PERÍCIA FORENSE - GENÉTICA FORENSE

Prévia do material em texto

AULA 1 - CONCEITOS BÁSICOS EM GENÉTICA E LEIS MENDELIANAS
A GENÉTICA E A DESCOBERTA DO DNA
A Genética é a ciência que estuda a Hereditariedade, ou seja, a transmissão de características de pais para filhos ao longo das gerações.
Esta área da Biologia pode, por exemplo, explicar como um casal de olhos escuros pode ter um filho de olhos claros. Ou como um casal normal para a cor da pele pode ter um filho albino.
Os mecanismos de hereditariedade estão presentes em todos os seres vivos, desde bactérias, até os vegetais e animais. Devido à descoberta do DNA, a Genética está dividida em dois momentos:
Genética Clássica:
Gregor Johann Mendel¹, antes da descoberta do DNA.
Genética Moderna:
Watson e Crick (1953), após a descoberta da estrutura do DNA.
(¹ Em meados do século XIX, um monge que vivia na Áustria, chamado Gregor Johann Mendel, ao observar uma plantação de ervilhas existente no mosteiro onde ele vivia, achou curioso que algumas tinham grãos amarelos e outras tinham grãos verdes; algumas eram altas e outras eram baixas; algumas tinham a flor de cor branca enquanto outras tinha a cor púrpura.
Então ele se perguntou: como podem ter características tão diferentes mesmo sendo da mesma espécie?
Procurando responder, Mendel planejou cuidadosamente uma série de experimentos para estudar como acontecia a transmissão de características de uma geração para outra.
Mendel cultivou e analisou cerca de 10.000 plantas de ervilhas, para elaborar suas duas leis que formaram as bases da Genética.
Ao apresentar os seus resultados à comunidade científica, Mendel não teve muita sorte. Não deram muita importância ao seu trabalho e este ficou esquecido por cerca de 35 anos, sendo então descobertos por três pesquisadores independentes, em 1900.
Esses pesquisadores, ao realizarem experimentos semelhantes e obterem resultados parecidos, redescobriram o trabalho de Mendel e, claro, deram todo o mérito a ele. Desde, então, ele é conhecido como o “pai da Genética”.)
CONCEITOS BÁSICOS
Antes de falarmos sobre o trabalho de Mendel, precisamos compreender alguns termos muito usados na Genética:
CARÁTER OU CARACTERÍSTICA:
Corresponde a um certo aspecto do ser vivo, geralmente determinado por um gene. Observe alguns exemplos na galeria a seguir!
A coloração que cada flor irá adquirir;
Com qual altura ficará uma árvore;
O tipo de cabelo das pessoas;
Qual a cor da pele;
E a cor dos olhos;
E até mesmo por anomalias, como o albinismo.
GENE
Segmento da molécula de DNA que contém uma informação genética. Cada gene, geralmente, tem uma informação que corresponde à sequência de aminoácidos que será usada para a síntese de uma proteína. A proteína, dessa forma, determinará uma característica do indivíduo.
GENÓTIPO
Conjunto de genes de um indivíduo para uma ou mais características. É a própria constituição genética do indivíduo.
É representado por letras:
A, a, B
Usamos letra maiúscula para representar genes dominantes e letra minúscula para representar genes recessivos.
Se os genes são alelos, usa-se a mesma letra.
Ex: Aa, Bb, Dd
Se os genes não são alelos, usa-se letras diferentes.
Ex: aB, Ab
FENÓTIPOS
Formas variáveis que uma determinada característica ou caráter apresenta.
Sistema ABO apresenta 4 fenótipos: A, B, AB e O.
Representa o conjunto de aspectos visíveis ou não de um indivíduo resultante da interação do genótipo com o meio ambiente.
Os fenótipos podem ser morfológicos ou fisiológicos.
A seguir, veja exemplos mais práticos:
· A cor dos olhos e dos cabelos são aspectos visíveis do indivíduo e, por isso, morfológicos.
· Já o tipo sanguíneo do indivíduo não é um aspecto visível, ou seja, é necessário coletar uma gota de sangue e adicionar um anticorpo a ela, para saber o fenótipo do indivíduo para essa característica (tipo sanguíneo A, B, AB ou O).
Resumindo, não temos como saber o tipo sanguíneo de uma pessoa somente olhando para ela.
FENOTIPO 
GENOTIPO 
Basicamente significa que as características observáveis de um organismo (fenótipo), dependem de uma combinação de fatores genéticos (genótipo), e do ambiente em que o organismo se desenvolve.
Um exemplo muito interessante é a coloração dos flamingos e de uma ave brasileira em extinção conhecida como Guará.
Quando nos deparamos com imagens dessas espécies, acreditamos que a coloração natural de suas plumagens é a cor rosa/vermelha. Entretanto, não há informação no genótipo dessas espécies para o fenótipo vermelho das penas.
A cor rosa/vermelha está intimamente relacionada à alimentação dessas espécies de aves, uma vez que essa coloração é decorrente da alimentação rica em crustáceos e carotenoides (uma classe de pigmento avermelhado).
CROMOSSOMOS HOMÓLOGOS
São os cromossomos de um mesmo par que possuem o mesmo tamanho e a mesma forma. Um homólogo veio do pai e outro da mãe.
LÓCUS GÊNICO
É o local específico nos cromossomos onde estão situados os genes. O plural de locus é Loci.
GENES ALELOS
São genes que ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos e que, portanto, determinam o mesmo caráter ou característica.
O tipo de sangue que cada um possui (A, B, AB ou O) é determinado por alelos presentes em um loco do cromossomo 9.
Esses alelos podem ser IA, IB ou i. Cada indivíduo apresenta, no par do cromossomo 9, a combinação de dois desses alelos, que determinam o seu tipo sanguíneo.
Assim, teremos as seguintes combinações possíveis:
	Alelos
(Genótipo)
	Tipo de sangue
(Fenótipo)
	IAIA
	A
	IAiA
	A
	IBIB
	B
	IBiB
	B
	IAIB
	AB
	ii
	O
HOMOZIGOTO
Corresponde ao indivíduo que possui os dois alelos iguais em um certo locus, sendo considerado puro para o caráter.
O genótipo do homozigoto é representado por duas letras iguais (AA ou aa).
 
Genes alelos iguais
(AA) homozigoto
(bb) homozigoto
HETEROZIGOTO
Corresponde ao indivíduo que possui um gene diferente do outro em um certo locus.
Cada um deles determina um fenótipo diferente para o caráter considerado; são impuros ou híbridos (Aa).
Genes alelos diferentes
(Aa) heterozigoto
(Bb) heterozigoto
Geralmente, para cada uma de nossas características, existem duas variáveis.
· Pele com pigmentação normal; pele sem pigmentação normal (albinismo).
· Pele com sardas; pele sem sardas.
· Lábios grossos; lábios finos.
ALELOS DOMINANTES
São aqueles que determinam o mesmo fenótipo, tanto em homozigose como em heterozigose.
Alelos que determinam características dominantes na espécie humana:
· Gene que determina olhos escuros;
· Gene para visão normal;
· Gene para cabelo escuro.
ALELOS RECESSIVOS
São aqueles que só se expressam quando estão em homozigose.
Alelos que determinam características recessivas na espécie humana:
· Gene para o albinismo;
· Gene para olhos verdes;
· Gene para lábios finos;
· Gene para cabelo claro.
HEREDITARIEDADE
Antes mesmo de saber o que a palavra hereditariedade significava, o homem já tentava manipular cruzamentos na tentativa de “selecionar” características de interesse.
· Cruzamentos entre variedades de vacas na tentativa de obter vacas que produzissem mais leite.
· Há o caso também de tentar obter galinhas maiores ou que colocassem mais ovos.
No entanto, tudo era feito a partir de observações, ou seja, só contemplavam a vaca que produzia mais leite ou a galinha que era maior do que as outras. Eles nada sabiam sobre processos genéticos.
OS EXPERIMENTOS DE MENDEL
Mendel realizou uma série de cruzamentos entre ervilhas. Como ele era matemático, todos os resultados obtidos receberam um tratamento estatístico em sua análise.
Com base nesses resultados, Mendel constatou que os caracteres estudados se manifestavam nas ervilhas descendentes, segundo regras que ficaram conhecidas como as Leis de Mendel.
Nesse período, nada se sabia sobre os mecanismos de divisão celular, muito menos sobre DNA e sua estrutura. Mais tarde, essas informações foram constatadas, confirmando as propostas de Mendel sobre a hereditariedade.
AS ERVILHAS
Conhecidas como ervilhas-de-cheiro, essa planta apresenta várias características que favoreceram a pesquisa de Mendel. Entre elas,podemos citar:
· É uma planta que se reproduz por autofecundação, além de ser de fácil polinização.
· Apresenta desenvolvimento rápido, com grande número de descendentes e características bem visíveis, fáceis de serem observadas.
O MÉTODO DE MENDEL
Podemos dividir o método de Mendel em, basicamente, 5 passos:
PRIMEIRO PASSO:
Primeiro ele selecionou as características a serem estudadas.
	Forma da semente
	Cor da semente
	Cor da casca da semente
	Forma da vagem
	Cor da vagem
	Posição das flores
	Altura das flores
	
	
	
	
	
	
	
	Lisa
	Amarela
	Cinza
	Inflada
	Verde
	Axilar
	Alta
	
	
	
	
	
	
	
	Rugosa
	Verde
	Branca
	Comprimida
	Amarela
	Terminal
	Baixa
SEGUNDO PASSO:
Depois, começou a realizar os cruzamentos entre plantas com sementes de cor amarela e sementes de cor verde.
Esse grupo inicial de plantas, constituído por linhagens puras, foi chamado de geração parental (P).
	
