Enzimas de Restrição e Genética

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Acredita-se que as enzimas de restrição bacterianas tenham sido selecionadas ao longo da 
evolução desses organismos por promoverem proteção ao ataque de bacteriófagos (vírus que 
infectam bactérias). Uma molécula de DNA viral que contenha sítios de corte para uma endonu-
clease bacteriana, ao ser injetada na bactéria, é prontamente cortada nesses pontos e deixa de 
funcionar. Hoje são conhecidas centenas de enzimas de restrição, que são purificadas e comer-
cializadas por diversos laboratórios no mundo. 
Além de evidenciar a existência de um sistema de defesa bacteriano e da complexa interação 
entre bactérias e seus vírus parasitas, a descoberta das enzimas de restrição permitiu grandes 
avanços na Genética Molecular. Por isso, os três pesquisadores responsáveis pela elucidação 
do mecanismo de ação das endonucleases de restrição, o suíço Werner Arber (n. 1929) e os es-
tadunidenses Daniel Nathans (1928-1999) e Hamilton Smith (n. 1931), receberam o Prêmio Nobel 
em Medicina ou Fisiologia em 1978. 
Moléculas idênticas de DNA tratadas 
com determinada endonuclease de res-
trição são cortadas nos mesmos pontos, 
originando fragmentos de tamanhos idên-
ticos. Por exemplo, no primeiro estudo com 
esse tipo de enzimas, realizado em 1971, o 
virologista Daniel Nathans e uma de suas 
estudantes, Kathleen Danna, trataram DNA 
do vírus SV40 com a enzima Hind II e obti-
veram 11 tipos de fragmentos, que diferiam 
em tamanho. Como o DNA desse vírus é uma 
molécula circular, concluiu-se que ela foi 
cortada em 11 locais; o tamanho de cada 
fragmento correspondia à distância entre 
dois sítios de corte adjacentes. (Fig. 8.10)
Separação eletroforética de fragmentos de DNA
Como vimos na figura 8.10, os fragmentos de DNA com diferentes tamanhos, gerados pelo 
corte com determinada endonuclease de restrição, podem ser separados por meio de uma técnica 
denominada eletroforese (do grego phóresis, ação de transportar, migração).
O processo de eletroforese é realizado em uma placa de gelatina especial (gel). A solução 
contendo os fragmentos de DNA é colocada em fendas em uma das extremidades do gel, à qual 
é conectado o polo negativo de uma fonte geradora de corrente elétrica; à extremidade oposta 
do gel é ligado o polo positivo da fonte.
A aplicação de uma diferença de potencial na placa de gel faz os fragmentos de DNA se 
deslocarem em direção ao polo positivo, uma vez que eles possuem carga elétrica negativa. 
O deslocamento dos fragmentos de DNA no gel é comparável a uma corrida de obstáculos, repre-
sentados pelas fibras que formam o gel; o DNA movimenta-se entre as fibras e, quanto menor o 
tamanho do fragmento, maior a velocidade com que ele se desloca.
Quando o campo elétrico é desligado, fragmentos de mesmo tamanho “estacionam” juntos 
em determinada posição na placa de gel, formando uma faixa, ou banda. A placa de gel é, então, 
tratada com uma solução de brometo de etídio (C21H2OBrN3), que adere às moléculas de DNA e 
forma um complexo que se torna visível quando iluminado com raios ultravioleta, o que permite 
a visualização das bandas formadas pelos fragmentos de DNA.
Fotografias do gel obtidas sob iluminação ultravioleta permitem aos pesquisadores analisar 
a posição de cada banda. Pela medida da distância relativa de migração das bandas, é possível 
calcular o peso molecular e o tamanho dos fragmentos de DNA que as constituem. (Fig. 8.11)
Figura 8.10 Acima, representação esquemática da 
separação eletroforética dos 11 fragmentos de DNA 
do vírus SV40 produzidos pela digestão com a enzima 
Hind II. Abaixo, representação do cromossomo circular 
do vírus SV40 com os locais de corte indicados 
pelas setas; os 11 fragmentos gerados pela digestão 
enzimática estão indicados por letras de A a K. 
(Imagens sem escala, cores-fantasia.)
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Figura 8.11 Representação esquemática da técnica de eletroforese, que permite separar pedaços 
de DNA cortados por uma enzima de restrição. Cada tipo de DNA analisado produz um padrão de 
bandas característico. Quanto mais espessa a banda, maior o número de fragmentos de mesmo 
tamanho que ela contém. (Imagem sem escala, cores-fantasia.)
polo (1
)
polo (2
)
Fenda no gel que recebe
a mistura de fragmentos 
de DNA de uma amostra
Fragmentos 
menores
Fragmentos 
intermediários
Fragmentos 
maiores
CIÊNCIA 
E CIDADANIA
A identificação de pessoas pelo dnA
A comprovação de que era possível caracterizar moléculas de DNA por meio do 
padrão eletroforético de fragmentos gerados pela digestão com endonucleases de 
restrição levou a se pensar no emprego dessa metodologia para identificar pessoas. 
