neuroscience, where the interaction of physiology and behavior is the
prerequisite for all published material. The range of subjects includes behavioral neuroendocrinology,
psychoneuroimmunology, learning and memory, ingestion, taste, social behavior, exercise (as it
relates to behavior), studies related to the mechanisms of psychopathology and studies using animal
models with the purpose of translating the findings to humans. Purely pharmacological studies (either
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Section Editors
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Eric Krause, University of Florida, Gainesville, Florida, United States of America
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Physiology, Cincinnati, Ohio, United States of America
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Juan Dominguez, The University of Texas at Austin, Austin, Texas, United States of America
David Edwards, Emory University, Atlanta, Georgia, United States of America
Cheryl Frye, University at Albany, Albany, New York, United States of America
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Juan Pedro Fuentes García, University of Extremadura, Badajoz, Spain
Andras Hajnal, Penn State College of Medicine, Hershey, Pennsylvania, United States of America
Robin Kanarek, Tufts University, Medford, Massachusetts, United States of America
Scott Kanoski, University of Southern California, Los Angeles, California, United States of America
Kimberly Kinzig, Purdue University, West Lafayette, Indiana, United States of America
Claire de La Serre, University of Georgia, Athens, Georgia, United States of America
Michelle Lee, Swansea University, Swansea, United Kingdom
Nu-Chu Liang, University of Illinois Urbana-Champaign, Department of Psychology, Champaign, Illinois, United
States of America
Victoria Macht, The University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, North Carolina, United States of
America
Kevin Myers, Bucknell University, Lewisburg, Pennsylvania, United States of America
Gretchen N. Neigh, Virginia Commonwealth University, Department of Anatomy and Neurobiology, Richmond,
Virginia, United States of America
Randy Nelson, The Ohio State University, Columbus, Ohio, United States of America
James G. Pfaus, Charles University, Praha, Czechia
Helen Raybould, University of California Davis, Davis, California, United States of America
Leah Reznikov, University of Florida, Gainesville, Florida, United States of America
Linda Rinaman, University of Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvania, United States of America
Sue Ritter, Washington State University, Pullman, Washington, United States of America
Mitchel Roitman, University of Illinois Chicago, Chicago, Illinois, United States of America
Neil Rowland, University of Florida, Gainesville, Florida, United States of America
Jérôme Roy, Nutrition Metabolism Aquaculture, St Pee sur Nivelle, France
Norbert Sachser, University of Münster, Münster, Germany
Samina Salim, University of Houston, Houston, Texas, United States of America
Jessica Santollo, University of Kentucky, Department of Biology, Lexington, Kentucky, United States of America
Gary Schwartz, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, New York, United States of America
Anthony Sclafani, City University of New York, New York, New York, United States of America
Andrea Sgoifo, University of Parma, Parma, Italy
Gerard Smith, Weill Cornell Medicine, New York, New York, United States of America
Matia B. Solomon, University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio, United States of America
AlanSpector, Florida State University, Tallahassee, Florida, United States of America
Volker Stefanski, University of Hohenheim, Stuttgart, Germany
Ursula Stockhorst, Osnabrück University, Osnabrück, Germany
Robert Thunhorst, The University of Iowa, Iowa City, Iowa, United States of America
Michael Tordoff, Monell Chemical Senses Center, Philadelphia, Pennsylvania, United States of America
Zoe Warwick, University of Maryland Baltimore, Baltimore, Maryland, United States of America
Richard Weisinger, The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, Parkville, Australia
Margriet Westerterp-Plantenga, Maastricht University, Maastricht, Netherlands
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