VV
	
X
	
vv
	
Geração
Parental
	
Vv
	
X
	
Vv
	
Geração F1
Autofecundação
	
Vv
	
Vv
	
Vv
	
Vv
	
Geração F2
3 Amarelas:
1 Verde
TERCEIRO PASSO:
Após o cruzamento da geração parental, Mendel observou que todos os descendentes desse primeiro cruzamento (geração F1) apresentavam sementes de cor amarela.
Como isso aconteceu se metade das plantas da geração parental tinha sementes verdes? Para onde teria ido a característica “cor verde” das sementes?
QUARTO PASSO:
Na tentativa de obter a resposta, ele deixou a planta se autofecundar (F1 x F1). A maioria das plantas resultantes da autofecundação, ou seja, do cruzamento de F1 com F1, apresentavam sementes de cor amarela (3 em 4, ou seja 75%). Porém, algumas apresentavam sementes de cor verde (1 em 4, ou seja, 25%).
QUINTO PASSO:
Mendel, então, concluiu que a cor verde não havia desaparecido, apenas não havia se manifestado na 1ª geração (F1). Era como se ela tivesse sido dominada pela cor amarela, mas reapareceu (em menor proporção) na 2ª geração (F2).
A partir desses resultados, Mendel verificou que algumas características são dominantes sobre outras. Neste caso, a cor amarela era dominante sobre a cor verde (recessiva).
Ele repetiu esse mesmo experimento para todas as demais características e obteve resultados semelhantes. Sempre uma característica dominava sobre a outra, ou seja, em todas as vezes havia uma característica que aparecia sozinha na primeira geração e outra que somente aparecia na segunda geração e sempre em menor proporção. Essa proporção era sempre de 3:1 (para cada 3 ervilhas de cor amarela, havia um grão de cor verde).
	
DOMINANTE
	
RECESSIVO
	Forma da semente
	
Lisa
	
Rugosa
	Cor da semente
	
Amarela
	
Verde
	Cor da casca da semente
	
Cinza
	
Branca
	Forma da vagem
	
Inflada
	
Comprimida
	Cor da vagem
	
Verde
	
Amarela
	Posição das flores
	
Axilar
	
Terminal
	Altura das flores
	
Alta
	
Baixa
CONCLUSÕES
· Cada caráter era determinado por um par de fatores (atualmente chamados de genes).
· Os descendentes recebem apenas um fator de cada par, sendo um materno e um paterno.
· Esses fatores são transmitidos através dos gametas.
· Os filhos herdarão dos pais apenas um gene de cada característica, podendo ocorrer então a manifestação apenas da característica dominante².
(² Pois os dois genes se separam (ou seja, se segregam) durante a formação dos gametas, indo apenas um gene para cada gameta.)
Esse princípio, que compreende a segregação dos “fatores”, constitui a 1ª Lei de Mendel ou Lei da Segregação dos Genes ou ainda, Lei da Pureza dos Gametas:
As células somáticas contêm fatores que se encontram aos pares, e estes se separam na formação dos gametas; cada gameta receberá apenas um fator de cada par.
A próxima curiosidade de Mendel foi saber se características dominantes estariam sempre juntas, ou seja, se a semente de cor amarela seria também lisa ou se poderia ser amarela e rugosa. Ele queria entender as relações existentes entre os “fatores”.
Então, continuou a realizar cruzamentos, selecionando plantas para estudar a transmissão de mais de uma característica, ou seja, de dois ou mais diferentes “fatores” simultaneamente.
Assim, cruzou plantas com sementes amarelas e lisas (“cor amarela” e “textura lisa” são fatores dominantes) com outras que exibiam sementes verdes e rugosas (“cor verde” e “textura rugosa” são fatores recessivos).
	
P
	
Planta pura com semente lisa e amarela
	
X
	
Planta pura com semente verde e rugosa
	
F1
	
Plantas com semente lisa e amarela
	
F1xF1
Autopolinização
	
Planta com semente lisa e amarela
	
X
	
Planta com semente lisa e amarela
Lembre-se mais uma vez que as plantas da geração parental são sempre “puras”.
	
VVRR
	
X
	
vvrr
	
Geração Parental
	
VvRr
	
X
	
VvRr
	Geração F1
Autofecundação
Todas as plantas da primeira geração, como esperado, apresentaram apenas sementes amarelas e lisas. Isso significa que os fatores dominantes e recessivos foram misturados entre si e as características desenvolvidas referem-se aos fenótipos dominantes.
Mendel cruzou entre si as plantas da geração F1:
Cor da semente Textura da semente
V = amarela R = lisa
v = verde r = rugosa
Proporção genotípica de F2:
9 V_R_
3 V_rr
3 vvR_
1 vvrr
Proporção fenotípica de F2:
Amarela-lisa
9/16
Amarela-rugosa
3/16
Verde-lisa
3/16
Verde-rugosa
1/16
Com a geração F2, Mendel obteve os seguintes resultados:
· A maioria das plantas da segunda geração (mais precisamente 9/16) tinha sementes amarelas e lisas.
· 3/16 exibiam sementes amarelas e rugosas.
· 3/16 tinha sementes verdes e lisas.
· 1/16 tinham sementes verdes e rugosas.
Dessa forma, Mendel constatou de que aquelas características das ervilhas, escolhidas por ele, e que estavam juntas nas plantas originais (semente amarela + textura lisa; ou semente verde + textura rugosa) foram separadas entre si, quando da realização dos cruzamentos, ou seja, não permaneciam juntas nas gerações seguintes.
Portanto, foi concluído que o surgimento, em F2, de sementes amarelas rugosas e verdes lisas, diferente da geração parental, tratava-se de uma separação independente dos alelos de um par, ou seja, os genes que determinam a cor das sementes estariam separados daqueles que determinam a textura da semente. Assim, Mendel propôs a Lei da Segregação Independente dos Fatores ou 2ª Lei de Mendel:
Fatores (genes) que condicionam dois ou mais caracteres separam-se durante a formação dos gametas, recombinam-se ao acaso, de maneira a estabelecer todas as possíveis combinações entre si.
Relembrando que, quando Mendel realizou seus experimentos, ainda não se sabia da existência dos cromossomos. Portanto, hoje sabe-se que a 2ª Lei é válida apenas para genes localizados em cromossomos diferentes, ou seja, cromossomos não homólogos.
AULA 2 - ESTRUTURA DO DNA, GENES E CROMOSSOMOS
DNA, A MOLÉCULA DA VIDA!
Vamos iniciar nossa aula com uma das mais recentes descobertas da Ciência envolvendo a molécula de DNA.
A nova descoberta de edição do material genético do DNA
Várias foram as descobertas que tentaram decifrar a existência da vida. Mas nenhuma delas foi tão marcante na Ciência como a descoberta da dupla hélice de DNA, o código genético da vida.
Até então, não era sabido qual a principal ligação entre os seres vivos que habitavam a terra. Com essa descoberta, a ciência deu um grande salto. O DNA se tornou o precursor da vida, a fita que tinha um código encontrado em todos os seres humanos. A ligação entre esses códigos permite a formação de um ser, algo que é muito complexo.
Nas várias divisões celulares necessárias para a formação de um novo ser, contudo, erros podem ocorrer. Daí é que surgem as doenças genéticas e também as hereditárias, pois a dupla hélice de DNA é composta de genes que herdamos de nossos progenitores.
Agora, em pleno século XXI, cientistas americanos descobriram uma nova maneira de lidar com a complexidade do DNA e buscam mais uma vez decifrar a incógnita que gira em torno da fita da vida. Eles descobriramuma nova maneira de editar o DNA humano, o método Crispr-Cas9.
Segundo os cientistas que realizaram o estudo, essa, inclusive, é a maneira mais barata de editar o DNA. Isso foi visto no meio científico como algo animador, pois o método poderá ser a solução para a cura de várias doenças genéticas como câncer, Alzheimer e até mesmo a Aids.
O PAPEL DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Em 1860, Johann Friedrich Miescher, ao estudar células do pus de curativos, isolou uma substância ácida. Essa substância foi então chamada de ácido nucleico, porque foi isolada do núcleo. Apresentava grandes quantidades de nitrogênio e fósforo e, na época, a sua importância não pôde ser avaliada.
A existência de cadeias polinucleotídicas, principais componentes do material ácido, só foi documentada na década de 1940. Até então não eram reconhecidas como o material genético. Esse papel pensava-se ser desempenhado pelas proteínas, que apresentavam maior potencial de variação.
A função dos ácidos nucleicos na estocagem e na transmissão de informações genéticas só foi estabelecida em 1944 e a estrutura da dupla hélice só foi descoberta em 1953. Muitos geneticistas estavam relutantes em aceitar a ideia de que os ácidos nucleicos, e não as proteínas, tinham a informação genética, pois esses ácidos exibiam menos variabilidade estrutural do que as proteínas, pois estas apresentavam 20 aminoácidos diferentes em sua estrutura, enquanto o DNA tinha somente quatro diferentes nucleotídeos.
Estrutura do Nucleotídeo
ESTRUTURA E FUNÇÃO DA MOLÉCULA DE DNA
Antes de 1953, os cientistas sabiam que os genes se encontravam nos cromossomos e sabiam que os cromossomos eram constituídos de DNA + proteínas. Porém, em 1953, James Watson e Francis Crick postularam o modelo da estrutura de dupla hélice. A partir de então, a estrutura e a função dos genes poderiam ser compreendidas a nível molecular.
O DNA (Ácido desoxirribonucleico) foi descrito como formado de unidades menores, denominadas nucleotídeos. Sendo cada nucleotídeo formado por uma base nitrogenada, um açúcar e um resíduo de ácido fosfórico ligados de forma covalente.
Essas bases nitrogenadas podem ser de dois tipos:
PIRIMIDINAS:
Citosina (C), timina (T) e uracila (U), que apresentam um anel aromático.
 
 Timina Citosina Uracila Grupamento fosfato
PURINAS:
Adenina (A) e guanina (G), compostas de dois anéis aromáticos.
 
 Adenina Guanina 2-desoxirribose
O DNA é constituído por duas cadeias longas de nucleotídeos, ou seja, a molécula tem duas fitas. Cada fita tem um esqueleto de açúcar-fosfato, isto é, cada nucleotídeo se mantém ligado ao outro por ligações chamadas fosfodiéster.
Por sua vez, as duas fitas se mantêm unidas por ligações chamadas pontes de hidrogênio estabelecidas entre as bases nitrogenadas (A – T; C – G).
Os dois filamentos ou fitas de uma dupla hélice de DNA são denominados complementares e, devido ao pareamento específico entre as bases, podemos determinar a sequência de bases de um filamento a partir da sequência conhecida do filamento complementar.
Esquema de moléculas de DNA, no plano e retorcida
 
Cadeia de nucleotídeos Duas cadeias pareadas, Dupla hélice Dupla hélice
 no plano
Análises da composição química do DNA de muitos organismos diferentes, realizadas por Erwin Chargaff e colaboradores (1949-1953), demonstraram que a concentração de timina era sempre igual à de adenina e a concentração de citosina era sempre igual à de guanina.
 