Realmente, a análise desse padrão mostrou ser um método seguro para identificar 
pessoas e, atualmente, é largamente utilizado em investigações policiais e em pro-
cessos judiciais.
O princípio dessa metodologia é o seguinte: como as pessoas diferem entre si 
quanto ao material genético que possuem (com exceção dos gêmeos univitelínicos), 
a digestão, por uma endonuclease de restrição, do DNA de uma pessoa produzirá 
um padrão de fragmentos típico dela, comparável a um “código de barras” ou a uma 
“impressão digital” molecular.
detecção de fragmentos específicos de dnA
Nos organismos eucarióticos, o corte do DNA total do genoma por uma endonu-
clease de restrição produz tantos fragmentos, de tantos tamanhos diferentes, que é 
impossível visualizar bandas individuais na separação eletroforética: elas estão tão 
próximas umas das outras que aparecem como uma mancha contínua ao longo do gel. 
Por isso, é necessário utilizar técnicas especiais para evidenciar apenas determinados 
tipos de fragmentos de interesse.
Uma dessas técnicas, chamada hibridização molecular, consiste em tratar o gel de 
modo a separar as cadeias duplas dos fragmentos de DNA. Em seguida, aplicam-se 
Placa de gel no interior 
da qual se realiza
a “corrida” entre fragmentos
de DNA de cada amostra
Sítio de corte da 
endonuclease
Unidade de 
repetição da VNTR
Padrão
A
Padrão
B
Padrão
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Gel de 
eletroforese
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sondas, que são moléculas de DNA com sequências de bases complementares às de 
interesse, portanto capazes de parear com elas. Com isso, as sondas, que apresentam 
algum tipo de marcação que as tornam visíveis, evidenciam apenas as bandas corres-
pondentes à região de interesse, que podem, então, ser analisadas.
As sequências de dnA utilizadas na identificação de pessoas
Geralmente, os testes de identificação de pessoas pelo DNA utilizam sondas capa-
zes de detectar trechos do DNA humano que variam muito entre as pessoas de uma 
população. Essas regiões, conhecidas pela sigla VNTR, iniciais da expressão inglesa 
variable number of tandem repeats (número variável de repetições em sequência), são 
constituídas por sequências curtas, de até algumas dezenas de pares de nucleotídios, 
que se repetem ao longo de trechos da molécula de DNA. É o número dessas repetições 
que varia entre as pessoas, daí o nome desses trechos do DNA.
Suponha, por exemplo, que uma pessoa possua, em determinada região de um de 
seus cromossomos, um trecho VNTR com cinco repetições e no cromossomo homólogo, 
na região correspondente, um trecho com apenas três repetições.
Ao ser cortado com uma enzima de restrição que atua sobre sequências que delimi-
tam essas VNTRs, o DNA dessa pessoa produzirá fragmentosmenores, corresponden-
tes ao trecho com três repetições, e fragmentos maiores, correspondentes ao trecho 
com cinco repetições. Uma sonda que identifique essas VNTRs revelará, na separação 
eletroforética do DNA, duas bandas em posições diferentes. Uma outra pessoa que 
possua em ambos os cromossomos VNTRs com três repetições, com a utilização da 
mesma sonda, apresentará apenas uma banda, que corresponde aos dois fragmentos 
de mesmo tamanho.
Uma terceira pessoa com cinco repetições em cada cromossomo também apresen-
tará uma única banda, porém localizada mais próxima do polo negativo, pois terá se 
deslocado menos durante a eletroforese devido ao seu maior tamanho. (Fig. 8.12)
Figura 8.12 Representação esquemática da 
detecção de VNTRs em três pessoas. 
A pessoa A é heterozigótica quanto a VNTR, 
apresentando em um dos cromossomos 
3 unidades de repetição e no cromossomo 
homólogo, 5 unidades. A pessoa B é 
homozigótica, apresentando em ambos os 
cromossomos homólogos 3 unidades de 
repetição. A pessoa C, também homozigótica, 
apresenta 5 unidades de repetição em cada um 
dos cromossomos do par de homólogos. Abaixo, 
representação da separação eletroforética 
dos fragmentos de DNA das três pessoas, 
gerados pela digestão com uma endonuclease 
cujos sítios de corte franqueiam a VNTR e são 
evidenciados pela hibridação com sondas. 
(Imagem sem escala, cores-fantasia.)