 T=A C (3 traços) G
CADA FITA DE DNA TEM UMA “DIREÇÃO”
Em uma extremidade 5’, que possui o grupo fosfato, e a outra extremidade 3’, que apresenta a hidroxila livre.
As bases nitrogenadas se posicionam em eixos perpendiculares ao esqueleto açúcar-fosfato. A característica mais importante da estrutura dos ácidos nucleicos é a sequência de bases nitrogenadas, pois carrega a informação genética.
No momento da síntese da molécula de DNA, a inserção de um novo nucleotídeo na cadeia, ou seja, na fita, será sempre onde se encontra o radical hidroxila, portanto, no carbono 3´. Por isso, o sentido da replicação do DNA será 5´ → 3´.
TIPOS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Há dois tipos de ácidos nucleicos:
· DNA
· RNA
O RNA, como veremos mais à frente, comanda a síntese de proteínas. Existem, portanto, diferenças entre essas duas moléculas:
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
	
· A molécula de RNA é constituída por nucleotídeos, mas estes formam apenas uma única fita. Portanto, o RNA é apenas uma fita simples, enquanto o DNA é uma fita dupla.
· O RNA é sintetizado a partir de uma das fitas da molécula de DNA, seguindo a complementariedade das bases. Mas, com relação às bases, o RNA tem uma diferença: a Timina (T) é substituída pela Uracila (U), ou seja, no RNA a Adenina se liga com a Uracila (A – U).
REPLICAÇÃO DO DNA
A cada vez que uma célula precisar se dividir para originar duas novas células iguais a ela, todo o DNA desta célula precisará ser duplicado ou replicado, dando origem a uma nova molécula de DNA com a mesma sequência de bases existente na original. Assegurando, assim, que as funções que executam serão perpetuadas na sua descendência.
A replicação do DNA envolve a separação das duas fitas parentais e a produção de duas novas fitas, tendo as parentais como molde. Cada nova molécula de DNA contém uma fita parental e uma fita recém-sintetizada, caracterizando a replicação semiconservativa.
Esse processo de replicação é complexo e envolve a participação de muitas enzimas:
Replicação do DNA
1. TOPOISOMERASE:
Para que a replicação possa começar é necessário que a dupla hélice seja desenrolada — ação executada pela enzima Topoisomerase.
2. HELICASE:
Em seguida, as fitas devem ser separadas, ou seja, a molécula tem que ser aberta. Para isso, as ligações pontes de hidrogênio precisam ser quebradas — a enzima que atua nessa abertura das fitas se chama Helicase.
3. SSB:
À medida que a dupla fita vai sendo aberta, proteínas chamadas SSB (proteínas que se ligam à fita simples) chegam para estabilizar as fitas, agora simples, até que a replicação se complete.
4. DNAS POLIMERASES:
As DNAs polimerases são responsáveis pela adição de nucleotídeos ao filamento em crescimento da extremidade 5’ para a 3’. No terminal 5’ do açúcar, há um grupo fosfato e, no 3’, existe uma hidroxila livre onde se estabelece a ligação fosfodiéster com o nucleotídeo que está sendo incorporado.
Para iniciar seu trabalho, a DNA polimerase III precisa reconhecer um pequeno filamento de nucleotídeos (esse filamento é de RNA), chamado de iniciador ou primer.
5. PRIMASE:
Ao reconhecer esse pequeno filamento, esta enzima adiciona os nucleotídeos seguintes. A Primase é a enzima que faz a adição desses iniciadores.
Durante o processo de replicação do DNA, uma das fitas novas é formada continuamente na direção 5’ → 3’ (fita líder) e a outra de maneira descontínua e no sentido inverso para manter a mesma direção 5’ → 3’ (fita retardatária).
6. FRAGMENTOS DE OKASAKI:
A fita descontínua é replicada através de fragmentos de Okasaki (1000 a 2000 nucleotídeos). Cada um desses fragmentos apresenta, além do DNA recém sintetizado, um RNA iniciador que será substituído por desoxirribonucleotídeos pela DNA polimerase I e a DNA ligase reconstituirá a nova fita.
O filamento líder possui apenas um RNA iniciador que também será substituído pela DNA polimerase I.
TRANSCRIÇÃO DO DNA
Após ser replicado, a informação contida no DNA precisa ser repassada para moléculas de RNA. A cada vez que a célula precisar produzir uma proteína, o ribossomo precisa saber qual será a sequência de aminoácidos dessa proteína. Essa informação está contida em uma determinada sequência de nucleotídeos da molécula de DNA.
Porém, o DNA se encontra no núcleo da célula, enquantoo ribossomo está no citoplasma. Então, alguém tem que trazer até o ribossomo uma cópia da informação presente no DNA. Quem faz esse intercâmbio de informações é a molécula de RNA mensageiro.
Portanto, a transcrição é a síntese de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) complementar a um filamento molde de ácido desoxirribonucleico (DNA). A enzima responsável pela síntese dos RNAs chama-se RNA polimerases.
Todos os RNAs são sintetizados na direção 5’ para 3’ e todas as RNAs polimerases são capazes de iniciar a síntese de RNA.
Existem três tipos de RNA:
RNA ribossômico: (RNAr)
RNA transportador: (RNAt)
RNA mensageiro: (RNAm)
Quando o RNAm é sintetizado a partir de uma das fitas da molécula de DNA, ele é chamado de transcrito primário ou pré-RNAm.
No caso de eucariotos, o genoma é geralmente complexo, apresentando regiões codificantes para aminoácidos (ÉXONS) e regiões não codificantes para aminoácidos (ÍNTRONS).
Portanto, o RNAm de eucariotos precisará ser processado (splicing) antes de seguir para o citoplasma da célula. Esse processamento normalmente envolve a remoção dos íntrons e a ligação dos éxons.
Dessa forma, o RNAm maduro apresenta somente regiões de éxons, ou seja, regiões que codificam para aminoácidos.
TRADUÇÃO DA MOLÉCULA DE DNA
A tradução consiste na síntese de uma molécula de proteína, que é um componente funcional das células vivas.
O processo de tradução envolve três componentes principais:
O RNA MENSAGEIRO (RNAM):
Que contém a informação necessária para direcionar a síntese de proteínas.
O RNA TRANSPORTADOR (RNAT):
Que carrega os aminoácidos que serão incorporados à proteína.
OS RIBOSSOMOS QUE REÚNEM O RNAM E O RNAT:
Que permite que o aminoácido correto seja incorporado à proteína.
A informação para a síntese da proteína está contida no DNA na forma de um código (código genético), a partir da combinação de três nucleotídeos. Dessa forma, o ribossomo vai movendo-se ao longo do RNAm a cada 3 bases nitrogenadas (códon). Cada códon especifica um aminoácido.
	SEGUNDA BASE DO CÓDON
	
	U
	C
	A
	G
	
	P
R
I
M
E
I
R
A
 
B
A
S
E
 
D
O
 
C
Ó
D
O
N
	
U
	UUU
	
Phe
	UCU
	
SER
	UAU
	
Tyr
	UGU
	
Cys
	U
	T
E
R
C
E
I
R
A
 
B
A
S
E
 
D
O
 
C
Ó
D
O
N
	
	
	UUC
	
	UCC
	
	UAC
	
	UGC
	
	C
	
	
	
	UUA
	
Leu
	UCA
	
	UAA
	
	UGA
	
	A
	
	
	
	UUG
	
	UCG
	
	UAG
	
	UGG
	Trp
	G
	
	
	
C
	CUU
	
Leu
	CCU
	
Pro
	CAU
	
His
	CGU
	
Arg
	U
	
	
	
	CUC
	
	CCC
	
	CAC
	
	CGC
	
	C
	
	
	
	CUA
	
	CCA
	
	CAA
	
Gln
	CGA
	
	A
	
	
	
	CUG
	
	CCG
	
	CAG
	
	CGG
	
	G
	
	
	
A
	AUU
	
Ile
	ACU
	
Thy
	AAU
	
Asn
	AGU
	
Ser
	U
	
	
	
	AUC
	
	ACC
	
	AAC
	
	AGC
	
	C
	
	
	
	AUA
	
	ACA
	
	AAA
	
Lys
	AGA
	
Arg
	A
	
	
	
	AUG
	Met
	ACG
	
	AAG
	
	AGG
	
	G
	
	
	
G
	GUU
	
Val
	GCU
	
Ala
	GAU
	
Asp
	GGU
	
Gly
	U
	
	
	
	GUC
	
	GCC
	
	GAC
	
	GGC
	
	C
	
	
	
	GUA
	
	GCA
	
	GAA
	
Glu
	GGA
	
	A
	
	
	
	GUG
	
	GCG
	
	GAG
	
	GGG
	
	G
	
O código é degenerado, porque mais de um códon pode codificar o mesmo aminoácido, e é universal, pois é o mesmo em bactérias ou no homem.
· Para iniciar a tradução, o ribossomo precisa encontrar o códon AUG (códon de iniciação) que especifica o aminoácido metionina.
· Para terminar a síntese da proteína, existem três códons (UAA, UAG e UGA) chamados de terminação.
O primeiro desses que o ribossomo encontrar entende que a síntese da proteína deve terminar. Lembrando que esses códons de parada ou terminação não especificam aminoácidos.
 DNA transcrição RNA tradução Proteína
Armazena as Mensageiro Exerce as funções
informações celulares
O QUE É UM GENE?
O conceito de gene pode ser definido como uma sequência de nucleotídeos na molécula de DNA que têm a informação necessária para a síntese de uma proteína ou um RNA.
O genoma humano tem aproximadamente 30.000 genes.
O gene é constituído por uma região promotora, regiões de éxons e regiões de íntrons. A região promotora é o sítio de ligação para a RNA polimerase, enzima responsável pela síntese do RNA mensageiro.
Promotor = Sequência de DNA que permite a transcrição de um gene
Os genes estão distribuídos ao longo da molécula de DNA que constitui os nossos cromossomos.
O QUE SÃO OS CROMOSSOMOS?
O DNA é empacotado em cromossomos individuais associados a proteínas especiais chamadas de histonas. Cada cromossomo contém uma única molécula de DNA. Os cromossomos variam em número entre as espécies.
Exemplo:
· A espécie humana apresenta 23 pares de cromossomos em suas células diploides;
· As vacas têm 39 pares de cromossomos;
· Crocodilos têm 16 pares de cromossomos.
Nas células humanas existem 46 cromossomos, dos quais 44 formam 22 pares compostos por elementos idênticos e são chamados de autossomos.
Os outros dois cromossomos formam o par sexual, que na mulher é composto por 2 cromossomos X e no homem por um X e um Y.
AULA 3 - HISTÓRIA DA GENÉTICA FORENSE E EVIDÊNCIAS BIOLÓGICAS EM LOCAIS DE CRIME – CADEIA DE CUSTÓDIA
HISTÓRICO DA GENÉTICA FORENSE
Apesar de todos os indivíduos da população humana serem pertencentes a espécie Homo sapiens e, portanto, partilharem muitas características, incluindo o mesmo material genético, este não é exatamente igual em sua sequência de nucleotídeos. Existem pequenas diferenças no DNA, que fazem de nós pessoas únicas.
Dessa forma, cada um de nós tem o seu próprio perfil de DNA ou perfil genético, baseado na identificação dessas diferenças. Quando essas diferenças são estudadas e detectadas, é possível fazer a identificação dos indivíduos.
Assim, a Genética Forense foi estabelecida e teve a sua evolução, a partir de 1985, quando Alec Jeffreys e seus colaboradores da Universidade de Leicester, no Reino Unido, desenvolveram uma técnica para analisar essas características particulares de cada pessoa.
Essa metodologia foi chamada de DNA fingerprinting, ou seja, a “impressão digital do DNA”.
A determinação do perfil genético baseado nas diferenças do DNA de cada um, pode ser usada para:
01. Evidenciar a culpa de criminosos.
02. Isentar pessoas inocentes de determinados crimes.
03. Determinar a paternidade em caso de dúvidas, elucidando possíveis trocas de bebês em berçários de maternidades, por exemplo.
04. Determinar relações familiares em casos de imigração.
A análise feita em seu DNA e de sua família, que residia na Inglaterra, comprovou a relação de parentesco, permitindo assim o regresso de Alec ao lar.
O GATO COMO TESTEMUNHA
Em 1994, o corpo de Shirley Duguay, 32 anos e mãe de 5 filhos, foi encontrado em uma cova, enterrado alguns meses antes, na Província de Prince Edward Island, Canadá. Seu companheiro, Douglas Beamish, era o principal suspeito do crime.
Durante a busca do corpo, a polícia descobriu um saco plástico contendo uma jaqueta de couro com manchas de sangue, que o exame de DNA comprovou ser da vítima. A jaqueta também estava coberta com pelo de gato.
Os policiais imediatamente lembraram-se que havia um gato branco peludo na casa de Douglas. Se fosse possível comprovar que o pelo presente na jaqueta pertencia ao gato do suspeito, seu envolvimento no crime poderia ser estabelecido.
Entretanto, o DNA do gato não poderia ser avaliado a partir do mesmo perfil de polimorfismos estabelecido para humanos.
Os policiais então procuraram uma pesquisadora do Laboratório de Diversidade Genômica em Frederik, Maryland, que conseguiu provar que o pelo encontrado na jaqueta realmente pertencia ao gato do suspeito do crime.
Esse foi o primeiro caso registrado em que o DNA de um animal foi aceito como evidência na resolução de um crime. A partir disso, surgiu interesse do Departamento de Justiça americano em criar o banco de dados nacional em felinos.
Portanto, desde esse relato, gatos e cachorros têm fornecido evidências em dezenas de crimes nos Estados Unidos e Canadá.
TIPAGEM SANGUÍNEA
A primeira tentativa de se fazer a identificação de pessoas foi a partir da tipagem sanguínea. Os grupos sanguíneosdo sistema ABO foram descobertos em 1900 por um médico chamado Karl Landsteiner.
Esse acabou sendo o primeiro sistema a ser sugerido como uma maneira de solucionar crimes, identificando o tipo sanguíneo de um suspeito e comparando ao encontrado na cena do crime, por exemplo. Isso permite a prova de exclusão, ou seja, é possível provar que uma amostra não pertence a certa pessoa.
Entretanto, provar que uma amostra realmente pertence a uma pessoa específica, prova de inclusão, se torna mais difícil porque depende de informações genotípicas.
O CASO PITCHFORK, INGLATERRA: PRIMEIRO CASO DE CONDENAÇÃO POR MEIO DO DNA
Lynda Mann, uma menina de 15 anos, foi estuprada e assassinada em 1983, na vila de Narborough, ao sul de Leicester. Na época, foi recolhido sêmen do seu corpo e foi estabelecido que pertencia a um indivíduo que apresentava um perfil de enzimas coincidente com 10% da população masculina. Sem outras evidências o caso foi arquivado.
Em 1986, Dawn Ashworth, também com 15 anos, foi estuprada e estrangulada na mesma área. De acordo com a amostra de sêmen colhida no corpo da garota, a polícia confirmou que o criminoso tinha o mesmo tipo sanguíneo do assassino de Lynda.
Um rapaz local, Richard Buckland, acabou confessando o assassinato de Dawn, mas não o de Lynda. Para esclarecer o crime, a polícia entrou em contato com Alec Jeffrey para que ele pudesse usar a sua técnica e comparar o DNA das duas amostras de sêmen com o DNA de Richard, pois eles acreditavam que o rapaz teria cometido os dois crimes.
Jeffrey não encontrou combinação entre o DNA das amostras e o DNA de Richard, mas esclareceu que as duas amostras de sêmen eram pertencentes a mesma pessoa.
A polícia, então, decidiu coletar amostras de 5.000 homens da cidade e, após 6 meses de trabalho, não foi encontrada nenhuma combinação com o DNA das amostras de sêmen.
Um ano depois, uma mulher ouviu um rapaz comentar que Ian Kelly havia doado a amostra de sangue no lugar do seu amigo Colin Pitchfork, um padeiro local.
Colin foi preso e, após a coleta de amostras, foi constatada a combinação do seu DNA com o encontrado nas amostras de sêmen das vítimas. Ele, então, confessou os dois crimes e, em 1998, foi condenado à prisão perpétua.
O Reino Unido apresenta um banco de dados de amostras de DNA desde 1995. É o mais antigo e conhecido pela sigla NDNAD (National DNA Database). É também a maior e a mais abrangente base de dados forenses de DNA nacional em todo o mundo.
IMPRESSÕES DIGITAIS
Como vimos no histórico, as impressões digitais também podem ser usadas na elucidação de crimes, já que são características de cada pessoa e se mantêm em um mesmo padrão por toda a vida.
Porém, essas impressões nem sempre podem ser identificadas de maneira total em cenas de crimes.
O DNA, por outro lado, pode ser extraído de uma única célula a partir de qualquer material biológico.
O projeto Inocência foi criado em 1992, na Escola de Direito Benjamin N. Cardozo, em Nova York, por Barry C. Scheck e Peter J. Neufeld, com a proposta de analisar casos jurídicos após condenação, nos quais evidências de DNA poderiam produzir provas conclusivas da inocência do indivíduo condenado. Até o momento, mais de 300 pessoas nos Estados Unidos foram inocentadas por testes de DNA. Eram presos que cumpriram uma média de 13 anos de prisão antes de serem inocentados e liberados.
FLORIDA × ANDREWS
Nos Estados Unidos, em 1986, houve a primeira aceitação de identificação de DNA em cortes americanas. O caso ficou conhecido como Florida × Andrews e a análise do DNA foi usada para identificar a pessoa responsável por invadir 20 residências e cometer estupros durante essas invasões.
Em 1993, o acusado do caso “Estado de Maryland X Bloodsworth”, que estava preso desde 1984, foi inocentado, após a análise de DNA, do crime de estupro seguido de morte de uma menina de 9 anos.
A partir de 1987, o FBI e laboratórios de criminalística de vários países passaram a aceitar amostras de materiais biológicos encontrados em locais de crime como evidências e até mesmo como prova.
HISTÓRICO DA GENÉTICA FORENSE NO BRASIL
1992:
A Genética Forense no Brasil começou a ser desenvolvida a partir de 1992, por iniciativa da Polícia Civil do Distrito Federal (PCDF) que, por meio de sua Polícia Técnica, começou a realizar técnicas para análise de DNA, bem como a implantar seu próprio laboratório para auxiliar as perícias criminais.
1994:
Entretanto, a utilização do DNA como prova jurídica só foi utilizada pela justiça brasileira em 1994, quando dois peritos criminais foram encaminhados aos Estados Unidos para realizarem análises de DNA em uma amostra biológica relacionada a dois crimes praticados em Brasília. Nesse mesmo ano, foi criada a Divisão de Pesquisa de DNA Forense (DP/DNA), no âmbito da Polícia Civil do Distrito Federal, responsável pela realização de exames forenses criminais.
2001:
A principal utilização forense no nível de análise de DNA no Brasil está associada ao esclarecimento de vínculo genético. A partir de 2001, com base na Lei no 10.317, todas as despesas relacionadas a exames de DNA que forem solicitados por autoridade judiciária nas ações de investigação de paternidade ou maternidade seriam custeadas pelo próprio poder judiciário.
2012:
Com a Lei n° 12.654, de 28 de maio de 2012, foi criado o banco nacional de DNA que visa auxiliar na elucidação de crimes e também a criação de uma central de informações genéticas.
Atualmente, todos os Estados realizam exames forenses tanto no âmbito cível quanto criminal. Contudo, para fins de investigação criminal, o órgão mais avançado, experiente e de maior evidência na realização de exames de DNA, é o Instituto Nacional de Criminalística-INC, o qual encontra-se na cidade de Brasília e subordinado ao Departamento de Polícia Federal e ao Ministério da Justiça.
Na última década, a partir de esforços da Secretaria Nacional de Segurança Pública (SENASP), vários laboratórios de DNA forense foram criados dentro de padrões internacionais. Foi também estabelecido um convênio entre a Polícia Federal e o FBI para uso do CODIS¹, no intuito de se estabelecer, no país, banco de dados de perfis genéticos.
(¹ COMBINED DNA INDEX SYSTEM - O mesmo FBI criou, em 1998, o CODIS, o seu sistema nacional de dados que compartilha eletronicamente perfis de DNA.
Desde então, em todos os 50 estados americanos, qualquer indivíduo que passe pelo sistema prisional tem amostras recolhidas para a análise do seu DNA e, consequentemente, seu perfil genético será inserido nesse banco de dados.)
EVIDÊNCIAS BIOLÓGICAS EM LOCAIS DE CRIMES
O local ou a cena do crime se refere ao espaço ou entorno de um ponto específico onde tenha ocorrido um incidente (passível de infração penal). Portanto, o ideal é que esse espaço possa abranger todos os possíveis locais onde exista uma possibilidade real de serem encontrados elementos materiais que possam ter relação com a consumação do ato de delito.
Acontecimentos, sejam eles de natureza criminosa, acidental ou de causas naturais deixa traços (elementos materiais) no local. Logo, durante o processo de identificação do local e sua consequente investigação, podem ser encontrados vestígios de diferentes naturezas:
	Vestígios
	Pegadas
	Impressões digitais:
Nas impressões digitais, existe a possibilidade de se obter pequenas porções do tecido orgânico e, portanto, se obter DNA.
	Elementos resultantes de disparos de armas de fogo
	Fragmentos ou partículas de contato com a cena do crime
	Terra
	Pólen
	Restos de plantas
	Evidências biológicas
	Manchas de sangue
	Esperma
	Saliva e restos de pele
As evidências biológicas são de particular interesse, por conta da possibilidade de obtenção de material que pode ser identificado a partir das técnicas de genética forense. Devido ao caráter orgânico, essas evidências podem facilmente sofrer degradação pela ação de microrganismos, temperatura, chuva etc.
Esses materiais biológicos também podem ser contaminados devido ao simples contato com demais outras amostras; e, como nem sempre podem estarvisíveis a olho nu, se faz necessário, quase sempre, o uso de equipamentos que possam revelar manchas ou restos celulares escondidos em roupas, por exemplo.
A obtenção de informações a partir desses elementos dependem de sua confiabilidade. Para isso, é necessário a preservação da sua integridade.
Portanto, é importante agir com cuidado durante todo o processo de exame e identificação dos elementos encontrados no local do crime, para que todas as evidências possam ser admissíveis para fins judiciais.
Considerando-se todas as fontes disponíveis em investigações (testemunhas, confissões), as evidências materiais, quando devidamente identificadas e tratadas, geralmente oferecem informações objetivas e confiáveis acerca do delito ocorrido. No entanto, o valor da evidência pode ser contestado, se a cadeia de custódia não for adequadamente constituída.
CADEIA DE CUSTÓDIA
Compreende uma série de procedimentos que se inicia com a coleta e a identificação inicial dos vestígios relacionados a um crime, o seu devido acondicionamento, e todos os procedimentos de registro de documentação cuidadosa e cronológica das evidências, incluindo o registro da transferência do material entre instituições e sua deposição final.
Por isso, existem protocolos legais a serem seguidos que envolvem todos esses mecanismos de documentação, organização e preservação da prova material, como também a sua localização. Isso permite que em qualquer momento do processo judicial, essa amostra possa ser rastreada e sua integridade esteja preservada.
São fundamentos importantes da cadeia de custódia:
IDENTIFICAÇÃO:
Os vestígios devem ser corretamente identificados.
PRESERVAÇÃO:
Todas as características originais dos vestígios recolhidos devem ser preservadas.
REGISTROS E FORMULÁRIOS:
Todas as possíveis trocas de custódia ocorridas durante o decorrer do processo devem ser registradas, para possível identificação e responsabilização das diversas pessoas que tiveram acesso a prova, seu manuseio e guarda.
SEGURANÇA:
Garantia de acesso à prova somente de pessoas autorizadas e registradas.
RELATÓRIO:
Todas as ações devem ser registradas em formulários específicos: tipo de vestígio, responsáveis por cada etapa, data e hora da passagem de custódia.
Todo esse conjunto de procedimentos associados à cadeia de custódia são de extrema relevância para as análises forenses, evitando o comprometimento das provas materiais.
AULA 4 - COLETA E PRESERVAÇÃO DE VESTÍGIOS, COLETA DE AMOSTRAS, EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE DNA
PRESERVAÇÃO DOS VESTÍGIOS
As amostras biológicas em locais de crime devem ser devidamente preservadas para que seja possível fazer uma análise de DNA confiável e segura, isso ocorre pois, rotineiramente o DNA contido nessas amostras, presentes nos vestígios, é bastante escasso.
Dessa forma, para que o DNA possa alcançar seu alto grau de confiabilidade, é preciso inicialmente que se possa confiar nas amostras obtidas.
Caso a amostra seja coletada de forma indevida, existe uma grande possibilidade de contaminação (mistura entre diferentes tipos de material biológico) ou mesmo degradação das provas no local do crime.
COLETA DAS AMOSTRAS
AMOSTRAS BIOLÓGICAS
O DNA pode ser obtido de qualquer célula nucleada a partir de várias fontes de materiais biológicos, como por exemplo:
SANGUE:
Aqui são consideradas apenas as células nucleares sanguíneas como fonte para obtenção de DNA.
Vale desde manchas sanguíneas deixadas na cena do crime em roupas e objetos até a coleta de gotas de sangue para confirmação de vínculo genético.
SÊMEN PRESENTE EM AMOSTRAS VAGINAIS:
Deve ser considerado nesse caso que haverá espermatozoides que contêm o DNA do agressor, bem como células epiteliais com DNA da vítima.
BULBO CAPILAR:
Nem todas as amostras de fio de cabelo apresentam DNA.
Por isso, é necessário que, na coleta de fios de cabelo, seja mantido o bulbo capilar, onde existe presença de células em intensa divisão. Portanto, com quantidade suficiente de DNA (Figura 1).
SALIVA:
Na composição da saliva podem estar presentes células nucleadas individuais.
No caso de cenas de crime, a saliva pode ser encontrada em lesões provocadas por mordidas, dentre outros.
Vale ressaltar que a coleta de saliva diretamente da boca do suspeito deve considerar a necessidade de cuidadosamente retirar células da mucosa oral durante a coleta, pois estas são as fontes de DNA.
TECIDOS CADAVÉRICOS:
O tecido a ser coletado dependerá em especial do intervalo post mortem (“depois da morte”).
INSTRUMENTOS PARA COLETA
SUABES (OU SWAB):
A haste é flexível e, no caso das análises forenses, o swab deve ser estéril e vir acompanhado de um tubo coletor. Na foto, swab com tubo de armazenamento utilizado em análises forenses. Podem haver dois tipos de terminações possíveis em um swab, material absorvente ou escova. São possíveis duas formas de coleta com swab, em manchas de sangue nos locais de crime ou pela coleta de células da mucosa em indivíduos.
PAPEL FTA:
O FTA é um papel que é estruturado com celulose e que contém sustâncias químicas para proteger a molécula de DNA de degradação por nucleases (enzimas que degradam ácidos nucleicos) e evitar a proliferação de micro-organismos. Dentro do círculo representa o local onde deve ser inserida a amostra de sangue. Após a coleta, é importante deixar secar o sangue totalmente.
TUBOS DE COLETA:
Para análises de DNA, os tubos de coleta de sangue devem ser aqueles com tampa roxa, que tem como anticoagulante o EDTA.
COMO COLETAR?
SANGUE:
Se estiver seco, é indicado raspar com espátula e colocá-lo em embalagem apropriada como envelopes. Se estiver úmido, coletar com swab.
ESPERMA:
Pode ser coletado com suabes ou levar todo o objeto ou parte dele para o laboratório (exemplo: esperma em tapetes).
RESTOS ORGÂNICOS:
Fragmentos de ossos, tecidos ou órgãos devem ser coletados com pinça, acondicionados e imediatamente refrigerados.
PELOS:
Utilizar fita adesiva para amostragem mais geral em roupas ou utilizar pinça nos casos em que os pelos estiverem bem visíveis.
SALIVA:
Coletar o objeto onde se acredita haver saliva, como cigarros, canudos etc. No caso de mordidas, coletar com Swab.
RESTOS CADAVÉRICOS:
Em cadáveres recentes pode se obter fragmentos mais conservados de tecido muscular e cartilaginoso, ou ainda sangue da cavidade cardíaca ou das veias calibrosas.
Nas situações em que os fenômenos cadavéricos já estiverem generalizados, a prioridade é a coleta de fragmentos ósseos ou elementos dentários.
EXTRAÇÃO DE DNA: PRINCÍPIOS E TÉCNICAS
Tem por finalidade solubilizar o DNA. Para isso, deve promover a lise das membranas celulares, núcleos e organelas.
A obtenção do DNA pode ser realizada simultaneamente com a desintegração do tecido, adicionando tampão de extração, antes do processo de homogeneização.
ETAPAS PARA EXTRAÇÃO DE DNA
O DNA é obtido por centrifugação, separando o material insolúvel. Para extração do DNA, é necessário seguir alguns passos importantes, que incluem:
DESINTEGRAÇÃO DAS CÉLULAS:
Existem diversos métodos que podem ser utilizados nesse processo, conforme apresentado na tabela abaixo. Esses métodos podem ser utilizados individualmente ou combinados. Veja:
	Técnica
	Aplicações
	Princípio
	Brandas
	Lise celular com tampões específicos
	Rompimento de eritrócitos (não utilizados); lise de glóbulos brancos (contém DNA)
	Rompimento osmótico da membrana celular
	Digestão enzimática
	Proteases para tecidos e culturas de células animais
	Enzimas degradam as proteínas das células
	Homogeneização manual
	Tecidos moles (fígado) e tecidos fibrosos (músculo) devem ser picados anteriormente
	As células são forçadas através de fendas estreitas determinando o rompimento da membrana celular
	Moderada
	Homogeneizadores com lâminas cortantes
	Tecidos animais fibrosos
	As lâminas cortantes arrebentam as células (liquidificador)
	Vigorosa
	Ultrassom
	Células em suspensão
	As ondas sonoras de alta frequência provocam o rompimento mecânico das membranas
Nessa etapa, é fundamental a escolha correta de um tampão de extraçãoque seja adequado. Cada um dos componentes tem funções específicas durante o processo de extração do DNA.
Veja alguns componentes importantes nesses tampões de extração:
· Substâncias tamponantes (Tris-HCl);
· Substâncias osmoticamente ativas (NaCl);
· Detergentes1: substâncias tensoativas.
· Proteases: a eficiência de dissociação das proteínas dos ácidos nucleicos por SDS é aumentada com a incubação das células com proteases, como, por exemplo, proteinase K (baixa especificidade e alta atividade);
· Inibidores de nucleases (DNases): nucleases são enzimas que degradam DNA. Para que o DNA de interesse não seja degradado, é necessário incluir inibidores dessas enzimas.
(¹ Todo detergente apresenta uma região hidrofílica e outra hidrofóbica. Agem dissociando as proteínas dos ácidos nucleicos, dissolvendo os lipídeos de membranas.
Em alguns casos, inibe a ação de nucleases (Exemplo de detergente: SDS, dodecil sulfato de sódio).
Outros detergentes: CTAB (brometo de N-cetil-N,N,N-trimetilamônio); Sarcosil (lauroil sarcosinadto de sódio) e Triton X-100 ou Nonidet P-40 (detergentes neutros).)
FRACIONAMENTO DO MATERIAL:
Refere-se à utilização de um equipamento denominado centrífuga para separar os restos celulares do DNA de interesse.
É possível fazer uma centrifugação diferencial de acordo com a velocidade de sedimentação.
Exemplo:
· 600 rpm- rotação por minuto (10 min): núcleos;
· 15.000 rpm (5 min): mitocôndrias;
· 100.000 rpm (60 min): membrana plasmática;
· 300.000 rpm (2 horas): subunidades dos ribossomos.
PRECIPITAÇÃO DO DNA:
A precipitação com etanol é útil para concentrar o DNA e para remover resíduos de fenol e clorofórmio de amostras sem proteínas.
A precipitação, geralmente, é realizada adicionando uma fração do volume de uma solução salina concentrada seguida de 2 volumes de etanol gelado.
Dependendo da quantidade de DNA, a amostra é centrifugada ou incubada em gelo seco ou refrigerada em freezer a -70°C ou -20°C.
A precipitação em etanol com rápida incubação em temperatura ambiente e baixas concentrações de sais permite a precipitação do DNA.
Longos períodos de incubação (overnight) precipitam todos os ácidos nucleicos e permitem a precipitação de DNA em pequenas amostras com baixas concentrações.
LAVAGEM DO DNA:
Essa etapa deve ser realizada para remover sais que ainda estejam na solução que contém o DNA.
A maioria dos sais são solúveis em etanol (EtOH) 70%.
Para realizar a dessalinização, a amostra de DNA deve passar por múltiplas lavagens com EtOH 70%. Devido a menor solubilidade, o NaCl é mais difícil de ser removido.
MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA
EXTRAÇÃO PELO MÉTODO DE FENOL-CLOROFÓRMIO-ÁLCOOL ISOAMÍLICO (EXTRAÇÃO ORGÂNICA):
Indicado para análises forenses, é o método mais usado na extração e purificação de DNA.
O fenol age desnaturando as proteínas, permitindo o isolamento de DNA e RNA de misturas biológicas.
A adição de clorofórmio aumenta a eficiência das extrações, agindo também na desnaturação de proteínas.
Sua alta densidade permite a separação de fases.
Geralmente, utiliza-se uma mistura de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1 v/v/v). O álcool isoamílico é adicionado ao clorofórmio como antiespumante.
O fenol deve ser previamente equilibrado levando em consideração as condições de pH e salinidade.
Exemplo: se na extração for utilizado fenol equilibrado em pH 5-6, o DNA ficará na fase orgânica (fase inferior) e o RNA na fase aquosa (fase superior).
EXTRAÇÃO EM PAPEL FTA:
Indicado para análises forenses, esse método serve particularmente para amostras sanguíneas.
A extração com FTA se inicia já quando o sangue entra em contato com o papel. Nesse momento, as células sanguíneas são lisadas e o DNA é imobilizado na matriz do papel, podendo ficar estável por até cinco anos.
No laboratório é retirado um pequeno pedaço desse papel e depositado em um tubo para lavagem. O DNA presente na fibra é lavado utilizando solvente específico (Figura 6).
EXTRAÇÃO CHELEX:
Também indicado para análises forenses, é o método para extração de DNA em manchas de sangue, sêmen, dentre outros.
Consiste no uso de uma suspensão de uma resina quelante que pode ser diretamente aplicada na amostra.
Com a presença da resina e o aumento da temperatura, ocorre o rompimento das membranas celulares e o DNA é extraído (Figura 7).
QUANTIFICAÇÃO DO DNA
Quando se desejar determinar a concentração do DNA extraído da amostra forense, deve-se utilizar:
ABSORÇÃO DE LUZ ULTRAVIOLETA:
O DNA absorve a luz ultravioleta em um comprimento de onda 260nm, enquanto nas proteínas a leitura ocorre a 280nm.
A razão entre absorbâncias medidas a 260 e 280nm dá uma indicação do grau de pureza dos ácidos nucleicos.
Exemplo: para o DNA, a razão deve estar DNAs puros A260/A280 = 1,8-1,9. Nesse caso, essa técnica necessita de equipamento, denominado espectrofotômetro, que faça a leitura de absorbância nesses diferentes comprimentos de onda.
Existem diferentes tipos de espectrofotômetros, um deles é chamado de NanoDrop®.
TÉCNICAS DE FLUORESCÊNCIA:
Os ácidos nucleicos não apresentam fluorescência. Porém, a adição de intercaladores fluorescentes, como a bisbenzimida, possibilita a quantificação de ácidos nucleicos.
1000 vezes mais sensível que pelo método de UV para DNA, mas, na prática laboratorial, os métodos com ultravioletas são mais utilizados, por serem mais simples e baratos.
Para determinar o tamanho do DNA ou a qualidade do mesmo (DNA íntegro ou degradado) deve ser utilizada a técnica:
ELETROFORESE DE DNA TOTAL:
A eletroforese é o método de escolha para separar, identificar e quantificar fragmentos de DNA.
A separação do DNA ocorre pelo tamanho, diferentemente das proteínas, que podem ser separadas baseando-se no tamanho, na carga e no pH.
A localização do DNA dentro do gel pode ser determinada por meio da coloração com agentes intercalantes, como o Brometo de Etídio, para os géis produzidos com o polímero agarose.
Outros agentes específicos para ácidos nucleicos duplas fitas podem também ser usados como Syber Green.
Os géis de agarose (polímero de dextranas purificado de algas) têm ponto de fusão a 66°C e temperatura de gelificação a 30°C. São usualmente horizontais e submersos em tampão.
Quando a eletroforese é feita com o objetivo de quantificar (determinar o tamanho) e ver a qualidade do DNA total, a concentração de agarose pode variar de 0,8% a 1% (ou seja, se for fazer um gel com 100ml de solução tampão, é necessário utilizar 0,8g ou 1g de agarose, respectivamente).
Outro ponto importante, é que a determinação do tamanho DNA de interesse depende da utilização de um DNA padrão (chamado de marcador molecular), em que o tamanho de cada fragmento é previamente conhecido.
AULA 5 - MARCADORES GENÉTICOS — DNA FINGERPRINT, POLIMORFISMOS GENÉTICOS — PARTE I
PREMISSA
A pintura mostrada acima, da artista brasileira Tarcila do Amaral, retratando a causa operária da época, evidencia também as diferenças fenotípicas da nossa população.
O que determina essas diferenças?
A resposta está na molécula de DNA. As diferenças que nos fazem pessoas únicas (as variações no DNA) são chamadas de polimorfismos¹.
(¹ A palavra polimorfismo é originária do Grego e significa “muitas formas”:
Poli = muitas; Morphos = formas)
· Os genes são constituídos de sequências de nucleotídeos presentes na molécula de DNA.
· Alterações nessas sequências que ocorrem na população de forma estável, sendo encontradas com frequência de 1% ou superior, são chamadas de polimorfismos genéticos.
POLIMORFISMOS
De maneira mais clara, o polimorfismo genético é uma variação genética, encontrada em pelo menos 1% da população. Esses polimorfismos podem contribuir para características como a cor da pele, tipo sanguíneo, predisposição ao desenvolvimento de alguma doença ou a resposta do indivíduo a um determinado medicamento.
· Moluscos Donax variabilis apresentam enorme variabilidade quanto ao padrão de cores das conchas.
· O mesmo se dá em relação à cor do pelo em cães da raça labrador.
O genoma humano possui cerca de 30.000 genes, com um total de3,2 bilhões de nucleotídeos, onde estão presentes mais de 2 milhões de polimorfismos genéticos que ocorrem com uma frequência de 1 a cada 1.250 pares de bases.
Esses polimorfismos podem atuar como marcadores genéticos, pois são transmitidos associados a outros genes localizados em regiões cromossômicas próximas a eles.
Dessa forma, se um polimorfismo estiver próximo a um gene que causa uma doença, todos os portadores da doença recebem o gene causador da doença e também o polimorfismo que será o marcador deste gene.
CLASSIFICAÇÃO DOS POLIMORFISMOS
Os polimorfismos genéticos podem ser chamados de:
FUNCIONAIS:
Quando estão associados a doenças genéticas
NÃO FUNCIONAIS:
Quando a sua presença não tem associação a uma condição de doença
Esses polimorfismos podem estar presentes em regiões de íntrons e éxons.
E existem, basicamente, dois tipos de polimorfismos que não têm associação com doenças:
· Polimorfismos em que a sequência de bases é alterada
· Polimorfismos em que o comprimento da sequência é alterado pelo número de sequências repetidas in tandem (repetidas em sequência)
Esses polimorfismos estão presentes em regiões de íntrons.
POLIMORFISMOS DE NUCLEOTÍDEOS SIMPLES/ÚNICO (SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM) – SNP
Os SNPs constituem 90% de toda as variações genômicas humanas e aparecem, em média, uma vez a cada 600 pares de bases. Já foram encontrados mais de 10 milhões deles ao longo do nosso genoma.
Observe na figura acima as 3 sequências de DNA:
· Em uma dada posição, a 1ª sequência tem a base Adenina
· Já na 2ª sequência foi substituída pela base Guanina
· Na 3ª, ela foi substituída pela Timina
Resumo: os 3 indivíduos apresentam sequências diferentes devido à presença desse SNP.
Pronuncia-se “snip” – corresponde à alteração de uma única base na sequência de nucleotídeos.
POLIMORFISMO DO COMPRIMENTO DO FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISMS – RFLP)
Esses polimorfismos podem ser identificados com o uso de enzimas de restrição.
Como essas enzimas reconhecem sequências específicas de bases de DNA, a alteração de uma base na sequência de nucleotídeos pode criar ou fazer com que um sítio de restrição desapareça. Dessa forma, se o DNA for digerido com a enzima de restrição adequada, o polimorfismo pode ser observado por uma mudança no tamanho do fragmento.
RFLPs apresentam dois alelos possíveis.
Portanto, cada indivíduo pode ser homozigoto ou heterozigoto para um polimorfismo do tipo RFLP.
Observe na imagem a seguir o exemplo da genotipagem de indivíduos afetados pela anemia falciforme:
A deformação da hemácia (em forma de foice) que está presente em indivíduos com a anemia falciforme é decorrente de uma mutação de ponto, ou seja, a troca de uma base A por uma T.
Veja na figura que isso gera uma troca do aminoácido Ácido glutâmico pela Valina. Então, no heredograma da figura acima:
· Quem tem só um fragmento maior é o afetado (homozigoto para o alelo mutante)
· Quem tem somente o fragmento menor é normal (homozigoto para o alelo normal)
· Quem tem os dois fragmentos são heterozigotos (alelo mutante + alelo normal)
Esses indivíduos heterozigotos são normais, mas podem transmitir o alelo mutante para os filhos. Portanto, precisam fazer o aconselhamento genético.
Esse polimorfismo (RFLP) foi o primeiro a ser usado em testes de DNA forense. Porém, para se usar esse polimorfismo como marcador para a identificação humana, é necessária uma grande quantidade de DNA não degradado.
Sendo assim, nessa metodologia, a base de RFLP não é mais usada pelos laboratórios de análises forenses.
NÚMERO VARIÁVEL DE REPETIÇÕES IN TANDEM (VARIAVEL NUMBER OF TANDER REPEATS) - VNTR
São também conhecidos como minissatélites e são marcadores altamente polimórficos, ou seja, são regiões hipervariáveis. Consistem de sequências nucleotídicas repetidas que variam em quantidade com relação ao número de ocorrência da sequência em questão.
Veja o exemplo da sequência “GAGGCGG” representada na figura abaixo.
Alguns indivíduos na população podem apresentar 2 vezes essa repetição. Enquanto outras podem apresentar 3, 4, 6 vezes essa repetição.
Embora cada indivíduo apresente no máximo dois alelos diferentes (geralmente se é heterozigoto para esse tipo de locus), muitos alelos podem estar presentes na população.
Durante a meiose, os cromossomos do pai e da mãe precisam ficar próximos (pareados) para que ocorra o crossing-over, ou seja, eles vão trocar segmentos entre si.
Essas sequências repetidas in tandem podem provocar erros durante esse pareamento cromossômico, produzindo, assim, alelos com número de cópias aumentando ou diminuindo em relação à sequência original.
Por isso, apesar da localização desses VNTRs ser constante no genoma humano, o número de sequências repetidas em cada um deles é muito variável entre os indivíduos. Isso significa que dificilmente encontrará uma pessoa que tenha exatamente a mesma quantidade de repetições que você na população, a não ser que partilhem do mesmo material genético, como o caso dos gêmeos idênticos.
Essa figura exemplifica o caso de um indivíduo que, para essa repetição, tem um alelo com 8 repetições dessa sequência GATA, e outro alelo com 11 repetições dessa mesma sequência. Então, para esse locus, o genótipo do indivíduo é 8-11.
Inúmeras dessas sequências de VNTRs encontram-se distribuídas através dos 23 pares de cromossomos humanos.
Vamos ver o exemplo do uso desses VNTRs na identificação humana:
Essa imagem é referente ao gel de eletroforese após a hibridização com sondas de DNA específicas. Trata-se de uma comparação entre o padrão de VNTR encontrado em uma amostra de sangue e o padrão de VNTR correspondente a 7 suspeitos.
Cada VNTR é representado por uma banda escura, outras ficam mais claras.
São usadas sondas (sequências de DNA complementares às regiões de VNTRs estudadas) marcadas com material radioativo. Essas sondas, ao encontrarem sequências de DNA complementares, se ligam nessas sequências (usa-se o termo hibridização).
Então, observando e comparando o padrão dessas bandas referentes ao padrão de VNTRs dos suspeitos e das bandas geradas do material da amostra de sangue, pode-se dizer que a amostra de sangue é pertencente ao indivíduo 3.
Perceba que todas as bandas são coincidentes entre si.
Ao se analisar a evolução das estratégias para determinação de identidade genética, que se tornou um procedimento sensível e informativo, pode-se notar três fases:
FASE INICIAL:
Após a descrição de um marcador voltado ao polimorfismo genético em 1980, que deu origem às impressões digitais de DNA, com a aplicação de técnicas de polimorfismo de tamanho dos fragmentos de restrição — Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP);
SEGUNDA FASE:
Incorporação de novas técnicas, no final da década de 1980, permitiu um significativo aumento na sensibilidade dos métodos e a consequente identificação de indivíduos com amostras colhidas de fragmentos de unhas, goma de mascar etc.;
TERCEIRA ETAPA:
Mais recente, tem ênfase na padronização metodológica e estatística e na geração de bancos de dados.
Embora tenha ocorrido toda essa evolução nas técnicas de análise do DNA, em todas elas se busca identificar os polimorfismos genéticos.
Veja no exemplo abaixo o padrão de marcadores genéticos para irmãos:
Observe que os padrões representados em I e III são iguais quando se comparam as bandas. Nesse caso, tratam-se de gêmeos idênticos ou monozigóticos.
Quando se comparam os padrões de bandas representados em II, nem todas as bandas são coincidentes. Apenas a metade delas são coincidentes. Trata-se, portanto, de indivíduos que partilham de uma mesma linhagem genética, ou seja, são irmãos comuns.
Vamos relembrar alguns pontos importantes?
· Todo ser humano possui duas formas de cada gene. Uma forma recebida de sua mãe e a outra de seu pai;
· Embora a maioria dos genes seja essencialmente igual entre as pessoas, algumas sequências específicas do DNA são extremamente variáveis entre indivíduos;
· O local onde uma dessas sequências hipervariáveis é encontrada no cromossomoé denominado loco;
· Cada um desses locos pode, portanto, ter várias formas diferentes denominadas alelos;
· Essas sequências de DNA contêm várias cópias consecutivas de uma unidade de sequência. Uma atrás da outra, como vagões de trem;
· Em uma população, podemos encontrar alelos diferentes dessa mesma sequência entre os indivíduos onde a diferença entre eles está apenas no número de vezes em que a unidade se repete. Assim, essas sequências são ditas altamente polimórficas.
Temos a sequência ATCG como uma unidade de sequência de um microssatélite:
Se um alelo possuir esta unidade repetindo-se de modo consecutivo 3 vezes, teremos a seguinte sequência:
ATCGATCGATCG
Alelo 1 gerando um fragmento de 12 pares de bases.
Agora tome como exemplo um outro alelo onde esta mesma unidade se repete por 4 vezes.
Deste modo, o fragmento gerado será:
ATCGATCGATCGATCG
Alelo 2 com 16 pares de bases.
Esses dois alelos poderão ser diferenciados de acordo com seus respectivos tamanhos. São justamente essas diferenças no número de repetições destas sequências que resultam na detecção de diferentes alelos.
O locos VNTR são totalmente adequados para serem usados como marcadores genéticos na identificação humana, pois possuem um número muito grande de alelos diferentes.
Sendo assim, é muito improvável que existam indivíduos não aparentados que compartilhem o mesmo genótipo.
REPETIÇÕES CURTAS IN TANDEM (SHORT TANDEM REPEATS) – STR
São conhecidos como microssatélites e gerados por um arranjo em sequência (in tandem) de múltiplas cópias de um pequeno fragmento de DNA (2 a 6 pares de bases apenas).
Veja que na figura acima, tem-se a sequência GATA (somente 4 bases) repetindo-se em número diferente em cada indivíduo. Em um indivíduo se repete 8 vezes, enquanto nos outros 9 e 10 vezes.
Esses polimorfismos são os mais utilizados na genética forense, pois apresentam diversas características: grande variação entre os indivíduos e não muda muito entre as populações.
Dessa forma, os mesmos STRs podem ser usados em países diferentes. Apresentam uma taxa de mutação muito maior, ou seja, existe maior variabilidade genética em relação a esses polimorfismos.
Dentre as aplicações atuais da genética molecular, temos os testes de identificação de pessoas por meio do DNA. Essa técnica, que pode ser usada para identificar suspeitos em investigações policiais, consiste em detectar e comparar sequências repetitivas ao longo de trechos da molécula de DNA, regiões conhecidas como VNTR (número variável de repetições em sequência).
AULA 6 - MARCADORES GENÉTICOS — DNA FINGERPRINT, POLIMORFISMOS GENÉTICOS — PARTE II
ANEMIA FALCIFORME
Vamos começar esta segunda parte da nossa aula sobre polimorfismos com uma curiosidade sobre a anemia falciforme.
 
Glóbulo vermelho normal Glóbulo vermelho em forma de foice (falciforme)
A anemia falciforme faz parte de um grupo de doenças decorrentes de defeitos na molécula de hemoglobina que constitui os nossos glóbulos vermelhos e, portanto, é chamada de Hemoglobinopatia.
Como você pode ver na imagem acima, a hemácia do indivíduo adquire um formato parecido a uma foice (hemácia falcêmica). Dessa forma, é uma variação na estrutura da hemoglobina (Hemoglobina S ou HbS). Como estudamos na aula passada, esse defeito é resultado de uma mutação no gene de uma das cadeias da hemoglobina.
 
Porcentagem da população que possui o alelo da célula falciforme (Hemoglobina S)
· > 6
· 2 – 6
· Malária - falciparum endêmica
Contudo, existe um fato bem interessante relacionado à frequência dessa mutação nas populações, principalmente, nos afrodescendentes. Ou seja, a incidência de anemia falciforme é maior nesse grupo étnico e, isso, tem relação com a origem dessa mutação.
Se você observar o mapa 1, mostra a distribuição do alelo da hemoglobina S, e o outro, no segundo, indica as regiões do continente africano endêmicas para a malária.
Essa doença tem uma distribuição geográfica característica, ocorrendo com mais frequência na África Equatorial e de modo menos comum na área do Mediterrâneo e da Índia.
O surgimento dessa mutação está relacionado à incidência de malária, um exemplo clássico de seleção natural.
No continente africano, que é endêmico para a malária, quem tem anemia falciforme consegue sobreviver mais tempo do que quem não tem a mutação.
Para a população, contrair malária é muito mais prejudicial, pois as chances de óbito são muito maiores.
Já quem tem anemia falciforme, apesar de todas as complicações da doença, como anemia crônica, hemorragias, dores nas articulações etc., consegue sobreviver por mais tempo do que quem adquire malária.
Isso se deve ao fato de que as hemácias anormais não favorecem a sobrevivência do protozoário. Portanto, quem tem anemia falciforme não adquire malária.
Então, como a mutação, nesse ambiente, trouxe uma vantagem para esses indivíduos, ela foi selecionada positivamente. Ou seja, os indivíduos com anemia falciforme sobrevivem mais tempo, se reproduzem e transmitem a mutação para as próximas gerações.
Por isso, a frequência do alelo que causa a HbS é bem alta no continente africano.
É só observar os dois mapas: a área de maior frequência do alelo está de acordo com as regiões endêmicas para a malária. Logo, podemos afirmar que esta mutação é na verdade um polimorfismo, já que a sua frequência nessa população é maior do que 1%.
POLIMORFISMOS DE SEQUÊNCIAS REPETIDAS IN TANDEM
Agora, já que relembramos o conceito de polimorfismo, vamos falar exclusivamente dos polimorfismos de sequências repetidas in tandem usadas na genética forense.
Quando falamos deste polimorfismo estamos nos referindo às regiões de minissatélites ou VNTRs (número variável de repetições in tandem) que estão dispersas no genoma humano, geralmente em regiões de DNA não codificante (íntrons).
Entretanto, para se fazer a análise desses VNTRs, é necessária uma quantidade específica de DNA. E, com a descoberta dos microssatélites, a amplificação dessas sequências tornou-se o método de primeira escolha, devido ao seu poder de discriminação.
Microssatélites são sequências de 2 a 8 nucleotídeos repetidas in tandem, chamadas de STR (Short Tandem Repeats).
2
CAGATACCGCTCGCGCT CGA CGA CACAGCCAT
4
CAGATACCGCTCGCGCT CGA CGA CGA CGA CACAGCCAT
5
CAGATACCGCTCGCGCT CGA CGA CGA CGA CGA CACAGCCAT
6
CAGATACCGCTCGCGCT CGA CGA CGA CGA CGA CGA CACAGCCAT
Perceba que a sequência destacada em vermelho acima (CGA) é de trinucleotídeos e repete-se de maneira diferente. Depois da amplificação do DNA, essas repetições são visualizadas em bandas de acordo com o número de repetições.
Veja na figura abaixo:
Bandas de tamanhos menores ficam embaixo (na representação do gel de eletroforese mostrado na figura) e as maiores ficam na parte de cima do gel.
O número de repetições para cada polimorfismo pode variar de indivíduo para indivíduo. Esta característica permite diferenciar indivíduos de uma determinada população, até mesmo entre irmãos. Em caso de gêmeos monozigóticos, ambos possuem a mesma informação para estes marcadores, salvo raras exceções em que ocorrem mutações.
Os STRs mais usados na Genética Forense são os tri, tetra e pentanucleotídeos, sendo os tetranucleotídeos (unidade de repetição com 4 nucleotídeos, por exemplo GATA). Calcula-se que no genoma humano existam 500.000 STRs, dos quais 6.000 a 10.000 são tri ou tetraméricos.
Por serem de tamanhos próximos, os STRs podem ser analisados todos ao mesmo tempo, ou seja, em uma única reação de PCR. Por isso, até mesmo em amostras muito degradadas se consegue amplificar essas sequências.
O FBI americano (Federal Bureau of Investigation) adota uma série-padrão de 13 locus de STRs, com sequências de 4 a 5 nucleotídeos, para análises em Genética Forense.
Além desses locus, é analisado o gene da amelogenina, responsável pelo desenvolvimento do dente no feto. Existe uma diferença relacionada à sequência desse gene nos cromossomos X e Y. Portanto, analisando a variação dessa sequência é possíveldeterminar o sexo do indivíduo que está sendo analisado.
Posições de marcadores STR em cromossomos humanos
Na figura acima, está representada a localização cromossômica de cada loco de STR analisado pelo FBI em análises forenses adotadas por laboratórios de vários países.
Cada STR se encontra em cromossomos diferentes ou em pontas extremas de um mesmo cromossomo. Dessa forma, sabe-se que eles serão herdados de maneira independente. Em cada loco, podem ser detectados vários alelos com diferentes números de sequências repetidas, gerando inúmeros genótipos possíveis.
AMPFLSTR® IDENTIFILER™ PCR AMPLIFICATION KIT PARA 15 STRS
AmpFℓSTR® Identifiler™
GS500-internal lane standard
Atualmente, esses locus são amplificados por kits comerciais. Existem diversos desses kits, como, por exemplo, o PowerPlex® sistemas ESX (16 STRs) e o ESI (os mesmos 16 STRs com adição do SE33).
São usados corantes fluorescentes para discriminar cada loco. Os fragmentos de tamanhos diferentes são separados por ordem de tamanho no gel de poliacrilamida e detectados por raio laser à medida que alcançam o final do gel.
Um computador acoplado ao aparelho de eletroforese produz a leitura do tamanho e cor do fragmento em separado gerando um gráfico.
Cada pico no gráfico representa um alelo e cada loco exibe um pico único (se o indivíduo for homozigoto) ou um par de picos (se o indivíduo for heterozigoto).
Veja a figura abaixo:
Quando se faz a análise por eletroforese capilar e, portanto, se obtém os picos para cada alelo de cada loco, é necessário se ter uma unidade de referência para se ter certeza dos alelos que aparecem no eletroferograma.
Para isso, se usa um Ladder ou marcador de peso molecular, também conhecido como escada alélica. Portanto, para cada um dos alelos analisados se tem um pico comparativo para que você possa ter certeza sobre os alelos de cada loco analisado.
Observe a figura a baixo:
Para a determinação do sexo são analisados os alelos para o gene da amelogenina. O comprimento da sequência de nucleotídeos desse gene varia entre os sexos.
No homem, o gene tem 112 pares de nucleotídeos (pb) e na mulher são 106 pb.
Existe uma pequena diferença no tamanho do pico. E como as mulheres tem 2 cromossomos X, aparece apenas um pico para indivíduos do sexo feminino.
No caso de indivíduos do sexo masculino aparecem dois picos:
· Um para o cromossomo X
· Outro para o cromossomo Y
Os locus de STR adotados pelo FBI foram extensivamente estudados em populações caucasoides, hispânica, afro-americana e asiática, e a frequência dos alelos varia significativamente de uma população para outra.
Depois de analisadas as amostras, existe um cálculo estatístico com base na frequência de cada alelo na população.
Dessa forma, se chega a um número que permite dizer que somente uma pessoa em cada 10 quatrilhões ou em cada 100 quatrilhões poderia apresentar os mesmos alelos para todos os 13 locus.
Por isso, a chance de uma pessoa de uma população qualquer ter os mesmos alelos que outra é quase zero. Assim, depois de todas as análises, não há dificuldade em se ter um resultado conclusivo.
MARCADOR DO TIPO INDEL
Recentemente, o estudo da identificação humana tem se direcionado ainda para o uso de SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único) que, por serem marcadores de inserção/deleção (indels) pode atuar como auxiliares na determinação correta de uma análise forense, a favor ou contra a relação assumida e, também, por permitirem a identificação de indivíduos, mesmo a partir de amostras altamente degradadas, comuns na criminalística.
Na figura abaixo, observe a representação de um marcador do tipo Indel (inserção/deleção):
Observe a primeira sequência de nucleotídeos mostrada na figura. Comparando com a segunda, observe que nesta houve perda de nucleotídeos. Por isso, deleção. Na terceira sequência, observe que houve adição de uma sequência TGTG (em vermelho). Por isso, inserção.
Em ambos os casos, a deleção ou a inserção, muda o tamanho dos alelos observados durante a análise, porque aumentou ou diminui o número de repetições. Esses marcadores, assim como os SNPs, são importantes em casos de análises de DNA extraído de amostras muito degradadas.
MARCADORES DE HERANÇA UNIPARENTAL
Quando a análise de STRs se torna difícil ou impossível devido à quantidade ou qualidade do DNA que foi recuperado, há também outra opção para se fazer o exame a partir do DNA mitocondrial (mtDNA).
Embora esteja longe de ser tão informativa como as análises STRs, o mtDNA pode fornecer informações úteis tanto no quesito investigativo quanto na confirmação da identidade.
Além do DNA nuclear, nós temos ainda outro DNA que fica no interior da mitocôndria, por isso chamado de DNA mitocondrial.
Trata-se de um DNA circular e apresenta uma região de interesse chamada D-loop que é altamente polimórfica e, portanto, usada para identificação humana na Genética Forense.
Além dessa região polimórfica, o DNA mitocondrial se torna importante para análises forenses devido à quantidade encontrada nas células. Uma única célula pode conter entre 200 e 1.700 mitocôndrias, ou seja, se tem múltiplas cópias desse DNA.
Por isso, mesmo em caso de amostras com mínimas quantidades de DNA e de esse estar tão degradado a ponto de não ser possível se fazer a análise do DNA nuclear, muitas vezes a identificação pode ser realizada com base na análise do DNA mitocondrial.
Por ser de origem materna, o DNA mitocondrial pode ser útil para o estabelecimento de linhagens familiares. Isso significa que os restos mortais de uma pessoa podem ser comparados com amostras da sua mãe ou avó materna, uma irmã, tios ou tias por parte de mãe ou mesmo com parentes mais distantes desde que pertençam à linhagem materna.
Na Argentina, durante a ditadura (período de 1976 e 1983), os filhos de muitas mulheres vítimas de represálias desapareceram.
As “Avós da Praça de Maio” começaram, então, uma busca por seus netos. A identificação de muitos deles só foi possível pela análise do DNA mitocondrial. As sequências desse DNA foram então comparadas com as sequências das avós, já que estas passaram esse DNA para as filhas e estas passaram para os seus netos.
Foi desenvolvido, assim, o sequenciamento do DNA mitocondrial para as avós que até hoje é usado para a identificação dos possíveis netos.
MARCADORES DO CROMOSSOMO Y – STRS DE Y
É possível analisar um painel de STRs localizado no cromossomo Y para fazer a vinculação dos restos da pessoa falecida com seus parentes homens.
Este método pode ser útil quando não há parentes próximos disponíveis para a comparação.
Qualquer pessoa da linhagem paterna pode ser usada para a vinculação: irmãos, tios e primos homens do lado paterno.
PowerPlex® Y
ILS-600
Existem kits comerciais para a análise dos STRs de Y (veja figura acima).
Como os STRs de Y são exclusivos de indivíduos do sexo masculino, eles só exibem um alelo para qualquer STR. Portanto, a presença de mais de um alelo para cada STR do Y indica que DNA de mais de um indivíduo do sexo masculino está presente na amostra.
Assim, pode-se confirmar, por exemplo, casos de estupro coletivo.
Padrão de hereditariedade
	CODIS STR Loci
	Marcadores
	
	
	
	Autossômico
(Passado para todos os herdeiros)
	Cromossomo Y
(Passado para os filhos do sexo masculino)
	Cromossomo X
(Herdado da linhagem materna)
Observando o padrão de hereditariedade acima, veja que:
Os marcadores de STR autossômicos são herdados do pai e da mãe.
Já os marcadores de DNA mitocondrial são herdados apenas da mãe (é transmitido tanto para filhos quanto para filhas). E os STRs de Y são herdados pelo filho (sexo masculino) do seu respectivo pai.
AULA 7 - REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR) E ELETROFORESE CAPILAR – PARTE I
REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) possibilita a multiplicação (amplificação) de pedaços (fragmentos) específicos DNA, usando uma enzima específica denominada DNA polimerase, a mesma que participa da duplicação do material genético (DNA) nas células.
O desenvolvimento